Name: Anticancer Metal Complexen: Synthese en cytotoxiciteit Evaluatie door de MTT-test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Leer de synthese en evaluatie van antikankermetalloïgene middelen met de MTT-test. Deze methode bepaalt IC50-waarden voor titanium- en vanadiumcomplexen in humane kankercellijnen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De financiering werd onder het zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap (FP7/2007-2013) ontvangen van de European Research Council / ERC Grant overeenkomst geen [239603]

<ol><li> Voorbereiding van de V (V) complex (figuur 2); 18 gedragingen stappen 1,1-1,4 in een handschoen-box, als een handschoen-doos niet beschikbaar is, doorgaan naar de alternatieve stappen 2 (2,1-2,6). <ol><li> Los 0,42 mmol van de liganden H 2 L in droog THF toevoegen aan een geroerde oplossing van equivalente hoeveelheden van VO (O&#39;Pr) 3 in THF. </li><li> Roer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 min, en verwijdert de vluchtige stoffen onder vacuüm. </li><li> Voeg koude hexaan en verwijder deze onder vacuüm. Een donkerpaars poeder moet worden verkregen in een kwantitatieve opbrengst. </li><li> Weeg 8 mg van de verkregen verbinding in een Eppendorf buisje. Doorgaan naar stap 3. </li></ol></li><li> Bereid de V (V) complex met een Schlenk lijn. <ol><li> Ontbinden 0,42 mmol van het ligand H 2 L in droge THF in een droge Schlenkkolf met een septumdop, hechten aan een Schlenk lijn en toepassen afwisselend vacuüm / inert gas (N2 of Ar) omgevingen, het is aan te raden om drie s toe te passenuch rondes en wacht 2-5 min. op de vacuüm fases. </li><li> Voeg droge THF via een injectiespuit door het septum dop. </li><li> Voeg equivalente hoeveelheden van VO (O&#39;Pr) 3 in een THF-oplossing, die op soortgelijke wijze had voorbereid door het inhaken van een goede droge Schlenkkolf aan de lijn, het aanbrengen van een inerte atmosfeer en het toevoegen van de reagentia door middel van een spuit van de vanadium oplossing aan die van het ligand. </li><li> Roer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten en verwijder de vluchtige stoffen onder vacuüm, als er een probleem van onstabiele producten, voeren Schlenk soort destillatie van de vluchtige stoffen onder een inerte atmosfeer; gebruik inert gasstroom naar de gewenste glaswerk die was voorgedroogd hechten . </li><li> Voeg koude hexaan en verwijder deze onder vacuüm. Een donkerpaars poeder moet worden verkregen in een kwantitatieve opbrengst. </li><li> Weeg 8 mg van de verkregen verbinding in een Eppendorf buisje. </li></ol></li><li> Bereiding van de Ti (IV) complex (Figuur 2), 28 </sinschrijven&gt; gedrag stappen 3,1-3,3 in een handschoen-box, als een handschoen-doos niet beschikbaar is, past u de alternatieve stappen besproken voor de vanadium analoge (stap 2) dat een Schlenk lijn dienst plaats. <ol><li> Los 0,35 mmol van het ligand H 2 L in droog THF toevoegen aan een geroerde oplossing van equivalente hoeveelheden van Ti (O&#39;Pr) 4 in THF. </li><li> Roer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Verwijder de vluchtige stoffen onder vacuüm om een ​​gele product in een kwantitatieve opbrengst. </li><li> Weeg 8 mg van de verkregen verbinding in Eppendorf buisje. </li></ol></li><li> Bereiding van HT-29 cellen 96 putjes <ol><li> Cultuur HT-29 cellen in een 75 cm2 fles met RPMI-1640 medium dat 1% penicilline / streptomycine antibiotica, 1% L-glutamine en 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C met 5% CO2 bevat . </li><li> Verwijder het medium als de HT-29 cellen te bereiken maximale confluentie (90-100%, om de 3-4 dagen zonder subcultuur). Wassen met 1 mltrypsine (0,25%) / EDTA (0,05%) oplossing en verwijder deze. </li><li> Voeg 1 ml trypsine (0.25%) / EDTA (0,05%) oplossing en incubeer gedurende 5 minuten. </li><li> Maak de HT-29 cellen van de kolf en voeg 10 ml van het medium om de trypsine-activiteit uit te schakelen. Breng 5 ml van de cellen mengsel tot een buis. </li><li> Gebruik pipet een paar druppels van de cellen mengsel over in teller kamer. De teller kamer bevat 5 x 5 vierkanten. </li><li> Tel de cellen in 5 representatieve pleinen met behulp van een microscoop: de 4 vierkantjes in de hoeken en de een is dat in het midden. </li><li> Bereken het geraamde bedrag van cellen aanwezig. Tel de cellen in de 5 representatieve pleinen en delen door 20. </li><li> Verdeel 0.6 door het resultaat van stap 4.7. Het ontvangen nummer is de hoeveelheid