Protocollen voor implementatie van een Escherichia coli Op basis TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology
16 september 2013
Deze vijfdaagse protocol beschrijft alle stappen, apparatuur en aanvullende software voor het maken en uitvoeren van een efficiënte endogene Escherichia coli op basis TX-TL-cel-vrije expressie systeem vanaf nul. Met reagentia, het protocol duurt 8 uur of minder voor het inrichten van een reactie, verzamelen en verwerken van gegevens.
Het algemene doel van deze procedure is om een e coli-gebaseerd celvrij expressiesysteem te creëren, dat bekend staat als transcriptie-translatie of TX tl. Dit wordt bereikt door eerst drie initiële componenten te maken voor TX TL ruwe celextract, aminozuuroplossing en energieoplossing. De aminozuuroplossing en energieoplossing worden later gecombineerd om de TX TL-buffer te maken.
De tweede stap is om het ruwe celextract te kalibreren om de optimale magnesium-, kalium- en DTT-concentraties te bepalen voor TX TL-reacties met maximale expressieniveaus. Vervolgens worden de kalibratieresultaten gebruikt om een TX TL-systeem van drie buisjes te maken, bestaande uit buffer, ruw celextract en DNA. De laatste stap is om een TX TL-reactie uit te voeren met behulp van de zojuist gemaakte reagentia.
Uiteindelijk wordt TX TL gebruikt om synthetische biologiecircuits en traditionele celvrije expressietoepassingen te demonstreren. Deze methode kan helpen bij het testen van circuits in het veld van synthetische biologie door een in vitro-gelijkwaardige omgeving te bieden, die de in vivo-omgeving nabootst. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar het verhogen van de snelheid van synthetisch biologisch ontwerp door het wegnemen van de noodzaak om alle prototype-stappen in vivo uit te voeren.
Claire Hayes, een onderzoeksassistent in onze groep, zal de procedure bijstaan. Houd er rekening mee dat deze video alleen selectieve secties van het protocol zal doorlopen die cruciaal zijn voor het filmen. Het volledige protocol is beschikbaar met het tekstartikel.
Eerder in dit protocol werden bacteriecellen gekweekt en gepelleteerd. Nu zullen de bacteriecellen worden gelyseerd met behulp van een bead beater. Houd alle 50 milliliter falconbuisjes met celsuspensie op ijs.
Voor de doeleinden van deze video zal bead beading worden gedemonstreerd voor slechts één buisje. De kralen moeten intermitterend in drie porties aan de Falcon-buis worden toegevoegd, elk met één derde van de totale hoeveelheid kralen. Voeg de eerste portie kralen toe aan de buis, vortex gedurende 30 seconden en plaats op ijs.
Op dezelfde manier, voeg de tweede portie kralen toe, vortex en plaats op ijs. Zorg ervoor dat de kralen na het toevoegen van de laatste portie en het vortexen gelijkmatig verdeeld zijn, er moet een dikke pasta worden gevormd na de derde vortexstap. Plaats de buis op ijs.
Bereid een pipettip van vijf milliliter volume voor door een steriel paar schaar te gebruiken om het uiteinde af te knippen. Draai de pipet naar twee milliliter om een opening van drie tot vier millimeter te creëren. Plaats 20 steriele bead beading-buisjes op ijs.
Gebruik de aangepaste pipet om de hoge viscositeit van de bead cell-oplossing te verifiëren. Het zou viskeus moeten zijn tot het punt dat het nauwelijks uit de pipettip komt. Tijdens het uitwerpen, verwijder de bead cell-oplossing uit de Falcon-buis en breng het over in een bead beading-buisje.
Vul het drie kwart vol en draai kort in een minicentrifuge. Om luchtbellen te verwijderen zonder de kralen opnieuw te verdelen, werk de toevoeging van bead cell-oplossing af aan de buis om een concaaf meniscus te vormen. Voeg vervolgens een zeer kleine druppel bead cell-oplossing toe aan de binnenkant van een bead beading-buisjedophevel.
Wees voorzichtig om geen oplossing in de buitenlip van de dop te doen. Anders zal de bead beading-buis niet voldoende gesloten zijn. Tik de dop op een vlakke ondergrond en controleer of er geen luchtbellen op de bodem van de dop zitten.
