Name: Protocollen voor implementatie van een Escherichia coli Op basis TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 11 s
Description: Leer een TX-TL celvrije expressiemethode voor synthetische biologie met Escherichia coli. Dit protocol optimaliseert eiwitproductie via extractkalibratie en reactieopzet voor snelle biologische ontwerpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere, en Enoch Yeung voor hulp stroomlijnen het protocol, en Clare Chen en Barclay Lee voor hulp in de vroege stadia van het project. Dit materiaal is gebaseerd op het werk mede ondersteund door het Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA / MTO) Living Gieterijen programma, contractnummer HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS wordt ook ondersteund door een UCLA / Caltech Medical Scientist Training Program gemeenschap en door een DoD, luchtmacht van het Wetenschappelijk Onderzoek, National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168a. De standpunten en conclusies in dit document zijn die van de auteurs en dient niet te worden geïnterpreteerd als officieel beleid, noch uitdrukkelijk noch impliciet, van de Defense Advanced Research Projects Agency of de Amerikaanse regering.

<ol><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).</li>
<li>He, M. Y., He, Y. Z., Luo, Q., Wang, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+DNA+to+protein%3A+No+living+cells+required%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochem%22%5BJournal%5D)">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochem. 46, 615-620 (2011).</li>
<li>Forster, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+projects+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology projects in vitro.</a> Genome Res. 17, 1-6 (1101).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+engineering%22%5BJournal%5D)">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of biological engineering. 4, 8(2010).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox%3A+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> Acs Synth Biol. 1, 29-41 (2012).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+messenger+RNA+inactivation+and+protein+degradation+in+an+Escherichia+coli+cell-free+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+engineering%22%5BJournal%5D)">Study of messenger RNA inactivation and protein degradation in an Escherichia coli cell-free expression system.</a> Journal of biological engineering. 4, 9(2010).</li>
<li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Replication%2C+Synthesis%2C+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> Acs Synth Biol. 1, 408-413 (2012).</li>
<li>Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M. Biomolecular resource utilization in elementary cell-free gene circuits. Pao, L., Abramovitch, D. American Control Conference, Jun 17-19, Washington, DC, , AACC. 1531-1536 (2013).</li>
<li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-grained+dynamics+of+protein+synthesis+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system.</a> Physical review letters. 106, 048104(2011).</li>
<li>Hoagland, M. B., Stephenson, M. L., Scott, J. F., Hecht, L. I., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Ribonucleic+Acid+Intermediate+in+Protein+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Soluble Ribonucleic Acid Intermediate in Protein Synthesis.</a> J Biol Chem. 231, 241-257 (1958).</li>
<li>Wood, W. B., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Enzymatically+Synthesized+Ribonucleic+Acid+on+Amino+Acid+Incorporation+by+a+Soluble+Protein-Ribosome+System+from+Escherichia+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Effect of Enzymatically Synthesized Ribonucleic Acid on Amino Acid Incorporation by a Soluble Protein-Ribosome System from Escherichia Coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 48, 94(1962).</li>
<li>Zubay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-Vitro+Synthesis+of+Protein+in+Microbial+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">In-Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems.</a> Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).</li>
<li>Pratt, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPratt%2C+JM+%22Transcription+and+Translation%3A+A+Practical+Approach%22">Transcription and Translation: A Practical Approach</a>. Hames, B. D., Higgins, S. J. , IRL Press. 179-209 (1984).</li>
<li>Kim, H. C., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+energizing+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bioscience+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Methods for energizing cell-free protein synthesis.</a> Journal of bioscience and bioengineering. 108, 1-4 (2009).</li>
<li>Michel-Reydellet, N., Calhoun, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+stabilization+for+cell-free+protein+synthesis+by+modification+of+the+Escherichia+coli+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+engineering%22%5BJournal%5D)">Amino acid stabilization for cell-free protein synthesis by modification of the Escherichia coli genome.</a> Metabolic engineering. 6, 197-203 (2004).</li>
<li>Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+progress%22%5BJournal%5D)">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology progress. 21, 460-465 (2005).</li>
<li>Andrianantoandro, E., Basu, S., Karig, D. K., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+new+engineering+rules+for+an+emerging+discipline%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0028(2006).</li>
<li>Kwok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+hard+truths+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Five hard truths for synthetic biology.</a> Nature. 463, 288-290 (2010).</li>
<li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacteriophage+T7+RNA+polymerase%2Fpromoter+system+for+controlled+exclusive+expression+of+specific+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 1074-1078 (1985).</li>
<li>Lewicki, B. T., Margus, T., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+rRNA+transcription+and+ribosomal+assembly+in+vivo.+Formation+of+active+ribosomal+subunits+in+Escherichia+coli+requires+transcription+of+rRNA+genes+by+host+RNA+polymerase+which+cannot+be+replaced+by+bacteriophage+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of rRNA transcription and ribosomal assembly in vivo. Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).</li>
<li>Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+coupled+in+vitro+transcription-translation+system+derived+from+Escherichia+coli+cells%3A+synthesis+of+high-yield+fully+active+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting coupled in vitro transcription-translation system derived from Escherichia coli cells: synthesis of high-yield fully active proteins.</a> Nucleic acids research. 34, e135(2006).</li>
<li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+and%22%5BJournal%5D)">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of structural and. 5, 63-68 (2004).</li>
<li>Matsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+cell-free+protein+synthesis+for+stable-isotope+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular.+NMR%22%5BJournal%5D)">Improving cell-free protein synthesis for stable-isotope labeling.</a> Journal of biomolecular. NMR. 37, 225-229 (2007).</li>
<li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of biotechnology. 110, 257-263 (2004).</li>
<li>Becskei, A., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+stability+in+gene+networks+by+autoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering stability in gene networks by autoregulation.</a> Nature. 405, 590-593 (2000).</li>
<li>Maeda, H., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+among+seven+Escherichia+coli+sigma+subunits%3A+relative+binding+affinities+to+the+core+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Competition among seven Escherichia coli sigma subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase.</a> Nucleic acids research. 28, 3497-3503 (2000).</li>
<li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coping+with+complexity%3A+machine+learning+optimization+of+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Coping with complexity: machine learning optimization of cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and bioengineering. 108, 2218-2228 (2011).</li>
<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+thinking+outside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+engineering%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic engineering. 14, 261-269 (2012).</li>
<li>Elowitz, M. B., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+oscillatory+network+of+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators.</a> Nature. 403, 335-338 (2000).</li>
<li>Tsuruta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+production+of+amorpha-4%2C11-diene%2C+a+precursor+of+the+antimalarial+agent+artemisinin%2C+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">High-level production of amorpha-4,11-diene, a precursor of the antimalarial agent artemisinin, in Escherichia coli.</a> Plos One. 4, e4489(2009).</li>