celmengsel nodig per plaat. Deze berekening heeft betrekking op een plaat die 0,6 x 10 6 cellen (9000 cellen per well) bevat. </li><li> Gebruik pipet om de hoeveelheid celmengsel nodig per p overdragenlaat (zoals berekend in paragraaf 4.8) en voeg 13,2 ml van het medium (200 ul per putje × 66 putten). </li><li> Voeg het mengsel aan 96-wells plaat met 11-kanaals pipet (200 ul per putje 6 lijnen 66 putjes in totaal). Een goed van elke regel moet voor blanco controle leeg blijven. </li><li> Incubeer de platen bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 24 uur om de cellen te hechten aan de plaat. </li></ol></li><li> Insertie van de verbindingen <ol><li> Voeg 200 ul (of verschillende hoeveelheid afhankelijk van de gewenste concentratiebereik) droge THF tot 8 mg van elke verbinding gewogen zoals beschreven in stap 1.4 (of 2.6) en 3.3. Weeg 8 mg van de ligand H 2 L, ook. </li><li> Verdun elke verbinding oplossing verder door 60 gl THF 9 verschillende Eppendorf buisjes. </li><li> Breng met een pipet 60 ul van het mengsel in paragraaf 5.1 de eerste Eppendorf flesje, resuspendeer en overdracht 60 ul aan de volgende flesje, en zo verder tot 10 verschillende concentraties obtained (inclusief de ouderdieren mengsel in paragraaf 5.1). </li><li> Verdun 20 pi van elke concentratie in THF met 180 pl medium. </li><li> Bereid een controlevloeistof slechts THF, 20 pl THF met 180 ul medium in elk meting. </li><li> Voeg 10 ul van de verkregen oplossing (inclusief THF controle), aan elk putje waar al 200 pl van de bovengenoemde oplossing van cellen in het medium tot eindconcentraties van de verbinding van maximaal 200 mg / L geven (het concentratiebereik kan worden aangepast aan de verbinding activiteit). </li><li> U sommige precipitatie bij de hoogste concentratie verschilt naar gelang van de oplosbaarheid van de verbinding nemen. </li><li> Herhaal de meting van de samenstelling 3x (3 lijnen in de plaat van dezelfde verbinding); elke regel: cellen behandeld met de verbinding in 10 verschillende concentraties, 1 putje met cellen behandeld met oplosmiddel alleen voor controle en 1 goed zonder cellen blanco controle. </li><li> Incubeer de geladen plaat gedurende 3 dagen bij 37 ° C in 5% CO2 atmosfeer. </li></ol></li><li> Cytotoxiciteit meten met de MTT assay <ol><li> Bereid de MTT door toevoeging van 1 g MTT poeder een 200 ml oplossing van RPMI-1640 medium zonder fenol rood. De stamoplossing kan worden verdeeld over 15 ml buizen en opgeslagen in -20 ° C. </li><li> Voeg 20 ul MTT-oplossing aan elk putje met 11-kanaals pipet (behalve de blanco controleputjes zonder de cellen van stap 4.10) en incubeer de plaat gedurende nog 3 uur. </li><li> Verwijder het medium uit elk putje oplossing. </li><li> Voeg 200 ul isopropanol aan elke well formazan te lossen. Roer de plaat gedurende 0,5 uur tot homogeniteit is bereikt. </li><li> Meet de absorptie bij 550 nm van 200 pl van de bovengenoemde oplossing met een spectrofotometer microplaat lezer. </li><li> Herhaal elke meting (dat is inclusief 3 herhalingen, zie stap 5.8) op 3 verschillende dagen. </li><li> Bereken tHij percentage levensvatbaarheid van de cellen verminderd met het blanco controle absorptiewaarde van de gemeten waarde, het resultaat te delen door de absorptie van de THF-oplossingen controlewaarde en vermenigvuldigen met 100%. </li><li> Bereken IC50 waarden met GraphPad Prism software (of gelijkwaardig). </li><li> De gerapporteerde IC50 is het gemiddelde van IC50 waarden verzameld op ten minste drie verschillende dagen, en de foutwaarde de standaarddeviatie. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+in+vitro+cytotoxicity+assays+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 3, 655-669 (2008).</li>
<li>Hatok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+for+the+evaluation+of+drug+resistance+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vitro assays for the evaluation of drug resistance in tumor cells.</a> Clinical and Experimental Medicine. 9, 1-7 (2009).</li>
<li>Wang, D., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+processing+of+platinum+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cellular processing of platinum anticancer drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).</li>
<li>Muggia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platinum+compounds+30+years+after+the+introduction+of+cisplatin%3A+Implications+for+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Platinum compounds 30 years after the introduction of cisplatin: Implications for the treatment of ovarian cancer.</a> Gynecologic Oncology. 112, 275-281 (2009).</li>
