Een in vitro model om immuunresponsen van humane perifere bloedmononucleaire cellen op humane respiratoire syncytiële virusinfectie te bestuderen

Het algemene doel van deze procedure is om de respons van menselijke immuuncellen op een infectie met het respiratoir syncytiaal virus of RSV te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst een infectieuze RSV-voorraad te kweken op helo-cellen. In de tweede stap wordt de gekweekte RSV-voorraad gezuiverd door middel van ultracentrifugatie.

Vervolgens worden primaire immuuncellen uit menselijk bloed geïsoleerd via dichtheidscentrifugatie. In de laatste stap worden de geïsoleerde immuuncellen gestimuleerd met het virus. Uiteindelijk kan de cellulaire immuunrespons op een RSV-infectie worden beoordeeld via ELISA, qPCR of flowcytometrie.

Deze techniek is een waardevolle toevoeging voor het bestuderen van infecties met het respiratoir syncytiavirussen. RSV is zeer adaptief voor mensen. Daarom is het belangrijk om menselijke immuuncellen te gebruiken om de inflammatoire routes te bestuderen die betrokken zijn bij de pathogenese van het virus.

Hoewel het in deze video gebruikte virus RSV is, kan deze methode ook eenvoudig worden aangepast om andere virussen te bestuderen, zoals het influenzavirus of rhinovirus. Begin met het opwarmen van een vial met human RSV seeding stock in een waterbad van 37 °C. Wanneer het virus is ontdooid, wordt de stock verdund in aliquots van 4 mL infectiemedium per kolf.

Voeg het virus toe aan de heli-cellen bij een MOI van 0,1 of lager, met een zo laag mogelijk totaalvolume zonder dat de cellen uitdrogen. Incubeer de culturen vervolgens gedurende twee tot vier uur bij 37 °C en 5% CO2, waarbij de fles elke 15 minuten wordt bewogen om het medium te herverdelen. Verwijder daarna het inoculum en was de cellen eenmaal met PBS.

Voeg vervolgens 15 milliliter kweekmedium toe aan de flessen en incubeer deze gedurende drie tot vijf dagen onder dezelfde kweekcondities. Observeer de cellen dagelijks onder een normale lichtmicroscoop op door het virus geïnduceerde cytopathologische veranderingen. Wanneer deze veranderingen worden waargenomen, schraap dan de cellen af om het RSV te oogsten, verzamel de suspensie in een steriele buis van 50 milliliter, vortex de cellen en centrifugeer deze vervolgens 10 minuten bij 1800 Gs en kamertemperatuur om het celdebris te pelletteren.

RSV pelleteert niet bij deze snelheid, waardoor het supernatant in volumes van één milliliter als seeding stock kan worden bewaard bij min 80 graden Celsius. Aliquots voor toekomstig gebruik worden altijd direct ingevroren met vloeibare stikstof om het verlies van infectieuze virusdeeltjes te voorkomen. Om RSV te zuiveren, begint u met het plaatsen van een steriele centrifugebuis in elke houder van een ultracentrifuge.

Voeg vervolgens vijf milliliters vers bereide, filtergesteriliseerde sucrose-oplossing toe aan de bodem van elke buis. Voeg daarna, zeer langzaam, 30 milliliters van de RSV-oplossing bovenop de sucrose-oplossing toe, waarbij u er zorg voor draagt dat de sucrose-oplossing niet wordt verstoord en de lagen gescheiden blijven. Balanceer vervolgens in een flowcabinet, om de steriliteit te waarborgen, de zes ultracentrifugatie-buckets zorgvuldig met steriele PBS tot binnen 0,1 grams van elkaar, inclusief de doppen. Centrifugeer het virus gedurende 1,5 hours bij 20.000 RCF en vier degrees Celsius.

Wanneer het centrifugeren is voltooid, worden de centrifugebuisjes met een steriele pincet voorzichtig uit de houders verwijderd. De virusdeeltjes zijn door de sucroselaag gezakt en hebben een pellet gevormd. Giet de centrifugebuisjes leeg in een kolf voor viraal afval en laat de buisjes ondersteboven uitlekken op een steriel oppervlak.

Laat het pellet niet volledig uitdrogen. Laat vervolgens voorzichtig één milliliter HPSS over het pellet lopen en kantel de centrifugebuis opnieuw om de HPSS af te gieten. Keer de buis daarna weer om, waarbij u er zorg voor draagt dat het pellet niet uitdroogt.

Tritureer het pellet nu 40 keer in een andere milliliter HBSS, waarbij u zorgvuldig voorkomt dat er bellen ontstaan, aangezien dit het virus kan vernietigen. Snap-freeze vervolgens aliquoten van het virus in vloeibare stikstof. Bewaar het virus bij negatief 80 graden Celsius tot de kwantificering en verder gebruik. Nadat bloed is afgenomen in 10 milliliter EDTA-buizen van gezonde vrijwilligers, verdunt u het bloed met PBS op kamertemperatuur tot maximaal twee keer, tot een maximum van 35 milliliter verdund bloed in een 50 milliliter buis.