Dek de bead beating-buis af. Als het goed is gedaan, zou de dop goed gesloten moeten zijn. Er mogen geen luchtbellen zichtbaar zijn en er mag weinig of geen bead cell-oplossing overstromen vanaf hier, twee personen zijn vereist om het bead beading efficiënt te voltooien.
Geef de gevulde buis door aan een assistent voor bead beading terwijl de eerste demonstrant doorgaat met het vullen van meer bead beading-buisjes met de resterende bead cell-oplossing. Neem de gevulde bead beading-buis en plaats deze op ijs. Zodra er twee gevulde bead beading-buisjes zijn verzameld en minstens een minuut op ijs hebben gestaan.
Begin met bead beading, beade een buis gedurende 30 seconden bij 46 RPM. Plaats de buis ondersteboven op ijs gedurende 30 seconden terwijl de andere buis wordt beade. Herhaal het bead beading en ijs zodat elke gevulde bead beading-buis in totaal een minuut wordt beade.
Zodra alle gevulde bead beading-buisjes zijn verwerkt, bouw een filterapparaat van een 15 milliliter falconbuis. Voeg eerst een nieuwe bead beading-dop met de platte kant naar boven toe aan de bodem van de buis toe. Verwijder vervolgens de dop van een verwerkt bead beading-buisje en druk een microchromatografiekolom stevig op het uiteinde van het verwerkte bead beading-buisje tot het volledig is afgedicht.
Snij het elucian-uiteinde van de microchromatografiekolom af en plaats het elucian. Einde naar beneden in een lege bead beading-buis. Plaats dit complex in de 15 milliliter falconbuis.
Bouw de filterapparaten voor alle gevulde bead beating-buisjes en bewaar ze op ijs. Wanneer klaar, centrifugeer de filterapparaten Falcon-buis zonder dop met 6.000 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius om extract en pellet van de kralen te scheiden. Controleer na de centrifugatie of elk bead beading-buisje een levensvatbaar extract heeft geproduceerd.
Goed beade extract zal niet troebel zijn en de pellet zal twee duidelijke lagen hebben, zoals geïllustreerd door de buis aan de linkerkant. Troebele buisjes, zoals getoond in het voorbeeld aan de rechterkant, moeten worden weggegooid. Breng het supernatant van niet-troebele buisjes over in afzonderlijke 1,75 milliliter microcentrifugebuisjes, waarbij zo min mogelijk pellet wordt meegenomen.
Bewaar op ijs totdat alle bead beading-buisjes zijn verwerkt. Draai vervolgens de microcentrifugebuisjes neer en verzamel het supernatant. Nadat 500 microliter pelletvrij supernatant is geconsolideerd in een nieuwe bead beading
Overzicht
Dit protocol beschrijft in detail de creatie en werking van een celvrij expressiesysteem op basis van Escherichia coli, bekend als TX-TL. Het proces omvat het voorbereiden van essentiële componenten, het kalibreren van extracten en het uitvoeren van TX-TL-reacties om toepassingen in de synthetische biologie te faciliteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Synthetische Biologie
- Celvrije Systemen
- Transcriptie en Translatie
Achtergrond
- TX-TL-systemen maken in vitro eiwitsynthese mogelijk.
- Deze methode vereenvoudigt het testen van synthetische biologiecircuits.
- Celvrije systemen maken in vivo prototyping overbodig.
- Produceert efficiënt eiwitten voor onderzoek en toepassingen.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar TX-TL celvrij expressiesysteem op te zetten.
- Om de condities voor maximale eiwitexpressie te optimaliseren.
- Om het nut van TX-TL in de synthetische biologie aan te tonen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van het ruwe celextract, aminozuuroplossingen en energie-oplossingen.
- Kalibratie van het extract voor optimale reactieomstandigheden.
- Uitvoering van TX-TL-reacties met behulp van de bereide componenten.
- Gebruik van bead beating voor cellyse en de bereiding van het extract.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van levensvatbare TX-TL-extracten.
- Vaststelling van optimale omstandigheden voor eiwitsynthese.
- Demonstratie van de effectiviteit van het systeem in de synthetische biologie.
- Creatie van een reproduceerbaar protocol voor toekomstige studies.
Conclusies
- Het TX-TL-systeem is een krachtig instrument voor onderzoek in de synthetische biologie.
- Gestroomlijnde protocollen verhogen de snelheid van biologisch ontwerp.