<li>Bruijnincx, P. C., Sadler, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+trends+for+metal+complexes+with+anticancer+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">New trends for metal complexes with anticancer activity.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 12, 197-206 (2008).</li>
<li>Ott, I., Gust, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non+platinum+metal+complexes+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+der+Pharmazie+%28Weinheim%22%5BJournal%5D)">Non platinum metal complexes as anti-cancer drugs.</a> Archiv der Pharmazie (Weinheim. 340, 117-126 (2007).</li>
<li>Desoize, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metals+and+metal+compounds+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Metals and metal compounds in cancer treatment.</a> Anticancer Research. 24, 1529-1544 (2004).</li>
<li>Jakupec, M. A., Galanski, M., Arion, V. B., Hartinger, C. G., Keppler, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumour+metal+compounds%3A+more+than+theme+and+variations%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">Antitumour metal compounds: more than theme and variations.</a> Dalton Transactions. , 183-194 (2008).</li>
<li>Meléndez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+complexes+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Titanium complexes in cancer treatment.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 309-315 (2002).</li>
<li>Evangelou, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanadium+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Vanadium in cancer treatment.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 249-265 (2002).</li>
<li>Djordjevic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+of+vanadium+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Metal+ions+in+biological+systems%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity of vanadium compounds.</a> Metal ions in biological systems. 31, 595-616 (1995).</li>
<li>Caruso, F., Rossi, M., Pettinari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+titanium+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Patents%22%5BJournal%5D)">Anticancer titanium agents.</a> Expert Opinion on Therapeutic Patents. 11, 969-979 (2001).</li>
<li>Caruso, F., Rossi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+titanium+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Mini-Review+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antitumor titanium compounds.</a> Mini-Review in Medicinal Chemistry. 4, 49-60 (2004).</li>
<li>Kostova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+and+vanadium+complexes+as+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-Cancer+Agents+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Titanium and vanadium complexes as anticancer agents.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 9, 827-842 (2009).</li>
<li>Tshuva, E. Y., Ashenhurst, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+Titanium%28IV%29+Complexes%3A+Renaissance%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic Titanium(IV) Complexes: Renaissance.</a> European Journal of Inorganic Chemistry. , 2203-2218 (2009).</li>
<li>Buettner, K. M., Valentine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinorganic+Chemistry+of+Titanium%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bioinorganic Chemistry of Titanium.</a> Chemical Reviews. 112, 1863-1881 (2012).</li>
<li>Meker, S., Margulis-Goshen, K., Weiss, E., Magdassi, S., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+antitumor+activity+of+highly+resistant+salan-titanium%28IV%29+complexes+in+nanoparticles%3A+an+identified+active+species%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+in+English%22%5BJournal%5D)">High antitumor activity of highly resistant salan-titanium(IV) complexes in nanoparticles: an identified active species.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 51, 10515-10517 (2012).</li>
<li>Reytman, L., Braitbard, O., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+cytotoxic+vanadium%28V%29+complexes+of+salan+ligands%3B+insights+on+the+role+of+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">Highly cytotoxic vanadium(V) complexes of salan ligands; insights on the role of hydrolysis.</a> Dalton Transactions. 41, 5241-5247 (2012).</li>