<li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403, 339-342 (2000).</li>
<li>Jewett, M. C., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+designing+and+building+minimal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Update on designing and building minimal cells.</a> Current opinion in biotechnology. 21, 697-703 (2010).</li>
<li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De endogene Escherichia coli op basis TX-TL-cel-vrije expressie systeem hier beschreven is een makkelijk-to-run drie buis reactie die minder dan acht uur kan nemen van het opzetten van de verzameling van gegevens. Het proces waarbij alle reagentia vereist vijf dagen tijd totaal (met aanzienlijke arbeid eisen slechts een dag), maar levert ruw extract 3000 reacties en buffer-making reagentia 10.000 reacties (figuur 1). Bovendien, ruw extract en buffer-making reagentia zijn stabiel gedurende tenminste 1 jaar bij -80 ° C, waardoor meervoudig gebruik van een preparaat. 4 Op $ 0,11 per 10 ul reactie ($ 0,26 inclusief arbeid), de kosten zijn 98% lager dan bij vergelijkbare commerciële systemen (figuur 2). Er zijn een aantal onopgeloste beperkingen, echter het systeem. Het einde efficiëntie van elke ruwe celextract voorbereiding kan variëren op basis van de gebruiker vaardigheid en op milieu-omstandigheden, hoewel typical opbrengst variatie is tussen 5-10% (figuur 4b). Hierdoor partij tot partij variabiliteit in zowel eindpunt expressie en expressie dynamiek te verwachten. Deze variaties zullen waarschijnlijk blijven totdat extract volledig is gekarakteriseerd of totdat extract creatie volledig geautomatiseerd. Als het celvrije expressiesysteem wordt gebruikt om gevoelige kwantitatieve experimenten, is het raadzaam om alle experimenten uitgevoerd met dezelfde partij ruw celextract. De opbrengst van een enkele ruwe celextract partij, ongeveer 3000 reacties, zou voldoende moeten zijn voor typische experimentele cursussen. Hoewel we vermoeden variatie kan worden verwijderd door schaalvergroting en automatiseren van de procedure, zou deze pogingen aanzienlijke investering bron te betrekken. Bovendien, hoewel eindpunt expressie niveaus zijn redelijk eenvoudig te bepalen, moet meer werk worden gedaan in het begrijpen dynamiek inherent aan de cel-vrij systeem. Het is bekend dat beide middelen competition en resource beperking kan invloed hebben op de expressie dynamiek. Zo kan beperkt endogene sigma 70 resulteren in een verzadigende regime verhoogde DNA-matrijs vervaardigen van een expressieprofiel analoog aan die van nucleotide of aminozuur uitputting. 9,27 echter dynamiek niet volledig te worden verstaan ​​het systeem gebruiken. Voor pure stijgingen van de opbrengst, kan optimalisatie worden gedaan door machine-learning benaderingen. 28 Vragen van de concurrentie hulpbronnen en beperking kan worden aangepakt door wiskundige modellen geverifieerd met behulp van experimentele gegevens. De hier gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd voor een BL21-Rosetta2 stam, maar generalizable andere E. coli-stammen. Wijzigingen in BL21-Rosetta2, zoals het verwijderen van het gen dat codeert lon protease en de toevoeging van genen die coderen voor zeldzame tRNA, zorgen voor maximale eiwitproductie. We hebben het protocol geprobeerd met twee andere extract stammen - alleen BL21 en BL21 een trxA knockout-eend hebben 50% minder eiwit opbrengst. Onze hypothese is dat de rendementen op dezelfde afnemen bij het gebruik van andere stammen. Andere veranderingen in parameters, zoals het wisselen 2xYT groeimedium voor LB en andere rijke bouillon, hebben geresulteerd in verminderde eiwitrendement. Cel-vrije expressie systemen met gebruik van zowel endogene en exogene transcriptie-translatie machines en mechanismen regelgeving hebben brede toepassingen in zowel eiwitten en metabolieten expressie en in de synthetische biologie. 3,29 In plaats van beperkt te zijn tot-T7 gereguleerd circuits, kan men voor ogen produceren van complexe biomoleculen in een door de gebruiker regelbare instelling met een mix van inheemse E. coli promotors en exogeen geleverd transcriptie en regelmechanismen. Zonder beperkingen van celdeling en metabolisme, kan variabiliteit in synthetische circuits zoals de repressilator of metabole gemanipuleerde lichaam zoals het produceren van artemisinine worden verminderd of beter begrepen. 30,31 Wij have gebruikt deze voordelen uit te voeren genetische schakelaars, alsmede sigmafactor vastlegging begrijpen 9,32 Deze technologie kan ook de ruggengraat van &quot;minimal&quot; of &quot;kunstmatige&quot; cellen -. klein, goed gekarakteriseerd en zelfvoorzienend belichaamde eenheden van extract. 33,34 Uiteindelijk verwachten we onmiddellijk gebruik van deze endogene cel vrije expressie systeem als een prototyping omgeving voor synthetische biologie. Bijnaam &quot;TX-TL biomoleculaire breadboard,&quot; het celvrije expressiesysteem verschaft een controleerbare omgeving waar synthetische circuits die bestemd is voor in vivo expressie kunnen golf prototyping ondergaan - cycli van proeven op basis plasmide lineair of chemisch gesynthetiseerd DNA, gevolgd van analyse en snelle modificatie. Prototyping rondes kunnen worden geholpen door voorspellende wiskundige modellen die momenteel worden ontwikkeld. Door het verwijderen van klonen en in vivo manipulatie voor niet-finale circuits, verwachten we engiengineering cyclustijden te verlagen tot 1-3 dagen in plaats van de huidige weken standaard.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Celvrije expressie technologie begon in de jaren 1950 als puur translationeel, het vorderen der jaren later aan gekoppelde transcriptie-translatie mechanismen omvatten het gebruik van T7 bacteriofaag DNA. 11,12 Sindsdien hebben talrijke inspanningen werden geleverd om de creatie van ruwe cel-extract (of E optimaliseren . coli S30 extract). 13,14 Deze optimalisaties omvatten het verlengen van celvrije eiwitsynthese door ATP regeneratie of stam wijzigingen, en het verminderen van het protocol tijd en kosten. 15-17 Alternative-cel vrije expressie systemen bestaan ​​die gebruik bereide componenten in plaats van ruwe celextract voor expressie. 5 Beide ruw celextract en reconstitutie methoden ontwikkeld voor commercieel gebruik. Met de komst van de synthetische biologie, is er een verhoogde behoefte aan een goed gekarakteriseerd platform te testen en uit te drukken gemanipuleerde biologische modules en circuits. 18,19 Dit platform moetveelzijdig, goed gekarakteriseerde, eenvoudig te manipuleren, en gericht op de gebruiker geleverde componenten. Ondanks dat een halve eeuw geleden ontwikkeld celvrije systemen op basis van E. coli intrinsiek deel deze eisen, omdat ze een vereenvoudigde weergave van in vitro cellulaire processen waarbij de complexiteit van de groei en metabolisme. Daarnaast zijn alle van de fundamentele kennis van in-vivo werk op E. coli toepassing gemakkelijk E. coli celvrije systemen. Hoewel cel vrije expressie systemen toepassingen kunnen hebben in de synthetische biologie, om het doel van de meeste cel-vrije meningsuiting systemen op heden heeft de maximalisatie van eiwitten en metabolieten opbrengst geweest. Dit wordt bereikt door gebruik bacteriofaag T7 transcriptie van sequenties aangedreven door T7 promoters. 20 Hoewel expressie efficiënte en robuuste Deze systemen dienen een gespecialiseerde doel. Celregulering methoden zijn beperkt, moet doelwit DNA templates zijnreengineered naar T7 promotors omvatten, en bepaalde sequenties zoals ribosomale complexen kan niet worden getranscribeerd en gemonteerd. 21,22 Bestaande celvrije expressie systemen in staat zijn om hoge opbrengsten te behouden met behoud van endogene regulerende mechanismen, een veelzijdigheid die nodig is voor de synthetische biologie. We hebben een endogene E. ontwikkeld coli celvrij expressiesysteem dat de efficiëntie van eiwitexpressie blijkt uit eerdere systemen behouden maar voegt extra veelzijdigheid doordat expressie en regulering gebaseerd op zowel endogene en exogene (T7 of andere) mechanismen. De hier beschreven protocol is gebaseerd op mijn Kigawa et al.. (2004) en Liu et al.. (2005), maar heeft belangrijke wijzigingen. Het maakt gebruik van Mg-en K-glutamaat op Mg-en K-acetaat voor een hogere efficiëntie, verwijdert 2-mercapto-ethanol, en lyseert cellen met behulp van een kraal-beater. 17,23,24 Bead-beating wordt verkozen boven homogenisering,-druk-gebaseerde methoden, of sonicatie vanwege de lagere kosten en vergelijkbare opbrengsten aan concurrerende systemen. is 23 3-fosfoglycerinezuur (3-PGA) gebruikt als energiebron zoals het werd gevonden om superieure eiwitopbrengsten geven in vergelijking met creatine fosfaat en fosfoenolpyruvaat. 4,25 Ons systeem kan produceren tot 0,75 mg / ml reporter eiwit met behulp van een-sigma70 gebaseerde promotor met lambda-faag exploitanten of een-T7 gedreven promotor, vergelijkbaar met de opbrengst van andere commerciële systemen. 4,6 Vijf dagen zijn verplicht om alle benodigde reagentia (figuur 1) te produceren. Bovendien biedt het een 98% kostenbesparing ten opzichte van vergelijkbare commerciële cel-vrije systemen - materiële kosten zijn $ 0,11 per 10 ul reactie, die stijgt tot $ 0,26 met inclusief arbeidsloon (figuur 2).

