Enterische Bacteriële invasie van darmepitheelcellen

Het algemene doel van het volgende experiment is om het model van de verticale diffusiekamer of VDC te gebruiken om bacteriële interacties bij een invasie van intestinale epitheelcellen te onderzoeken. Dit wordt eerst bereikt door een speciaal filter te gebruiken voorzien van een gepolariseerde monoclaag van Caco-2 intestinale epitheelcellen om afzonderlijke apicale en basolaterale compartimenten in de VDC te creëren. In de tweede stap wordt het bacteriële inoculum van belang toegevoegd aan het apicale compartiment.

Onder micro-aerobe omstandigheden en celkweek wordt medium onder aerobe omstandigheden toegevoegd aan het basolaterale compartiment; op de gewenste tijdstippen tijdens de co-cultuur wordt vervolgens het filter verwijderd en worden de aantallen interagerende of intracellulaire bacteriën geteld. Uiteindelijk kan met het VDC-model een toename van het aantal interagerende en intracellulaire bacteriën worden waargenomen in vergelijking met standaard aerobe kweekomstandigheden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de standaard adhesie- en invasie-assays voor weefselkweek, is dat de co-cultuur van bacteriën en intestinale epitheelcellen met deze techniek wordt uitgevoerd onder in vitro omstandigheden die de in vivo omstandigheden van de menselijke darm nauwer benaderen.

De procedure wordt gedemonstreerd door N Vida nas, een promovendus uit mijn laboratorium, en Dominic Mills, een postdoc die het model voor de verticale diffusiekamer heeft ontwikkeld als onderdeel van zijn PhD in mijn laboratorium. Begin met het zaaien van 4 × 10⁵ Caco-2 darmepitheelcellen per 0,4 micron filter in cultuurmedium, laat de cellen vervolgens 21 dagen groeien tot polarisatie, waarbij het medium elke twee tot drie dagen wordt ververst om de polarisatiestatus van de monocultuur te bevestigen. Gebruik een volt-ohm-weerstandsmeter om de transepitheliale elektrische weerstand te meten.

Incubeer jejuni 24 uur voor aanvang van de VDC-cocultuurassay op een verse bloedagarplaat onder micro-aerobe omstandigheden in een incubator met variabele atmosfeer. Pre-incubeer tegelijkertijd 30 milliliter Bruce-bouillon onder dezelfde omstandigheden. Dompel op de dag van het experiment de VDC-halfkamers, alsook de O-ringen en doppen, onder in een sterilisatieoplossing. Gebruik vervolgens een steriele spuit van 20 milliliter om de oplossing door de gasinlaatsopeningen van beide halfkamers te spoelen. Spoel na een uur de VDC-componenten af met vers steriel water met behulp van een andere steriele spuit van 20 milliliter om de gasinlaatsopeningen te spoelen.

Oogst vervolgens de helft van de CJ jui bloedagarplaatcultuur in één milliliter van het vooraf geïncubeerde barella-bouillon om ongeveer 10^10 CFU per milliliter te verkrijgen. Meet de optische dichtheid van de bacteriële suspensie bij 600 nanometer om de bacteriële colony forming units of CFU's semi-kwantitatief te bepalen, en pas vervolgens de bacteriële suspensie aan tot het gewenste inoculumgehalte in totaal vier milliliter van de vooraf geïncubeerde Bruce-bouillon. Voer een seriële verdunning uit vanuit deze uiteindelijke bacteriële suspensie, plaat vervolgens de juiste verdunning in triplikaat op bloedagarplaten en incubeer de platen 48 uur in de incubator met regelbare atmosfeer.

Plaats nu de onderste helft van de VDC-kamer plat op de bench en breng een O-ring aan. Verwijder vervolgens één filter met de intestinale epitheelcellen van de drager en was dit drie keer met 400 µL steriele PBS. Plaats het filter op de onderste helft van de kamer, waarbij u erop let dat de O-ring op zijn plaats blijft, en laat vervolgens voorzichtig de bovenste helft van de kamer op zijn plaats zakken.

