Isolatie van microvasculaire endotheelcellen Buizen van Mouse Resistance Arteries

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van endotheelcelbuizen uit de arteria epigastrica superior van de muis (SEA) om de intra- en intercellulaire signaleringsdynamiek van een inheems, intact microvasculair endotheel te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst de SEA te isoleren uit de skeletspierwand van de buikholte van de muis. In de tweede stap wordt het vat voorzichtig en somatisch verteerd en vervolgens zorgvuldig behandeld met TAT om de gladde spiercellen en de adventitia van de endotheelcelbuis te dissociëren.

In de laatste stap wordt de buis vastgezet in een stroomkamer en gesuparfuseerd met een fysiologische zoutoplossing. Uiteindelijk kan confocale beeldvorming worden gebruikt om calciumsignalering in de oorspronkelijke intacte microvasculaire endotheelbuis te visualiseren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het kweken van endotheelcellen, is dat de endotheelcellen die de buis vormen hun oorspronkelijke morfologie, eiwitexpressie en responsiviteit behouden. Het endotheel is essentieel voor de regulering van de bloedstroom in het hele lichaam.

De toepassing van deze techniek stelt ons in staat om de cel-tot-cel signaleringsgebeurtenissen die de bloedstroomregeling bemiddelen te onderzoeken, en hoe deze in de war kunnen raken bij vasculaire dysfunctie. Om de SEA eerst te isoleren, wordt er een kleine incisie door de huid gemaakt net boven het gebied van de schaamstreek van een geanestheseerde muis; breid de incisie lateraal in elke richting uit naar de respectievelijke achterpoten en zet de incisie vervolgens voort langs de ventrale middenlijn tot aan de bovenkant van de ribbenkast, waarbij de incisie verder lateraal in elke richting wordt uitgebreid naar de respectievelijke vier ledematen. Til nu voorzichtig de huid op en doorsnij het bindweefsel dat de huid aan de onderliggende spieren hecht, om zo het gehele oppervlak van de abdominale musculatuur bloot te leggen.

Spoel de blootgestelde spier door met een zoutoplossing op kamertemperatuur. Til vervolgens onder een stereomicroscoop het vetkussentje op dat zich aan de onderkant van het sternum bevindt. Maak een incisie door het vetkussentje en langs de onderste rib.

De SEA zou nu zichtbaar moeten zijn. Zorg ervoor dat de arterie niet beschadigd raakt en irrigeer het blootgestelde weefsel met meer fysiologische zoutoplossing op kamertemperatuur. Nadat de bovenste laag skeletspier is teruggetrokken, dient de lengte van de SEA te worden genoteerd en vervolgens moet de dunne spierlaag onder de arterie zorgvuldig worden weggesneden. Gebruik vervolgens een gebogen pincet om een stuk 6-0 zijden hechtdraad onder de SCA door te voeren.

Ligeer vervolgens de arterie en de aangrenzende vene om de druk te handhaven en het bloed binnen het lumen van het vat te houden. Nadat de SCA aan de contralaterale zijde is geligeerd, wordt er een incisie gemaakt langs de middellijn van de buikspieren om de respectievelijke zijden te scheiden, waarna de incisie in beide richtingen lateraal wordt uitgebreid, zoals bij de huid is gedaan. Zet de incisie verticaal voort langs de buitenrand om de buikspier volledig van het lichaam te scheiden.

Snijd vervolgens de SEA boven de ligatie door om de afsluiting te behouden en plaats de geïsoleerde spier en arterie in een bekerglas van 50 milliliter met 10 milliliter dissectiebuffer van vier graden Celsius. Nadat de spier van de andere zijde van het abdomen is geïsoleerd, worden de weefsels gedurende 10 minuten geïncubeerd in dissectiebuffer. Plaats nu de abdominale spier met de SEA in een Petri schaal van vier graden Celsius, gecoat met een laag cyl guard en gevuld met dissectiebuffer. Gebruik insectenspelden van 0,15 millimeter om de SEA en spier uit te rekken tot hun eerder genoteerde benaderde in vivo lengten.

Bevestig de SEA aan de cilinderbeschermer en oriënteer de spier zodanig dat de dunne laag die naar het peritoneum is gericht, bovenop ligt. Maak vervolgens, beginnend vanaf de stroomopwaartse ligatieplaats in de richting van het stroomafwaartse uiteinde, ongeveer één tot twee centimeter van de SEA vrij van de bijbehorende vene en het omringende weefsel tot aan de eerste grote vertakkingsplaats. Snijd de SEA net boven de vertakkingsplaats en net onder de ligatie door.

Gebruik vervolgens een stuk elastische slang om het achterste uiteinde van een pipet te verbinden met een spuit van vijf milliliter die ijskoud dissectiebuffer bevat. Bevestig de tip van de canulatiepipet in de dissectiekamer en canuleer de SEA. Zodra alle erytrocyten zijn weggespoeld, wordt de SEA uit de canulatiepipet verwijderd en wordt de pipet uit de dissectieschaal gehaald om de endotheelbuizen te isoleren.