<li>Tzubery, A., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+and+Hydrolysis+of+trans-Ti%28IV%29+Complexes+of+Salen+Ligands%3A+Structure-Activity+Relationship+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity and Hydrolysis of trans-Ti(IV) Complexes of Salen Ligands: Structure-Activity Relationship Studies.</a> Inorganic Chemistry. 51, 1796-1804 (2012).</li>
<li>Tshuva, E. Y., Peri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+cytotoxic+titanium%28IV%29+complexes%3B+Insights+on+the+enigmatic+involvement+of+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Coordination+Chemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Modern cytotoxic titanium(IV) complexes; Insights on the enigmatic involvement of hydrolysis.</a> Coordination Chemistry Reviews. 253, 2098-2115 (2009).</li>
<li>Shavit, M., Peri, D., Manna, C. M., Alexander, J. S., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+cytotoxic+reagents+based+on+non-metallocene+non-diketonato+well-defined+C-2-symmetrical+titanium+complexes+of+tetradentate+bis%28phenolato%29+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Active cytotoxic reagents based on non-metallocene non-diketonato well-defined C-2-symmetrical titanium complexes of tetradentate bis(phenolato) ligands.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 12098-12099 (2007).</li>
<li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Colorimetric+Assay+for+Cellular+Growth+and+Survival+-+Application+to+Proliferation+and+Cyto-Toxicity+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival - Application to Proliferation and Cyto-Toxicity Assays.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (83), 55-63 (1983).</li>
<li>Ahmadian, S., Barar, J., Saei, A. A., Fakhree, M. A. A., Omidi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Toxicity+of+Nanogenomedicine+in+MCF-7+Cell+Line%3A+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1191(2009).</li>
<li>Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hepatic+subcellular+fractions+for+Alamar+blue+and+MTT+reductase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity.</a> Toxicology in Vitro. 15, 257-259 (2001).</li>
<li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Colorimetric+Assay+for+Cell-Growth+and+Survival+-+Modifications+to+the+Tetrazolium+Dye+Procedure+Giving+Improved+Sensitivity+and+Reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid Colorimetric Assay for Cell-Growth and Survival - Modifications to the Tetrazolium Dye Procedure Giving Improved Sensitivity and Reliability.</a> Journal of Immunological Methods. 89, 271-277 (1986).</li>
<li>Alley, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+drug+screening+with+panels+of+human+tumor+cell+lines+using+a+microculture+tetrazolium+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay.</a> Cancer Research. 48, 589-601 (1988).</li>
<li>Weyermann, J., Lochmann, D., Zimmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+note+on+the+use+of+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">A practical note on the use of cytotoxicity assays.</a> International Journal of Pharmaceutics. 288, 369-376 (2005).</li>
<li>Chmura, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+4+complexes+with+aminebisphenolate+ligands+and+their+application+for+the+ring+opening+polymerization+of+cyclic+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Group 4 complexes with aminebisphenolate ligands and their application for the ring opening polymerization of cyclic esters.</a> Macromolecules. 39, 7250-7257 (2006).</li>
<li>Sebaugh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+accurate+EC50%2FIC50+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Statistics%22%5BJournal%5D)">Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation.</a> Pharmaceutical Statistics. 10, 128-134 (2011).</li>
<li>Yung, W. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Chemosensitivity+Testing+and+its+Clinical-Application+in+Human+Gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgical+Review%22%5BJournal%5D)">In vitro Chemosensitivity Testing and its Clinical-Application in Human Gliomas.</a> Neurosurgical Review. 12, 197-203 (1989).</li>
<li>McCarthy, N. J., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCarthy%2C+NJ+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22">Current Topics in Developmental Biology</a>. 36, 259-278 (1997).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