Zodra de twee halve kamers zijn geassembleerd, worden ze met de ringklemmen aan elkaar geklemd en wordt de VDC horizontaal op de werkbank geplaatst met de twee openingen naar boven gericht. Voeg het bacteriële inoculum toe aan de apicale halve kamer en voeg vervolgens vier milliliter celkweekmedium toe aan de basale laterale halve kamer. Plaats de eindstukken in de openingen van beide halve kamers en plaats de VDC vervolgens in de incubator met variabele atmosfeer.

Open de gasregelaar die is aangesloten op het gasverdeelstuk in de directe nabijheid van het verdeelstuk. Sluit de slang van het verdeelstuk aan op de gasinlaat van de basale laterale halfkamer van de VDC en sluit vervolgens de gasuitlaatpijp die uit de incubator met variabele atmosfeer leidt aan op een van de uitlaten in het eindstuk van de basale laterale halfkamer. Sluit de andere uitlaat in het eindstuk van de basale laterale halfkamer af.

Open vervolgens de gasstroom op het gasverdeelstuk zeer langzaam om overmatige gasdruk te voorkomen en om na de juiste co-cultuurperiode een gasstroom van één belletje om de twee tot vijf seconden te bereiken. Sluit de gasregelaar die aan het gasverdeelstuk is verbonden. Laat daarna de gasstroom in de VDC bij het verdeelstuk ontsnappen en koppel de gasinlaat, de gasuitlaat en de stop uit de VDC.

Verwijder vervolgens de VDC uit de incubator met regelbare atmosfeer. Verwijder daarna de apicale en basale laterale supernatanten en bewaar deze bij -80 °C voor latere analyse. Verwijder de ringklemmen en demonteer voorzichtig de VDC.

Verwijder het filter uit de halve kamer en breng het over naar een steriele zeswells celkweekplaat. Was vervolgens de VDC met steriel water en bewaar deze voor de volgende experimentele ronde voor de enumeratie van het totale aantal interagerende bacteriën. Was de darmepitheelcellen drie keer met 400 µL steriele PBS en lyseer deze vervolgens in 400 µL steriele PBS met Triton X 100 gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur; voer een seriële verdunning uit van het cellysaat, gevolgd door het uitplaten van de juiste verdunningen in triplikaat op bloedagarplaten.

Incubeer de platen vervolgens 48 uur bij 37 °C in de variabele atmosfeer-incubator om het totaal aantal invaderende bacteriën te tellen. Incubeer de darmepitheelcellen gedurende twee uur in een standaard weefselkweekincubator met 400 µL celkweekmedium dat 150 µg/mL Gentamycine bevat om de extracellulaire bacteriën te doden. Kwantificeer vervolgens de colony forming units na cellyse, seriële verdunning en cultivering, zoals zojuist gedemonstreerd.

De volgende gegevens illustreren een vergelijking tussen het aantal CJ jui dat interageert met of Caco 2-cellen binnendringt na drie, zes of 24 uur co-cultuur onder standaard celluureassay-condities versus het gebruik van het VDC-model. Na 24 uur co-cultuur kunnen er bijvoorbeeld minder dan 10⁷ CFU van CJ jui worden waargenomen die interageren met Caco 2-cellen onder standaard celluurecondities. Echter, na 24 uur co-cultuur in het VDC-model kunnen ongeveer 10⁸ CFU van CJ jui worden waargenomen die interageren met Caco 2-cellen, wat een bijna tienvoudige toename in CJ jui IEC-interacties is.

Wanneer het aantal binnendringende CJ jui onder standaard kweekcondities wordt vergeleken met VDC-kweekcondities, kunnen na 24 uur onder standaard celkweekcondities ongeveer 10⁵ intracellulaire CFU's van CGE jui worden geïsoleerd uit de CACO two-cellen. Daarentegen kunnen na 24 uur co-kweek in het VDC-model ongeveer 10⁷ intracellulaire CFU's uit de CACO two-cellen worden geïsoleerd, wat een toename van de intracellulaire CGE van bijna 100-voudig betekent. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de gasstroom in de basolaterale kamer na de ontwikkeling ervan te bewaken.

Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van abuc-pathogenese om zowel de genetische basis van de bacteriële interactie met intestinale epitheelcellen als de aangeboren immuunrespons van de gastheer op bacteriële infectie te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het model van de verticale diffusiekamer kunt gebruiken om de interacties van andere enterische bacteriën met intestinale epitheelcellen te bestuderen en de omstandigheden die de menselijke darm nauwer benaderen.