Bevestig vervolgens een steriele Luer-lock naald aan een steriele spuit van 50 milliliter en aspireer vervolgens densiteitsgradiëntmedium in de spuit. Plaats de naald op de bodem van de buis met verdund bloed en pipetteer voorzichtig 15 milliliter densiteitsgradiëntmedium onder het bloed, waarbij een scherpe scheiding tussen het densiteitsgradiëntmedium en het bloed behouden blijft. Centrifugeer de cellen vervolgens gedurende 20 minuten bij 800 GS op kamertemperatuur met maximale versnelling en een brake-off. Na de centrifugatie bevinden de erytrocyten zich in het pellet onderin de buis, met daarboven een zilverachtige laag neutrofielen.

De heldere laag boven het pellet bevat het dichtheidsgradiëntmedium en de dunne laag tussen het dichtheidsgradiëntmedium en de bloedplasmalaag aan de bovenzijde bevat de PBMC. Gebruik een pasteurpipet om de PBMC voorzichtig te verzamelen en breng de cellen vervolgens over naar een nieuwe buis van 50 milliliter op ijs. Voeg ijskoud PBS toe tot een volume van 50 milliliter en pellet de cellen wanneer het centrifugeren is voltooid.

Aspireer het supernatant en was de pellet twee keer in 50 milliliters ijskoude PBS. Voeg na de tweede wasbeurt één milliliter ijskoud medium toe aan de pellet, tel de cellen en stel de celconcentratie in op vijf keer 10 to the six pbmc per milliliter. Om de pbmc te stimuleren met levend RSV, voegt u eerst 100 microliters pbmc toe aan elke put van een 96-wells ronde bodemplaat. Voeg vervolgens 50 microliters van twee vers verdunde stimuli toe aan elke put.

Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2, en centrifugeer de plaat vervolgens, waarbij het supernatant wordt opgevangen voor latere analyse via ELISA. De gestimuleerde PBMC in het pellet kunnen worden geanalyseerd via qPCR of worden gekleurd voor flowcytometrie. Bij het uitvoeren van PBMC-stimulatie-experimenten wordt de stimuli-fractioneringsmethode in combinatie met deze methode aanbevolen.

De condities zijn onderverdeeld in standaardstimulatiecondities, zoals RPMI of menselijk RSV, en testfractiecondities, zoals mial, dipeptide of LPS. Belangrijk is dat er in elk experiment altijd een negatieve controle, zoals RPMI alleen, en een positieve controle, zoals LPS, zijn opgenomen. Na 24 uur stimulatie met RSV vertonen verschillende PBMC-populaties een dosisafhankelijke infectiegraad en een verschil in RSV-infectie-efficiëntie. Na 24 uur stimulatie met het virus laat qPCR-analyse van de PBMC's voor de expressie van TNF-alfa of interferon-gamma zien dat RSV een robuuste opregulatie van de transcriptie van deze twee inflammatoire cytokines induceert. Omgekeerd resulteert stimulatie met miam-dipeptide of LPS slechts in een zwakke mRNA-expressie.

Wanneer P BMC's gelijktijdig worden gestimuleerd met zowel RSV als het MIAL-dipeptide, wordt een sterke synergetische upregulatie waargenomen. Gestimuleerde pbmc werden daarnaast geanalyseerd op hun productie van TNF Alpha of Interferon gamma via ELISA. In tegenstelling tot de waarnemingen op transcriptioneel niveau is RSV een zwakke induceerder van TNF alpha- en interferon gamma-eiwitsecretie door p BMC's; stimulatie met miam-dipeptide resulteert in de productie van lage hoeveelheden TNF alpha en geen interferon gamma.

Vergelijkbaar met de transcriptionele analyses vertonen zowel TNF alpha als interferon gamma een synergetische upregulatie bij co-stimulatie met RSV en het MIAM-dipeptide, als controle om te bepalen of de cytokine-inductie afhankelijk is van RSV-replicatie. P BMC's werden gestimuleerd met levend of bèta-propionlacton-geïnactiveerd RSV; zoals in de grafieken wordt geïllustreerd, induceerden zowel levend als geïnactiveerd RSV de productie van pro-inflammatoire cytokines. Vergeet niet dat experimenten met RSV moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskabinet in een laboratorium met biosafety level 2.

Bovendien is het bij het uitvoeren van deze methode cruciaal om gedurende de gehele procedure endotoxinevrije reagentia en materialen te gebruiken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe menselijke pbmc gestimuleerd kunnen worden met RSV en in verschillende assays die gebruikt kunnen worden om de immuunrespons te analyseren.I.