Vul eerst een glazen cultuurbuis van 12 bij 75 millimeter voor de helft met ijskoud dissectiebuffer. Snijd vervolgens de SEA in stukjes van één tot drie millimeter en breng deze arteriële stukjes met een schuine pincet over naar de cultuurbuis; plaats de buis vervolgens op ijs. Combineer daarna de digestie-enzymen met de dissociatiebuffer tot een eindvolume van 1 ml in een aparte cultuurbuis van 12 bij 75 millimeter en verwarm de enzymoplossing voor tot 37 °C met een heating block.

Haal de kweekbuis met de arteriële fragmenten uit de koelkast (4 °C) en plaats deze bij kamertemperatuur om op te warmen, terwijl de enzymoplossing wordt verwarmd tot 37 °C. Aspireer voorzichtig de dissectiebuffer op kamertemperatuur uit de kweekbuis, waarbij een klein volume rond de vaatsegmenten behouden blijft. Voeg nu langzaam dissociatiebuffer zonder enzymen op kamertemperatuur toe aan de vaatsegmenten, zodanig dat de arteriële fragmenten op de bodem van de kweekbuis blijven liggen, om alle resterende dissectiebuffer weg te wassen.

Zodra de enzymoplossing 37 °C heeft bereikt, wordt de dissociatiebuffer opnieuw uit de cultuubuis met de vatsegmenten weggezogen, waarbij een klein volume met de vatsegmenten achterblijft. Breng vervolgens de enzymoplossing van 37 °C over in de cultuubuis en incubeer de cultuubuis 30 minuten bij 37 °C in het warmteblok. Bereid tijdens de incubatie een literatiepipet voor die is gevuld met minerale olie; kerf de pipet in, maak een schone breuk, breek de pipet met een vlam, polijst de tip van de pipet en bevestig deze op een microspuit die is gemonteerd in een micromanipulator.

Trek vervolgens de zuiger van de microspuit terug om de pipet te vullen met twee nanoliters dissociatiebuffer en positioneer de pipetpunt boven de flowkamer aan het einde van de incubatie. Nadat de buffer zorgvuldig is opgezogen zoals zojuist gedemonstreerd, worden de arteriële segmenten gewassen met vier milliliters dissociatiebuffer op kamertemperatuur. Zuig vervolgens voorzichtig één vaatsegment op met een micropipet van één milliliter en plaats het vat in een flowkamer met één milliliter van de dissociatiebuffer.

Plaats de punt van de tation-pipet nabij één uiteinde van het vatsegment en aspireer het vatsegment vervolgens in de tating-pipet met een snelheid van ongeveer 225 nanoliters per seconde, om mechanische belasting van de endotheelcellen te voorkomen;stoot het vat daarna terug in de kamer. Als de digestie succesvol was, zullen de gladde spiercellen en de adventitia zijn gedissocieerd van de endotheelbuis. Verwijder de adventitia zo snel mogelijk van de endotheelbuis om te voorkomen dat deze in de buis verstrikt raakt, en herhaal vervolgens de tation zoals zojuist gedemonstreerd, totdat alle gladde spiercellen gedissocieerd zijn.

Na de laatste herhaling plaatst u de geïsoleerde endotheliale buis in het midden van de flowkamer, uitgelijnd in de stroomrichting, en verwijdert u de triggerpipet. Bevestig de fixeringspipetten in micromanipulatoren die aan beide uiteinden van de flowkamer zijn gemonteerd en positioneer hun tips aan de respectievelijke uiteinden van de endotheliale buis. Laat de fixeringspipetten één voor één over de tegenovergestelde uiteinden van de buis zakken, waarbij u de buis tegen de bodem van de kamer drukt, op ongeveer 50 micrometers van elk uiteinde van de buis.

Zodra de fixatiepipet de buis raakt, trekt u deze langzaam terug langs de as van de buis, tot de approximate in vivo lengte is bereikt. Druk de pipet tegen de bodem van de kamer om de buis te fixeren, en start vervolgens de stroom van de superfusie-oplossing met een peristaltische pomp om een constante stroom van de superfusie-oplossing over de endotheliale buis te handhaven. In deze differentieel contrast-afbeelding wordt een geïsoleerde endotheliale celbuis uit een SEA getoond na een superfusie van één uur met superfusiebuffer bij 3 mL per minuut op kamertemperatuur.

Deze film demonstreert de calciumresponsen van een met fluo-4 geladen endotheelcelbuis in reactie op stimulatie met 1 µM acetylcholine. Deze representatieve fluorescentiebeelden zijn verzameld op verschillende tijdstippen na stimulatie van de endotheelbuis met acetylcholine. Let op hoe het intracellulaire calcium in de loop van de tijd oscilleert.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om er rekening mee te houden dat mechanische beschadiging van de endotheliale buis tijdens het positioneren en vastzetten met pinnen moet worden vermeden, aangezien endotheliale cellen uiterst fragiel zijn en gemakkelijk beschadigd raken. Na het bekijken van deze video heeft u een goed beeld van hoe u endotheliale buizen uit de arteria epigastrica superior van de muis kunt isoleren, om zo het in situ intacte microvasculaire endotheel te bestuderen.