De methode combineert dit manuscript beschreven chemische synthese met biologische cellevensvatbaarheid assay. Zoals bij elke biologische methoden betreffende levensvatbare cellen, is het essentieel om te werken in een laminaire kap en onderhouden steriele omstandigheden, inclusief het gebruik van steriele organische oplosmiddelen. Ook, bereiding en opslag van instabiel voor hydrolyse metaal gebaseerde geneesmiddelen moeten worden uitgevoerd onder inerte omstandigheden, waarvoor handschoenenkastje of Schlenk lijn techni...

Chemotherapie is nog steeds een van de belangrijkste reeksen behandelingen die in de kliniek voor diverse kanker ziekten, en dus enorme hoeveelheid onderzoek is wereldwijd uitgevoerd teneinde nieuwe en verbeterde geneesmiddelen tegen kanker te ontwikkelen. Dergelijke studies meestal beginnen op chemisch niveau, met het ontwerp en de bereiding van verbindingen, gevolgd door biologische evaluatie van de cytotoxische eigenschappen in vitro. Levensvatbaarheid van de cellen kan worden beoordeeld door de verschillende testen die informatie over de cellulaire activiteit 1-2 bieden. Cisplatine is een voorbeeld van een platina complex dat veel gebruikt wordt als een chemotherapeutisch middel, dat wordt beschouwd als een efficiënte behandeling voornamelijk testis en ovarium 3-4. Echter, de smalle activiteit bereik en ernstige bijwerkingen veroorzaken studies van andere krachtige overgangsmetaalcomplexen 5-8. Onder andere, titaan (IV) en vanadium (V)-complexen waren veelbelovend hoogactieve en verminderdetoxiciteit 9-16. Ti (IV)-complexen werden de eerste klinische fase te starten na cisplatine vanwege deze eigenschappen, maar hebben ze niet de onderzoeken vanwege formulering moeilijkheden en hydrolytische instabiliteit. Er is dus een huidige behoefte aan verbeterde derivaten van deze metaalcomplexen die hoge antikanker activiteit kan combineren met waterbestendigheid 15,17-21 ontwikkelen. Een uitdaging bij de bereiding van Ti (IV) en V (V) complexen betrekking op de hydrolytische instabiliteit van de precursor reagentia en derhalve dient inerte atmosfeer gehandhaafd. De bereiding van Ti (IV) en V (V) verbindingen wordt uitgevoerd onder N2 of Ar omstandigheden in een zuurkast of via Schlenk lijn-technieken. Een gemeenschappelijke methode voor het evalueren van de activiteit tegen kanker is het MTT (3 - (4,5-dimethylthiazolyl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide) assay. Deze test is een colorimetrische test die de levensvatbaarheid in 1983 door Mosmann22. Het is zeer goed bestudeerd en gekarakteriseerd, en het wordt beschouwd als zeer efficiënt bij de beoordeling van de effectiviteit van nieuwe cytotoxische verbindingen vanwege zijn precisie, snelheid en zijn vermogen aan te brengen op diverse cellijnen. De levensvatbaarheid assay is gebaseerd op de kleurverandering van de MTT molecuul wanneer het wordt blootgesteld aan levensvatbare cellen. Meting van de absorptie, die evenredig is met het aantal levensvatbare cellen, en vergelijking met onbehandelde controles, maakt beoordeling van de celgroei remming mogelijkheden van de geteste verbinding. De MTT-colorimetrische test wordt uitgevoerd in een 96-putjes 23. De cellen kunnen voorincubatie in de putjes voor de toevoeging van het geteste geneesmiddel vereisen. De pre-incubatie kunnen variëren 0-24 uur afhankelijk van de cellijn eigenschappen. Cellen worden gewoonlijk blootgesteld aan het geneesmiddel 24-96 uur afhankelijk van de drugactiviteit. MTT oplossing wordt vervolgens toegevoegd aan de behandelde cellen, waarbij de schreeuwenow MTT paars formazan verminderd verschillende mitochondriale en cytosolische enzymen die operationeel in levensvatbare cellen (figuur 1) 24 zijn. De MTT molecuul wordt niet verminderd door dode cellen of rode bloedcellen (metabolisch inactieve cellen), miltcellen (rustende cellen) en concanavaline-A gestimuleerde lymfocyten (geactiveerde cellen) 22. Na 3-4 uur incubatie met MTT de formazan precipitaten. De vorming van formazan begint na 0,5 uur incubatie maar voor een optimaal resultaat is het het beste om de cellen bloot te MTT tenminste 3 uur 22. Bijgevolg wordt het groeimedium verwijderd en de formazan wordt opgelost in een organisch oplosmiddel, bij voorkeur isopropanol 25, hoewel DMSO kan worden gebruikt 26. De eliminatie van het medium is cruciaal om nauwkeurige resultaten omdat fenolrood, die op grote schaal voor in groeimedium en neerslaan eiwitten kunnen interfereren met de absorptie meting 25. Wanneer de formazan oplossing bereikt homogeen, de extinctie van de oplossing wordt gemeten met een spectrofotometer microplaat lezer. De absorptie bij 550 nm is recht evenredig met het aantal cellen in het bereik van 200-50,000 cellen per putje, en dus zeer kleine hoeveelheden cellen kan worden gedetecteerd 22. De absorptie geeft de hoeveelheid levensvatbare cellen die overblijven na behandeling met het geneesmiddel, en vergeleken met de absorptie van controlecellen die niet werden blootgesteld aan het geneesmiddel. Analyse van de resultaten op juiste software geeft de IC50 (inhibitie concentratie 50%) waarden en hun statistische fouten gebaseerd op verschillende herhalingen van de meting. De MTT test is algemeen gebruikelijk in cytotoxiciteit studies voor het screenen van nieuwe anti-kanker verbindingen, vanwege zijn relatieve eenvoud en nauwkeurigheid. Wanneer echter de MTT assay, die afhankelijk enzymatische reactie moet men overwegen dat verschillende remmers opstelling kan de reductie van MTT eend leiden tot verkeerde resultaten 27. Bovendien is de MTT-bepaling geen enkele informatie over het moleculaire mechanisme van de cytotoxische activiteit van het geneesmiddel 2.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagens/Materiaal</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>Hexaan AR</td><td>Gadot</td><td>830122313</td><td>Gedroogd met behulp van een oplosmiddeldroogsysteem</td></tr><tr><td>HT-29 cellijn</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol AR</td><td>Gadot</td><td>830111370</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655-1G</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine antibiotica</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 met fenolrood met L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI zonder fenolrood</td><td>Biological Industries</td><td>01-103-1A</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuraan (THF) AR</td><td>Gadot</td><td>830156391</td><td>gedroogd met behulp van een oplosmiddeldroogsysteem</td></tr><tr><td>Ti(OiPr)4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>205273-500ML</td><td>vochtgevoelig</td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>VO(OiPr)3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>404926-10G</td><td>vochtgevoelig</td></tr><tr><td colspan="4">Apparatuur</td></tr><tr><td>12-kanaals pipette 30-300 &mu;l</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12-kanaals pipette 5-50 &mu;l</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 flacon</td><td>NUNC</td><td>156472</td><td></td></tr><tr><td>96-wells plaat met deksel (platte bodem)</td><td>NUNC</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Binder</td><td>APT.line C150</td><td></td></tr><tr><td>Tellkamer</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>650030</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf buisje</td><td>KARTELL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Handschoenenkast</td><td>M. Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminare stroomkap</td><td>ADS LAMINAIRE</td><td>OPTIMALE 12</td><td></td></tr><tr><td>Microplaatlezer spectrofotometer</td><td>Bio-Tek</td><td>El-800</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 20-200 &mu;l</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette 5-50 &mu;l</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