<table><tbody><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedicals</td><td>3012-032</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bacto-agar</td><td>BD Diagnostics</td><td>214010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bead-beating tubes (polypropylene microvials)</td><td>BioSpec</td><td>522S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Beads, 0.1mm dia.</td><td>BioSpec</td><td>11079101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td><td>Novagen</td><td>71402</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td><td>Bio-rad</td><td>500-0201</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CTP</td><td>USB</td><td>14121</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cuvettes, 1.5ml</td><td>Fisher</td><td>14-955-127</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Folinic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GTP</td><td>USB</td><td>16800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6147</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>K-glutamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mg-glutamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6204</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc 384-well optical bottom plates</td><td>Thermo-Scientific</td><td>142761</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc sealing tape</td><td>Thermo-Scientific</td><td>232701</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega</td><td>V3011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8584</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8709</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RTS Amino Acid Sampler</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>66382</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fischer</td><td>BP1521</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>tRNA (from E. coli)</td><td>Roche Applied Science</td><td>MRE600</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>UTP</td><td>USB</td><td>23160</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1L Centrifuge Bottle</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A98813</td><td>Dit is specifiek voor Avanti J-series; verkrijg de equivalente maat voor de centrifuge in gebruik.</td></tr><tr><td>4L Erlenmeyer Flask</td><td>Kimble Chase</td><td>26500-4000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Avanti J-26XP Centrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td>393127</td><td>Of een centrifuge die 1L aankan, evenals een rotor van 5000 x g.</td></tr><tr><td>Forma 480 Orbital Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>480</td><td>Of een 6x4L shaker van borstomvang.</td></tr><tr><td>JLA-8.1000 Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>363688</td><td>Of een 1L-rotor van 5000 x g die voor de centrifuge geschikt is.</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-1</td><td>BioSpec</td><td>3110BX</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Supplementair Materiaal 1. Recepten voor items. 
Chloramfenicol, 34 mg/ml: Bereid 0,51 g chloramfenicol en voeg ethanol toe tot 15 ml. Filter steriliseer (0,22 &mu;M), verdeel in 1 ml buisjes, bewaar bij -20 &deg;C voor later gebruik. 
2xYT+P+Cm agar plaat: Bereid 1,24 g 2xYT, 1,6 ml kaliumfosfaat dibasische oplossing @ 1 M, 0,88 ml kaliumfosfaat monobasische oplossing @ 1 M, 0,6 g agar en water tot 40 ml. Autoclaveer. Laat afkoelen tot 50 &deg;C en voeg 40 &mu;l Cm toe. Verdeel 25 ml in een 100x15 mm petrischaal en laat een uur afkoelen. 
2xYT+P media: Bereid 124 g 2xYT, 160 ml kaliumfosfaat dibasische oplossing @1 M, 88 ml kaliumfosfaat monobasische oplossing @ 1 M en water tot 4 L. Verdeel in 2x1,88 L en 0,24 L. Autoclaveer. 
Tris base, 2 M: Bereid 60,57 g Tris base en water tot 250 ml. Steriliseer, bewaar bij RT voor later gebruik. 
DTT, 1 M: Bereid 2,31 g DTT en water tot 15 ml. Filter steriliseer (0,22 &mu;M), verdeel in 1 ml buisjes, bewaar bij -20 &deg;C voor later gebruik. 
S30A buffer: Bereid 10,88 g Mg-glutamaat en 24,39 g K-glutamaat, 50 ml Tris bij 2M, azijnzuur (tot pH 7,7) en water tot 2 L. Autoclaveer, bewaar bij 4 &deg;C, voeg voor gebruik 4 ml 1 M DTT toe. 
S30B buffer: Bereid 10,88 g Mg-glutamaat en 24,39 g K-glutamaat, Tris bij 2 M (tot pH 8,2) en water tot 2 L. Autoclaveer, bewaar bij 4 &deg;C, voeg voor gebruik 2 ml 1 M DTT toe. 
HEPES: Bereid 1,91 g HEPES (MW 238,21), KOH (tot pH 8) en water tot 4 ml. 
tRNA: Bereid 30 mg tRNA en water tot 600 &mu;l. 
CoA: Bereid 30 mg CoA (MW 767,53) en water to