- Deze methode biedt een veelzijdig platform voor eiwitexpressie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit protocol maakt snel prototyping van genetische circuits en eiwitexpressie mogelijk in een gecontroleerde in vitro-omgeving, waardoor de afhankelijkheid van tijdrovende in vivo-workflows wordt verminderd. Door de endogene transcriptie-translatiemechanismen van E. coli te behouden, biedt het systeem een fysiologisch relevant platform voor het beperken van risico's bij synthetisch biologische ontwerpen. De kostenreductie van 98% ten opzichte van commerciële alternatieven ondersteunt schaalbare, iteratieve tests in vroege discovery-fasen, wat de kapitaalefficiëntie verbetert en design-build-test-cycli versnelt.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt hypothese-testen van genetische circuits en regulatoire elementen onder endogene E. coli-condities mogelijk, waardoor het gedrag van pathways en de targetfunctie worden verduidelijkt.
- Operationele waarde: Ondersteunt het iteratieve ontwerp van synthetisch-biologische constructen zonder cellulaire groeibeperkingen, wat de doorlooptijd voor targetvalidatie-experimenten verkort.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve readouts van eiwitexpressie vanuit DNA-templates, wat dosis-respons- en kinetische analyse van circuitprestaties mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Het gestandaardiseerde TX-TL-formaat met drie buisjes waarborgt de reproduceerbaarheid tussen runs, wat de standaardisatie van assays voor screeningscampagnes vergemakkelijkt.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt exploratie van biologische fenomenen en grootschalige assemblage van circuits mogelijk in een systeem dat endogene cellulaire dynamiek weerspiegelt, wat de translationele relevantie verbetert.
- Operationele waarde: Levert voldoende extract voor maximaal 3.000 reacties uit één voorbereiding van vijf dagen, wat high-throughput preklinisch prototypen mogelijk maakt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie en biedt een celvrij platform om de functionaliteit van genetische circuits te evalueren voordat er wordt overgestapt op cellulaire of in vivo modellen.
- Ontdekkingsbiologie: Test de transcriptionele en translationele regulatie van synthetische circuits, wat bijdraagt aan het mechanistische risicobeheer van doelhypothesen.
- Screening: Levert kwantitatieve fluorescentie- of luminescentie-outputs onder gestandaardiseerde omstandigheden, waardoor een vergelijkende evaluatie van circuitvarianten mogelijk is.
- Analytiek: Biedt metrieken voor eindpuntfluorescentie en de maximale snelheid van eiwitproductie, zodat teams de expressie-efficiëntie kunnen beoordelen en de condities kunnen optimaliseren.
- Translationeel onderzoek: Handhaaft de continuïteit met de endogene biologie van E. coli, wat extrapolatie naar cellulaire systemen voor preklinische validatie ondersteunt.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Gecentraliseerde extractbereiding creëert een herbruikbare platformbron, waardoor de kosten per experiment dalen en standaardisatie tussen projecten mogelijk wordt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door de natuurlijke degradatiesnelheden van mRNA en DNA te behouden, waardoor mechanistische ambiguïteit in het circuitgedrag wordt verminderd.
- Operationele waarde: Elimineert de noodzaak voor klonering en cellulaire groeistappen, wat de workflow vereenvoudigt en de datageneratie versnelt.
- Strategische waarde: Maakt snellere go/no-go-beslissingen mogelijk over synthetisch biologische doelen door ontwerpen snel te prototypen in een kosteneffectief systeem.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door middel van goedkope, reproduceerbare tests van meerdere ontwerpiteraties.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in moleculaire biologie en eiwitexpressietechnieken voor de bereiding en kalibratie van extracten.
- Afhankelijk van toegang tot een bead beater, centrifuge en plaatlezer voor lysis, klaring en reactiemonitoring.
- Standaardisatie van magnesium-, kalium- en DTT-concentraties over verschillende batches is noodzakelijk om consistente prestaties van het extract te garanderen.
- Bij het plannen van reactieschalen moet rekening worden gehouden met batch-tot-batch variabiliteit in de opbrengst van het ruwe celextract, die gewoonlijk tussen 5–10% ligt.
- Beperkt door het reactievenster van acht uur, wat optimalisatie kan vereisen voor langzaam tot expressie komende constructen of circadiane gereguleerde circuits.