anticancer metal complexen: synthese en cytotoxiciteit evaluatie door de mtt-test

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Titaan (IV) en vanadium (V)-complexen zeer krachtige anti-kanker middelen. Een uitdaging in hun synthese verwijst naar hun hydrolytische instabiliteit derhalve hun bereiding onder een inerte atmosfeer uitgevoerd. Evaluatie van de antikanker activiteit van deze complexen kunnen worden bereikt door de MTT-bepaling. De MTT test is een colorimetrische levensvatbaarheid-assay gebaseerd op enzymatische reductie van MTT tot formazan molecuul wanneer het wordt blootgesteld aan levensvatbare cellen. Het resultaat van de reductie is een kleurverandering van de MTT molecuul. Absorptiemetingen opzichte van een controle bepalen percentage resterende levensvatbare kankercellen na de behandeling met verschillende concentraties van de geteste verbinding, die wordt omgezet naar de verbinding antikanker activiteit en de IC50-waarden. De MTT-test is algemeen gebruikelijk in cytotoxiciteit studies vanwege zijn nauwkeurigheid, snelheid en relatieve eenvoud. Hierin hebben we pregaf een gedetailleerd protocol voor de synthese van lucht gevoelige metaal gebaseerde geneesmiddelen en cellevensvatbaarheid metingen, inclusief voorbereiding van de celplaten, incubatie van de verbindingen met de cellen, de levensvatbaarheid met de MTT-bepaling en de bepaling van IC50-waarden.

