Anticancer Metal Complexen: Synthese en cytotoxiciteit Evaluatie door de MTT-test

Het algemene doel van deze procedure is om antikanker metallogeneesmiddelen te bereiden en hun cytotoxiciteit te evalueren door middel van de MTT-test. Dit wordt bereikt door eerst metaalgebaseerde antikankerverbindingen te synthetiseren. De tweede stap is het bereiden van 96-wellplaten met kankercellen.

Vervolgens worden de metaalgebaseerde antikankerverbindingen in de kankercellen ingebracht. De laatste stap is het meten van de celviabiliteit door middel van de MTT-test, waarbij de reductie van MTT door mitochondriale en cytosolische enzymen tot de vorming van zen wordt gemeten, uiteindelijk de antikankeractiviteit en half-maximale remmingsconcentratie. Of ik zie 50 waarden van de verbindingen worden bepaald.

Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het een meertrapsprocedure is die de volledige aandacht van de laboratoriummedewerker vereist en wordt geplaatst op een strikte tijdlijn. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, omdat de voorbereiding van de celplaat niet eenvoudig is omdat het werken met levensvatbare cellen het volgen van specifieke richtlijnen vereist. Werk in een handschoenenkast, bereid het vanadium vijf complex voor door 0,42 millimol van de ligand precursor op te lossen in droog THF.

Voeg het vervolgens toe aan een roerende oplossing van gelijkwaardige hoeveelheden vanadium ot tris isop oxide in THF. Roer het reactiemengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur voordat de vluchtige stoffen onder vacuüm worden verwijderd. Voeg vervolgens een koud hexaan toe en verwijder het onder vacuüm.

Er moet een donkerpaars poeder worden verkregen met een kwantitatieve opbrengst. Weeg acht milligram van de verkregen verbinding in een epi of ph-vial. Om het titanium vier complex te bereiden, lost u 0,35 millimol van de ligand precursor op in droog THF en voegt u het toe aan een roerende oplossing van gelijkwaardige hoeveelheden titanium tetra isop oxide in THF.

Roer het reactiemengsel gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de vluchtige stoffen onder vacuüm om een geel product met kwantitatieve opbrengst te verkrijgen. Weeg acht milligram van de verkregen verbinding in een eph-vial om HT 29-cellen in een 96-wellplaat eerst te kweken.

De cellen in een fles van 75 vierkante centimeter zoals beschreven in het tekstprotocol, verwijder het medium wanneer de HT 29-cellen maximale co fluence bereiken. Na het wassen van de cellen in één milliliter trypsin EDTA-oplossing, voegt u één milliliter van dezelfde oplossing toe en incubeert u gedurende vijf minuten. Los de HT 29-cellen los van de fles en voeg 10 milliliter van het medium toe om de trypsin-activiteit uit te schakelen.

Breng vijf milliliter van het cellenmengsel over in een buisje. Gebruik een pipette om een paar druppels van het cellenmengsel over te brengen in een tellkamer. De tellkamer bevat twee delen van vijf bij vijf vierkanten.

Tel de cellen in vijf representatieve vierkanten van elk deel met behulp van een microscoop. Vier vierkanten in de hoeken en één vierkant in het midden. Bereken de geschatte hoeveelheid aanwezige cellen.

Tel de cellen op in de vijf representatieve vierkanten van elk deel. Bereken de gemiddelde som van de twee delen en deel door 20. Deel vervolgens 0,6 door het quotiënt.

Het ontvangen getal is de hoeveelheid cellenmengsel die per plaat nodig is. Deze berekening verwijst naar een plaat die 9.000 cellen per putje bevat. Gebruik een pipette om de hoeveelheid cellenmengsel die per plaat nodig is te combineren met 13,2 milliliter van het medium.

Voeg het mengsel toe aan een 96-wellplaat. Gebruik een 11-kanaals pipette op 200 microliter per putje over zes lijnen met in totaal 66 putjes. Een putje van elke lijn moet leeg blijven voor de blanco controle.

Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide om de cellen te laten hechten aan de plaat om de verbindingen eerst in te brengen, voeg 200 microliter droog THF toe aan acht milligram van het gewichtsverbinding. Verdun de verbindingsoplossing verder door eerst 60 microliter THF toe te voegen aan negen verschillende einor-bestanden. Gebruik voor elke oplossing een pipette om 60 microliter van de verbindingsoplossing over te brengen naar het eerste einor-bestand.

Vervolgens resuspens en breng 60 microliter over naar de volgende fles en zo verder tot er 10 verschillende concentraties zijn verkregen. Ga verder met het verdunnen van 20 microliter van elke concentratie in THF met 180 microliter medium. Bereid ook een controle-oplossing met alleen oplosmiddel voor door 20 microliter THF toe te voegen aan 180 microliter medium.

Voeg vervolgens 10 microliter van elke resulterende oplossing toe aan elk putje. Dat bevat al 200 microliter van de eerder genoemde oplossing van cellen in het medium om de uiteindelijke concentraties van de verbinding van maximaal 200 milligram per liter te geven. Elke lijn bevat cellen behandeld met de verbinding in 10 verschillende concentraties.

Een controleputje met cellen behandeld met alleen oplosmiddel en een putje zonder cellen Voor de blanco controle, stel de lijnen in om elke meting van de verbinding drie keer te herhalen. Incubeer de geladen plaat gedurende drie dagen bij 37 graden Celsius in een atmosfeer met 5% koolstofdioxide. Bereid de MTT-oplossing voor zoals beschreven in het tekstprotocol met behulp van een 11-kanaals pipette.

Voeg 20 microliter MTT-oplossing toe aan elk putje behalve de blanco controleputjes. Incubeer de plaat gedurende nog eens drie uur na incubatie. Verwijder de mediumoplossing uit elk putje en voeg 200 microliter isopropanol toe aan elk putje.

Om de formin op te lossen, roer de plaat gedurende 30 minuten tot homogeniteit. Meet de absorptie bij 550 nanometer voor 200 microliter van de homogene oplossing door een microplaatlezer, spectrofotometer en herhaal