protocollen voor implementatie van een escherichia coli op basis tx-tl cell-free expression system for synthetic biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideaal celvrije expressiesystemen kan theoretisch emuleren een in vivo cellulaire omgeving in een gecontroleerde in vitro platform. 1 Dit is nuttig om eiwitten en genetische circuits op een gecontroleerde wijze en voor het verschaffen van een omgeving voor prototyping synthetische biologie. 2,3 Om dit laatste doel te bereiken, cel-vrije expressie systemen die behouden endogene Escherichia coli transcriptie-translatie mechanismen zijn in staat om een betere weerspiegeling van in vivo cellulaire dynamiek dan op basis van T7 RNA polymerase transcriptie. We beschrijven de voorbereiding en uitvoering van een efficiënt endogene E. coli gebaseerde transcriptie-translatie (TX-TL)-cel-vrije expressie systeem dat equivalente hoeveelheden eiwit als T7-gebaseerde systemen kunnen produceren tegen een 98% kostenreductie soortgelijke commerciële systemen. 4,5 De bereiding van buffers en ruwe cel extract zijn beschreven, evenals de uitvoering van eendrie buis TX-TL reactie. Het gehele protocol duurt vijf dagen voor te bereiden en levert genoeg materiaal voor maximaal 3000 enkele reacties in een voorbereiding. Eenmaal opgesteld, elke reactie is onder de 8 uur van installatie tot het verzamelen en analyseren van gegevens. Mechanismen van regulering en transcriptie exogeen E. coli, zoals lac / tet onderdrukkers en T7 RNA polymerase kan worden aangevuld. 6 Endogene eigenschappen, zoals mRNA en DNA afbraaksnelheden, kan worden aangepast. 7 De TX-TL celvrij expressiesysteem is aangetoond voor zware schaal circuit assemblage, het verkennen van biologische verschijnselen, en de expressie van eiwitten onder zowel T7-en endogene promotors. 6,8 Begeleidende wiskundige modellen zijn beschikbaar. 9,10 Het resulterende systeem heeft unieke toepassingen in de synthetische biologie als een prototyping omgeving, of &quot;TX- TL biomoleculaire breadboard. &quot;

