Moleculaire klonering

Moleculaire klonering is een reeks technieken die worden gebruikt om recombinant DNA uit een prokaryote of eukaryote bron in een replicerend voertuig te plaatsen, zoals plasmiden of virale vectoren. Kloneren verwijst naar het maken van talloze kopieën van een DNA-fragment van belang, zoals een gen. In deze video leert u over de verschillende stappen van moleculaire klonering, hoe u de procedure opzet en de verschillende toepassingen van deze techniek.

Voordat het kloneren begint, zijn er ten minste twee belangrijke DNA-moleculen nodig. Ten eerste, en het belangrijkste, heb je het DNA-fragment dat je gaat kloneren nodig, ook wel het insert genoemd. Dit kan afkomstig zijn van een prokaryoot, eukaryoot, een uitgestorven organisme, of het kan kunstmatig in het laboratorium worden gecreëerd. Door middel van moleculaire klonering kunnen we meer leren over de functie van een specifiek gen.

Ten tweede heb je een vector nodig. Een vector is plasmiden-DNA dat in de moleculaire biologie als instrument wordt gebruikt om kopieën van een bepaald gen te maken of om een eiwit uit dat gen te produceren. Plasmiden zijn een voorbeeld van een vector en zijn circulair, extrachromosomaal DNA dat door bacteriën wordt gerepliceerd.

Een plasmide heeft doorgaans een multiple cloning site of MCS; dit gebied bevat herkenningsplaatsen voor verschillende restrictie-endonucleasen, ook wel restrictie-enzymen genoemd. Verschillende inserts kunnen in het plasmide worden ingevoegd via een techniek genaamd ligatie. De plasmidevector bevat ook een replicatie-oorsprong (origin of replication), waardoor deze in bacteriën kan worden gerepliceerd. Daarnaast heeft het plasmide een antibioticaresistentiegen. Als bacteriën het plasmide opnemen, overleven ze in media die het antibioticum bevatten. Dit maakt de selectie van bacteriën die succesvol zijn getransformeerd mogelijk.

Het insert en de vector worden gekloneerd in een gastcelorganisme; de meest gebruikte in moleculaire klonering is E. coli. E. coli groeit snel, is breed beschikbaar en er zijn talrijke verschillende commercieel geproduceerde kloningsvectoren beschikbaar. Eukaryoten, zoals gist, kunnen ook als gastorganismen voor vectoren worden gebruikt.

De eerste stap van de algemene moleculaire kloneringsprocedure is het verkrijgen van het gewenste insert, dat kan worden afgeleid van DNA of mRNA van elk celtype. De optimale vector en het bijbehorende gastorganisme worden vervolgens gekozen op basis van het type insert en wat er uiteindelijk mee moet gebeuren. Een polymerasekettingreactie, of PCR-gebaseerde methode, wordt vaak gebruikt om het insert te repliceren.

Vervolgens worden, door middel van een reeks enzymatische reacties, het insert en het digest samengevoegd en geïntroduceerd in het gastorganisme voor massareplicatie. Gerepliceerde vectoren worden uit de bacteriën gezuiverd en na restrictiedigestie geanalyseerd op een gel. Gel-gezuiverde fragmenten worden later ter sequencing opgestuurd om te verifiëren dat het insert het gewenste DNA-fragment is.

Laten we iets gedetailleerder kijken naar hoe moleculaire klonering wordt uitgevoerd. Voordat u begint, is het raadzaam om uw kloneringsstrategie uit te stippelen voordat u enige kloneringspoging aan de bench doet. Bijvoorbeeld, elke gegeven plasmidevector biedt u een beperkt aantal restrictieplaatsen om het insert via de multiple cloning site in te bouwen. U moet restrictieplaatsen kiezen die niet in uw insert voorkomen, zodat u dit niet opensnijdt. U kunt in een situatie terechtkomen waarin u gedwongen wordt een blunt-end fragment te koppelen aan een fragment met een overhang. In dat geval kan het gebruik van het Klenow-fragment om een blunt-end ligatie op te zetten uw enige optie zijn om het insert in de gewenste vector te krijgen. Het begrijpen van de verschillende beschikbare moleculaire kloneringsinstrumenten, samen met het bedenken van een zorgvuldige strategie voordat u begint met kloneren, kan een enorme tijdbesparing opleveren.

De DNA-bron voor moleculaire klonering kan uit bijna elk type cel- of weefselmonster worden geïsoleerd via eenvoudige extractietechnieken. Eenmaal geïsoleerd, kan PCR worden gebruikt om het insert te amplificeren.

Zodra het insert is geamplificeerd, worden zowel het insert als de vector verteerd door restrictie-enzymen, ook wel restrictie-endonucleases genoemd.