We hebben een vijfdaagse protocol gepresenteerd voor de bereiding van een endogene Escherichia coli op basis TX-TL-cel-vrije expressie systeem. Een monster tijdlijn voor het creëren van de reagentia - ruwe cel-extract en buffer - is te vinden in figuur 1. Eens gemaakt, kan deze worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende maximaal een jaar. Na reagentia zijn gemaakt, kunt experimentele opstelling en de uitvoering worden gedaan in minder dan 8 uur. Daarnaast hebben we geoptimaliseerd expressieomstandigheden van de TX-TL celvrij expressiesysteem. Andere gebruiker geleverde toevoegingen, zoals buffers of DNA oplossingen wordt gekalibreerd toxiciteit vooraf. Bijvoorbeeld, verschillende verwerkingsmethoden van plasmiden leiden tot verschillende expressie door zoutgehalte. We testten ook het effect van Tris-Cl elutiebuffer bij reactie-efficiëntie (Figuur 5). Een voorbeeld van ruw celextract kalibratie verwijzing stap 4,1-4,9, weergegevenin figuur 4a. In het algemeen onze experimenten blijkt dat het ruwe celextract is het meest gevoelig voor Mg-glutamaat, gevolgd door K-glutamaat. De celvrije expressiesysteem tonen, construeerden wij en getest tegenkoppellus basis van tet repressie. 26 (figuur 6). In de cel-vrije expressie systeem, hetzelfde circuit run met en zonder ATC toont een 7-voudig eindpunt expressie verandering van deGFP reporter na acht uur van meningsuiting. Hoewel dit experiment geen wereldwijde inductoren of repressors vereisen, indien nodig zij onder &quot;Master Mix Voorbereiding.&quot; Kan worden toegevoegd <img alt="Figuur 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1.jpg" /> Figuur 1. Tijdlijn voor ruwe cel extract, aminozuur oplossing, en energie oplossing voorbereiding. Een vijfdaagse Timelin<html> e voor een typische uitvoering van het protocol is hierboven gegeven, geoptimaliseerd voor overnachting incubatie en overdag werken stappen. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2.jpg" /> Figuur 2. Kosten en expressie analyse van concurrerende ruwe cel extracten. a) Verdeling van de kosten van arbeid en materialen van de TX-TL-cel-vrije expressie systeem. Gebaseerd op de kosten van reagentia als van december 2012, en de arbeidskosten van $ 14 per uur. B) Vergelijking van de TX-TL-cel-vrije expressie systeem kosten versus andere commerciële systemen. De kosten worden uitgesplitst per pi, hoewel reactie volumes per kit. C) Vergelijking van de TX-TL-cel-vrije expressie systeem rendement versus andere commerciële systemen kan variëren. Eiwitexpressie het rendement bepaald door de fabrikant normen./ 50762fig2large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3.jpg" /> Figuur 3. Laden en verwerking van een kraal-beating buis. a) Demonstratie van de juiste viscositeit van cel-kraal oplossing. Cel-kraal oplossing zal een viscositeit afhankelijk van vele factoren, inclusief het bedrag van S30A buffer toegevoegd, de hoeveelheid kralen toegevoegd, en tijd besteed aan ijs te hebben. B) Laden van-kraal verslaan buis voor snel tafelblad centrifugeren. Het centrifugeren verwijdert belletjes opgedaan tijdens het laden. C) Bubbles oppervlakte komt na tafelblad centrifugeren. De grootte van de belletjes zal variëren, ze kunnen worden geknald of verwijderd met behulp van een pipet tip d) Volledig ingevuld kraal verslaan buis voor het afdekken.. Een meniscus wordt gevormd in de kraal slaan tube, en de dop heeft genoeg te dekken en veroorzaken kleine hoeveelheden niet te vol raakt. e) Correct geladen filterapparaat. Deze kunnen worden hergebruikt. F) Vergelijking kunnen tegen verkeerd bewerkte kraal slaan buis. De buis aan de linkerkant is een goed ritme tube - het heeft een klein en goed afgebakend toplaag, en zeer heldere bovenstaande. De buis rechts niet optimaal zijn, gebaseerd op de grotere, wazige tweede laag en de wazige supernatant. Buizen die suboptimaal zijn moeten extra bewerking ondergaan. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4.jpg" /> Figuur 4. Eigenschappen van ruw extract preparaten. a) Typische kalibratie percelen voor ruwe cel extract. Ruw extract wordt gekalibreerd voor extra Mg-glutamaat, K-glutamaat, en DTT niveau, in die volgorde. Getoond wordt eindpunt fluorescence na 8 uur, en maximale percentage van eiwitproductie op basis van een 12 minuten voortschrijdend gemiddelde. Op basis van deze percelen een acceptabel bereik aanvullende Mg-glutamaat 4 mM K-glutamaat 60-80 mM DTT en 0-3 mM. Merk op dat elke ruwe extract moet onafhankelijk voor deze drie variabelen worden gekalibreerd. B) Variatie van extract preparaten. Endpoint fluorescentie van twee ruwe extracten voorbereid op verschillende data wordt getoond; fout bars zijn 1 standaarddeviatie van drie onafhankelijke runs op verschillende dagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5.jpg" /> Figuur 5. Effecten van DNA-oplossing op de expressie-efficiëntie. a) Vergelijking van twee verschillende zuiveringwerkwijzen voor de verwerking plasmiden. 1 nM van pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 wordt bereid met behulp van slechts een Qiaprep Spin Miniprep Kit (Zuivering methode 1) of nabewerkt met een QiaQuick PCR zuivering kit (Zuivering methode 2). Getoond wordt eindpunt fluorescentie na 8 uur, en maximale snelheid van eiwitproductie op basis van een 12 minuten gemiddelde. Error bars zijn 1 standaarddeviatie van vier onafhankelijke runs op verschillende dagen. B) Effect van elutiebuffer (Tris-Cl). Verschillende concentraties van Tris-Cl worden vergeleken in een celvrije expressie reactie gebaseerd op de expressie van 1 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Concentraties gelden eindconcentraties Tris-Cl in de reactie; elutiebuffer gebruikte 10 mM Tris-Cl. Error bars zijn 1 standaarddeviatie van drie onafhankelijke runs op verschillende dagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <p class="jove_content" fo:houden-together.within-page = &quot;altijd&quot;&gt; <img alt="Figuur 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6.jpg" /> Figuur 6. Sample TX-TL run van een negatieve feedback loop. a) Steekproef setup van een cel-vrije uitvoering reactie. Tests &quot;op&quot; vs &quot;uit&quot; staat van de negatieve feedback loop, met positieve en negatieve controles. B) Plasmidemap van negatieve terugkoppeling. C) Representatieve resultaten. Gegevens weerspiegelt experiment in a) en b), met negatieve controle afgetrokken van signaal. Genetische circuit getoond in insert. Error bars zijn 1 standaarddeviatie van drie onafhankelijke runs op verschillende dagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Concentratie </td><td> Bedrag </td><td> Sterilisatie </td><td> Notes </td></tr><tr><td> Chlooramfenicol (Cm) </td><td> 34 mg / ml in ethanol </td><td> 1 ml </td><td> Filter steriliseren (0,22 pm) </td><td> Kunnen worden gemaakt in grotere hoeveelheden opgeslagen bij -20 ° C voor later gebruik. </td></tr><tr><td> 2xYT + P + Cm agar plaat </td><td> 31 g / L 2xYT, 40 mM dibasisch kaliumfosfaat, 22 mM kaliumfosfaat monobasisch, 34 ug / ml chlooramfenicol </td><td> 1 plaat </td><td> Autoclaaf </td><td></td></tr><tr><td> 2xYT + P media </td><td> 31 g / L 2xYT, 40 mM dibasisch kaliumfosfaat, 22 mM kaliumfosfaat monobasisch </td><td> 4 L </td><td> Autoclaaf </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Reagentia voor dag 1 van Ruwe Cell Extract protocol. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Concentratie </strong&gt; </td><td> Bedrag </td><td> Sterilisatie </td><td> Notes </td></tr><tr><td> Tris base </td><td> 2 M </td><td> 250 ml </td><td> Filter steriliseren (0,22 pm) of autoclaaf </td><td> Kan worden bewaard bij kamertemperatuur. </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 1 M </td><td> 6 ml </td><td> Filter steriliseren (0,22 pm) </td><td> Kunnen worden in grotere hoeveelheden en opgeslagen bij -20 ° C voor later gebruik. </td></tr><tr><td> S30A buffer </td><td> 14 mM Mg-glutamaat, 60 mM K-glutamaat, 50 mM Tris, pH 7,7 </td><td> 2 L </td><td> Autoclaaf </td><td> PH 7,7 te bereiken, titreer met azijnzuur. Voeg DTT tot 2 mM uiteindelijke concentratie vlak voor gebruik. Bewaren bij 4 ° C. </td></tr><tr><td> S30B buffer </td><td> 14 mM Mg-glutamaat, 60 mM K-glutamaat, ~ 5 mM Tris, pH 8,2 </td><td> 2 L </td><td> Autoclaaf </td><td> Tot pH 8,2 te bereiken, titreer met 2MTris. Voeg DTT tot 1 mM uiteindelijke concentratie vlak voor gebruik. Bewaren bij 4 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Reagentia voor dag 2 van ruwe Cell Extract protocol. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Valk </td></tr><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Lege 50 ml Falcon (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Falcon met pellet (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pellet massa (50 ml Falcon met pellet - lege 50 ml Falcon) (G) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> S30A buffer volume toe te voegen (pellet massa * 0,9) (ml) </td><td></td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Totale massa van kralen te voegen (pellet massa * 5.0) (G) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 3. S30A buffer en kraal massa rekenmachine, voor dag 3 van ruwe Cell Extract protocol. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Concentratie </td><td> Bedrag </td><td> Sterilisatie </td><td> Notes </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 2 M, pH 8 </td><td> 4 ml </td><td> Geen </td><td> Tot pH 8 te bereiken, titreren met KOH. </td></tr><tr><td> Nucleotide Mix </td><td> 156 mM ATP en GTP, 94 mM CTP en UTP, pH 7,5 </td><td> 1.5 ml </td><td> Geen </td><td> Op pH 7,5 te bereiken, titreren met KOH. </td></tr><tr><td> tRNA </td><td> 50 mg / ml </td><td> 600 ul </td><td> Geen </td><td></td></tr><tr><td> CoA </td><td> 65 mM </td><td> 600 ul </td><td> Geen </td><td></td></tr><tr><td> NAD </td><td> 175 mM, pH 7,5-8 </td><td> 300 pi </td><td> Geen </td><td> Om pH 7.5-8 bereiken, titreer met Tris op 2 M. </td></tr><tr><td> cAMP </td><td> 650 mM, pH 8 </td><td> 200 gl </td><td> Geen </td><td> Tot pH 8 te bereiken, titreer met Tris op 2 M. </td></tr><tr><td> Folinezuur </td><td> 33,9 mM </td><td> 300 pi </td><td> Geen </td><td> Hoewel slechts 300 pi nodig, aanvullende recept is 1.15 ml. </td></tr><tr><td> Spermidine </td><td> 1 M </td><td> 150 gl </td><td> Geen </td><td> Bewaar bij 4 ° C, warmte tot 37 ° C te smelten. </td></tr><tr><td> 3-PGA </td><td> 1.4 M, pH 7,5 </td><td> 3.2 ml </td><td> Geen </td><td> Op pH 7,5 te bereiken, titreer met Tris op 2 M. </td></tr></tbody></table> Tabel 4. Reagentia te bereiden op Energy Solution protocol. Aanvullend materiaal 1. Recepten voor items. Chlooramfenicol, 34 mg / ml: Bereid 0,51 g chlooramfenicol en voeg 15 ml ethanol. Filter steriliseer (0,22 uM), monster 1 ml buizen, bewaar bij -20 ° C voor later gebruik. 2xYT + P + Cm agar plaat: Bereid 1,24 g 2xYT, 1,6 ml kalium dibasisch oplossing @ 1 M, 0,88 ml kalium monobase oplossing @ 1 M, 0,6 g agar en water tot 40 ml. Autoclaaf. Laat afkoelen tot 50 ° C en voeg 40 ul Cm. Aliquot 25 ml in een 100 x 15 mm petrischaal en laat afkoelen voor een uur. 2xYT + P media: Bereid 124 g 2xYT, 160 ml kalium dibasisch oplossing @ 1 M, 88 ml kalium monobase oplossing @ 1 M, en water tot 4 L. Aliquot uit in 2 x 1,88 L en 0,24 L. autoclaaf. Tris-base, 2 M: Bereid 60.57 g Tris-base en water tot 250 ml. Steriliseren, bewaren bij kamertemperatuur voor later gebruik. DTT, 1 M: Bereid 2,31 g DTT en water tot 15 ml. Filter steriliseer (0,22 uM), monster 1 ml buizen, bewaar bij -20 ° C voor later gebruik. S30A buffer: Bereid 10,88 g Mg-glutamaat en 24,39 g K-glutamaat, 50 ml 2 M Tris van azijnzuur (pH 7,7) en water 2 L. Autoclaaf, bewaren bij 4 ° C, voeg 4 ml 1 M DTT vóór gebruik. S30B buffer: Bereid 10,88 g Mg-glutamaat en 24,39 g K-glutamaat, 2 M Tris (pH 8,2) en water 2 L. Autoclaaf, bewaren bij 4 ° C, voeg 2 ml 1 M DTT vóór gebruik. HEPES: Bereid 1,91 g HEPES (MW 238,21), KOH (pH 8) en water 4 ml. tRNA: Bereid 30 mg van tRNA en water tot 600 pi. CoA: Bereid 30 mg CoA (MW 767,53) en water tot 600 pi. NAD: Voeg 34.83 mg NAD (MW 663,43), 2 M Tris (pH 7,5-8), en water tot 300 ul. (Voeg 27 ul van 2 M Tris om de oplossing tot pH 7,5-8 brengen). cAMP: Voeg 42.80 mg cAMP (MW 329,22), 2 M Tris (pH 8), en water tot 200 ul. (Voeg 73 ul van 2 M Tris om de oplossing tot pH 8 te brengen). Folinezuur (33,9 mm): Tot 20 mg vast folinezuur calciumzout (MW 511,5), voeg 1,15 ml water. Spermidine: Bereid 23.55 ul spermidine (MW 145,25) en water tot 150 pi. Bereid bij kamertemperatuur na een korte smelten bij 37 ° C. 3-PGA: Voeg 1,03 g 3-PGA (MW 230,02), 2 M Tris (pH 7,5), en water tot 3,2 ml. (Voeg 1,73 ml 2 M Tris om de oplossing op pH 7,5 te brengen). Nucleotide Mix: Voeg 145 mg ATP dikaliumzout dihydraat (MW 619,4), 133 mg van GTP dinatriumzout (MW 567,14), 79,4 mg CTP dinatriumzoutdihydraat (MW 563,16), 82,6 mg UTP trinatriumzout dihydraat (MW 586,12) , KOH 15% verdunning (tot pH 7,5) en 1,5 ml water. (Voeg 353 ul van KOH 15% verdunning om de oplossing op pH 7,5 te brengen). Aanvullend materiaal 2. Bradford assay. <ol><li> Verwijder Bradford middel uit 4 ° C en ingesteld op kamertemperatuur. </li><li> Bereid 50 gl BSA standaard 1 mg / ml en bij 0,1 mg / ml. </li><li> Bereid 40 pi 20x verdunning van het extract van stap 1.47. </li><li> Voeg 800 ul water tot 7 cuvetten. </li><li> Bereid standaard cuvetten van 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 ul 0,1 mg / ml BSA), 2 mg / ml (20 ul 0,1 mg / ml BSA), 4 mg / ml (4 pl 1 mg / ml BSA) , 6 mg / ml (6 ui 1 mg / ml BSA). </li><li> Bereid experimentele cuvetten van 2 pl monster en 4 ui monster. </li><li> Voeg 200 ul van Bradford agent steeds cuvet en meng goed by pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 10 minuten. </li><li> Produceren standaard curve bij OD 595 nm met behulp van cuvetten uit stap 6.5. Standaardcurve afwijzen indien r 2 &lt;0.95. </li><li> Bepaal extract concentratie bij OD 595 nm met behulp van cuvetten uit stap 6.6. </li></ol> Aanvullend materiaal 3. Buffer kalibratie spreadsheet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">Zie TXTL_e (template) _calibration_JoVE.xlsx</a> . Aanvullend materiaal 4. Celvrije meningsuiting lopen spreadsheet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">Zie TXTL _JoVE.xlsx</a> .