Na de digestie kunnen het insert en de vector op een gel worden geladen en worden gezuiverd via een proces genaamd gelzuivering. Met betrekking tot de vector helpt deze stap om gelineariseerd plasmide te zuiveren van niet-geknipt plasmide, dat op een gel vaak verschijnt als een smear met een hoog molecuulgewicht.

Na het gelzuiveren van de digesten wordt het insert geligeerd of gekoppeld aan het plasmide via een enzym genaamd DNA-ligase.

Over het algemeen is het altijd raadzaam om ligaties zo op te zetten dat de verhouding tussen insert en vector 3 op 1 is, wat ervoor zorgt dat slechts een kleine hoeveelheid vector zal self-ligateren. Zodra de ligatie op ijs is voorbereid, wordt deze geïncubeerd bij een temperatuur tussen 14-25˚C gedurende 1 uur tot een nacht.

Vervolgens wordt transformatie uitgevoerd om de plasmidevector te introduceren in de gastheer die deze zal repliceren.

Na transformatie worden bacteriën uitgeplaat op agarplaten met antibiotica en een nacht geïncubeerd bij 37°C. Omdat het plasmide een antibioticaresistentiegen bevat, zal een succesvolle transformatie leiden tot bacteriële kolonies wanneer deze groeien op agarplaten in aanwezigheid van antibiotica. Individuele kolonies kunnen vervolgens van de getransformeerde plaat worden gepikt, in genummerde buisjes met vloeibaar groeimedium worden geplaatst en in een schudincubator worden gezet voor expansie. Een klein volume van de vloeibare cultuur wordt aan een genummerde agarplaat toegevoegd, terwijl de rest van de cultuur wordt gebruikt voor plasmidezuivering. Het nummeringsschema dat de identiteit van de bacteriële kolonies aanduidt waarvan de plasmiden uiteindelijk worden gezuiverd, wordt gedurende het hele plasmidezuiveringsproces gehandhaafd.

Een monster van het gezuiverde plasmide wordt vervolgens geknipt met restrictie-enzymen. De digest wordt daarna op de gel geladen en gerund om de aanwezigheid van het insert te controleren, wat bevestigt dat de bacteriële kolonie is getransformeerd met een plasmide dat een insert bevat en niet met een self-geligeerd plasmide. Bacteriën waarvan is bevestigd dat ze zijn getransformeerd met een plasmide met insert, worden verder uitgebreid voor aanvullende plasmidezuivering. Sequenering wordt uitgevoerd als laatste verificatiestap om te bevestigen dat uw gen van interesse is gekloneerd.

Moleculaire klonering kan worden gebruikt voor een vrijwel onbeperkt aantal toepassingen. Wanneer bijvoorbeeld een mRNA-template wordt omgezet in cDNA, of complementair DNA, door een enzym genaamd reverse transcriptase en vervolgens PCR wordt gebruikt om het cDNA te amplifieren, kan moleculaire klonering worden ingezet om een cDNA-bibliotheek te maken – een bibliotheek van alle genen die worden tot expressie gebracht door een bepaald celtype.

Moleculaire klonering kan ook worden gebruikt om een reeks genen, of een gencluster, uit één bacteriële stam te halen en deze te reorganiseren in plasmiden die worden getransformeerd in een andere stam, zodat een volledig biosynthetisch pad kan worden gereconstrueerd om een complex molecuul te produceren.

Via moleculaire klonering kan een mutantenbibliotheek worden gegenereerd door een doelplasmide tot expressie te brengen in een speciale bacteriële stam die een foutgevoelige polymerase gebruikt wanneer deze bij bepaalde temperaturen wordt gekweekt. De mutaties kunnen worden gekarakteriseerd door sequencing. Bacteriën die zijn getransformeerd met mutante genen kunnen vervolgens worden getest met verschillende geneesmiddelen of chemicaliën om te zien welke bacteriële kolonies zijn geëvolueerd om drugresistentie te vertonen.

Dankzij moleculaire klonering kunnen reportergenen in DNA-plasmiden worden ingebouwd; een veelgebruikt reportergen is het groen fluorescerende proteïne of GFP, dat een groene fluorescentie uitzendt bij blootstelling aan UV-licht. Een reportergen kan ook worden ingevoegd in een alphavirus om infectie in muggen en overdraagbaarheid in cellen aan te tonen.

U heeft zojuist de video van JoVE over moleculaire klonering bekeken. U begrijpt nu hoe moleculaire klonering werkt en hoe deze techniek kan worden toegepast in de moleculaire biologie. Zoals altijd, bedankt voor het kijken!