Deze vijfdaagse protocol beschrijft alle stappen, apparatuur en aanvullende software voor het maken en uitvoeren van een efficiënte endogene Escherichia coli op basis TX-TL-cel-vrije expressie systeem vanaf nul. Met reagentia, het protocol duurt 8 uur of minder voor het inrichten van een reactie, verzamelen en verwerken van gegevens.

Protocollen voor implementatie van een Escherichia coli Op basis TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Het algemene doel van deze procedure is om een e coli-gebaseerd celvrij expressiesysteem te creëren, dat bekend staat als transcriptie-translatie of TX tl. Dit wordt bereikt door eerst drie initiële componenten te maken voor TX TL ruwe celextract, aminozuuroplossing en energieoplossing. De aminozuuroplossing en energieoplossing worden later gecombineerd om de TX TL-buffer te maken.De tweede stap is om het ruwe celextract te kalibreren om de optimale magnesium-, kalium- en DTT-concentraties te bepalen voor TX TL-reacties met maximale expressieniveaus. Vervolgens worden de kalibratieresultaten gebruikt om een TX TL-systeem van drie buisjes te maken, bestaande uit buffer, ruw celextract en DNA. De laatste stap is om een TX TL-reactie uit te voeren met behulp van de zojuist gemaakte reagentia.Uiteindelijk wordt TX TL gebruikt om synthetische biologiecircuits en traditionele celvrije expressietoepassingen te demonstreren. Deze methode kan helpen bij het testen van circuits in het veld van synthetische biologie door een in vitro-gelijkwaardige omgeving te bieden, die de in vivo-omgeving nabootst. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar het verhogen van de snelheid van synthetisch biologisch ontwerp door het wegnemen van de noodzaak om alle prototype-stappen in vivo uit te voeren.Claire Hayes, een onderzoeksassistent in onze groep, zal de procedure bijstaan. Houd er rekening mee dat deze video alleen selectieve secties van het protocol zal doorlopen die cruciaal zijn voor het filmen. Het volledige protocol is beschikbaar met het tekstartikel.Eerder in dit protocol werden bacteriecellen gekweekt en gepelleteerd. Nu zullen de bacteriecellen worden gelyseerd met behulp van een bead beater. Houd alle 50 milliliter falconbuisjes met celsuspensie op ijs.Voor de doeleinden van deze video zal bead beading worden gedemonstreerd voor slechts één buisje. De kralen moeten intermitterend in drie porties aan de Falcon-buis worden toegevoegd, elk met één derde van de totale hoeveelheid kralen. Voeg de eerste portie kralen toe aan de buis, vortex gedurende 30 seconden en plaats op ijs.Op dezelfde manier, voeg de tweede portie kralen toe, vortex en plaats op ijs. Zorg ervoor dat de kralen na het toevoegen van de laatste portie en het vortexen gelijkmatig verdeeld zijn, er moet een dikke pasta worden gevormd na de derde vortexstap. Plaats de buis op ijs.Bereid een pipettip van vijf milliliter volume voor door een steriel paar schaar te gebruiken om het uiteinde af te knippen. Draai de pipet naar twee milliliter om een opening van drie tot vier millimeter te creëren. Plaats 20 steriele bead beading-buisjes op ijs.Gebruik de aangepaste pipet om de hoge viscositeit van de bead cell-oplossing te verifiëren. Het zou viskeus moeten zijn tot het punt dat het nauwelijks uit de pipettip komt. Tijdens het uitwerpen, verwijder de bead cell-oplossing uit de Falcon-buis en breng het over in een bead beading-buisje.Vul het drie kwart vol en draai kort in een minicentrifuge. Om luchtbellen te verwijderen zonder de kralen opnieuw te verdelen, werk de toevoeging van bead cell-oplossing af aan de buis om een concaaf meniscus te vormen. Voeg vervolgens een zeer kleine druppel bead cell-oplossing toe aan de binnenkant van een bead beading-buisjedophevel.Wees voorzichtig om geen oplossing in de buitenlip van de dop te doen. Anders zal de bead beading-buis niet voldoende gesloten zijn. Tik de dop op een vlakke ondergrond en controleer of er geen luchtbellen op de bodem van de dop zitten.Dek de bead beating-buis af. Als het goed is gedaan, zou de dop goed gesloten moeten zijn. Er mogen geen luchtbellen zichtbaar zijn en er mag weinig of geen bead cell-oplossing overstromen vanaf hier, twee personen zijn vereist om het bead beading efficiënt te voltooien.Geef de gevulde buis door aan een assistent voor bead beading terwijl de eerste demonstrant doorgaat met het vullen van meer bead beading-buisjes met de resterende bead cell-oplossing. Neem de gevulde bead beading-buis en plaats deze op ijs. Zodra er twee gevulde bead beading-buisjes zijn verzameld en minstens een minuut op ijs hebben gestaan.Begin met bead beading, beade een buis gedurende 30 seconden bij 46 RPM. Plaats de buis ondersteboven op ijs gedurende 30 seconden terwijl de andere buis wordt beade. Herhaal het bead beading en ijs zodat elke gevulde bead beading-buis in totaal een minuut wordt beade.Zodra alle gevulde bead beading-buisjes zijn verwerkt, bouw een filterapparaat van een 15 milliliter falconbuis. Voeg eerst een nieuwe bead beading-dop met de platte kant naar boven toe aan de bodem van de buis toe. Verwijder vervolgens de dop van een verwerkt bead beading-buisje en druk een microchromatografiekolom stevig op het uiteinde van het verwerkte bead beading-buisje tot het volledig is afgedicht.Snij het elucian-uiteinde van de microchromatografiekolom af en plaats het elucian. Einde naar beneden in een lege bead beading-buis. Plaats dit complex in de 15 milliliter falconbuis.Bouw de filterapparaten voor alle gevulde bead beating-buisjes en bewaar ze op ijs. Wanneer klaar, centrifugeer de filterapparaten Falcon-buis zonder dop met 6.000 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius om extract en pellet van de kralen te scheiden. Controleer na de centrifugatie of elk bead beading-buisje een levensvatbaar extract heeft geproduceerd.Goed beade extract zal niet troebel zijn en de pellet zal twee duidelijke lagen hebben, zoals geïllustreerd door de buis aan de linkerkant. Troebele buisjes, zoals getoond in het voorbeeld aan de rechterkant, moeten worden weggegooid. Breng het supernatant van niet-troebele buisjes over in afzonderlijke 1,75 milliliter microcentrifugebuisjes, waarbij zo min mogelijk pellet wordt meegenomen.Bewaar op ijs totdat alle bead beading-buisjes zijn verwerkt. Draai vervolgens de microcentrifugebuisjes neer en verzamel het supernatant. Nadat 500 microliter pelletvrij supernatant is geconsolideerd in een nieuwe bead beading

protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een gestroomlijnde benadering screening op de expressie van recombinant membraaneiwitten in Escherichia coli gebaseerd op fusie met groen fluorescent proteïne gepresenteerd.

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

Een nieuwe generatie van cel-vrije transcriptie-vertaling platforms is ontworpen voor de bouw van biochemische systemen in vitro middels het uitvoeren van gene circuits. In dit artikel beschrijven we hoe bacteriofagen, zoals MS2, ΦΧ174 en T7, worden gesynthetiseerd uit hun genoom met behulp van een alle E. coli cel-vrije TXTL systeem.

Synthese van besmettelijke bacteriofagen in een e-coli -gebaseerd systeem van cel-vrije expressie

Op een ondergrond, die kan worden gebruikt voor het uitvoeren van cel-vrije gen expressie experimenten op biochips beschrijven we een eenvoudige lithografische procedure voor de immobilisatie van gen-lengte DNA moleculen.

Functionele oppervlak-immobilisatie van genen met behulp van meerstaps Strand Displacement lithografie

Dit protocol detailleert de stappen, kosten, en apparatuur die nodig is voor het genereren van E. coli-op basis van cel extracten en uit te voeren in vitro eiwit synthese reacties binnen 4 dagen of minder. Om de invloed van de flexibele aard van dit platform voor brede toepassingen, bespreken we reactie voorwaarden die kunnen worden aangepast en geoptimaliseerd.

Escherichia coli-cel-Free eiwitsynthese gebaseerd: protocollen voor een robuuste, flexibele en toegankelijk platformtechnologie

Dit protocol beschrijft de methode, materialen, apparatuur en stappen voor bottom-up voorbereiding van RNA en eiwit produceren synthetische cellen. Het binnenste waterige compartiment van de synthetische cellen bevatte de S30 bacteriële lysaat ingekapseld in een lipide tweelaag (dat wil zeggen, stabiele liposomen), met behulp van een water-in-olie emulsie overdracht methode.

Voorbereiding van eiwit producerende synthetische cellen met behulp van cell free bacteriële extracten, liposomen en emulsie transfer

De studie beschrijft een protocol voor het maken van grote (μg-mg) hoeveelheden DNA voor eiwitscreeningcampagnes uit synthetische genfragmenten zonder klonen of het gebruik van levende cellen. De minimale sjabloon wordt enzymatisch verteerd en gecicirkeld en vervolgens versterkt met behulp van isothermische rollende cirkelversterking. Celvrije expressiereacties konden worden uitgevoerd met het ongezuiverde product.

Snelle, enzymatische methoden voor versterking van minimale, lineaire sjablonen voor eiwitprototypering met behulp van celvrije systemen

Dit protocol beschrijft een snelle en eenvoudige methode om bacterieel lysaat te produceren voor celvrije genexpressie, met behulp van een gemanipuleerde stam van Escherichia coli en waarvoor alleen standaard laboratoriumapparatuur nodig is.

Snelle, betaalbare en ongecompliceerde productie van bacteriële celvrije lysaat

Dit werk beschrijft de bereiding van celextract van Escherichia coli (E. coli) gevolgd door celvrije eiwitsynthese (CFPS) reacties in minder dan 24 uur. Uitleg van het celvrije auto-inductie (CFAI) protocol beschrijft verbeteringen die zijn aangebracht om het toezicht van onderzoekers te verminderen en de verkregen hoeveelheden celextract te verhogen.

Van cellen naar celvrije eiwitsynthese binnen 24 uur met behulp van celvrije auto-inductieworkflow

Dit protocol beschrijft een verbeterde methode voor het synthetiseren van hoge opbrengsten van recombinante eiwitten uit een Streptomyces venezuelae celvrije transcriptie-translatie (TX-TL) systeem.

Een high-yield streptomyces transcriptie-vertaling toolkit voor synthetische biologie en natuurlijke producttoepassingen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bereiding en bufferkalibratie van celextracten uit exonuclease V knock-out stammen van Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD en ΔrecB). Dit is een snelle, eenvoudige en directe benadering voor expressie in celvrije eiwitsynthesesystemen met behulp van lineaire DNA-sjablonen.

Celvrije eiwitsynthese uit exonuclease-deficiënte cellulaire extracten met behulp van lineaire DNA-sjablonen

Dit protocol beschrijft het Cell-Free Protein Synthesis (CFPS)-systeem dat wordt gebruikt bij het bouwen van synthetische cellen. Het schetst de belangrijkste fasen met representatieve resultaten in verschillende microcompartimenten. Het protocol heeft tot doel best practices vast te stellen voor diverse laboratoria in de synthetische celgemeenschap, waardoor de vooruitgang in de ontwikkeling van synthetische cellen wordt bevorderd.

Celvrij eiwitsynthesesysteem voor het bouwen van synthetische cellen

Leer een TX-TL celvrije expressiemethode voor synthetische biologie met Escherichia coli. Dit protocol optimaliseert eiwitproductie via extractkalibratie en reactieopzet voor snelle biologische ontwerpen.

Protocollen voor implementatie van een Escherichia coli Op basis TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Meer video's verkennen