De complexen werden opgesteld op basis van vastgestelde procedures 18,28 en hun zuiverheid kan worden beoordeeld met behulp van NMR en elementaire analyse. De van de MTT assay gegevens geanalyseerd om de cytotoxiciteit van de verbinding 18,21 evalueren. Eerst wordt aftrekken van de blanco controle absorptiewaarde van alle andere waarden uitgevoerd. Ten tweede wordt de THF-oplossingen regelwaarde op 100% levensvatbaarheid als geen groei remmende verbinding werd toegevoeg...

Werkwijze voor de synthese van lucht-gevoelige titaan en vanadium antikankermiddelen wordt beschreven, samen met de evaluatie van hun cytotoxische activiteit voor humane kankercellijn de MTT assay.

Anticancer Metal Complexen: Synthese en cytotoxiciteit Evaluatie door de MTT-test

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

Het algemene doel van deze procedure is het bereiden van antikanker-metallofarmaca en het evalueren van hun cytotoxiciteit via de MTT-assay. Dit wordt bereikt door eerst metaalgebaseerde antikankerverbindingen te synthetiseren. De tweede stap is het voorbereiden van 96-wells platen met kankercellen.Vervolgens worden de op metalen gebaseerde anti-kankerverbindingen in de kankercellen gebracht. De laatste stap is het meten van de celviabiliteit via de MTT-assay, waarbij de reductie van MTT door mitochondriale en cytosolische enzymen tot formazan wordt gemeten om uiteindelijk de anti-kankeractiviteit en de halfmaximale inhiberende concentratie te bepalen. De IC50-waarden van de verbindingen worden zo vastgesteld.Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het een procedure in meerdere stappen is die de volledige aandacht van de laboratoriummedewerker vereist en volgens een strikt tijdschema verloopt. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de bereiding van de celplaat niet eenvoudig is, omdat het werken met levensvatbare cellen vereist dat specifieke richtlijnen worden gevolgd. Bereid, werkend in een glovebox, het van

anticancer-metal-complexes-synthesis-cytotoxicity-evaluation-mtt

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

De MTT assay is een eenvoudige en reproduceerbare colorimetrische assay voor de evaluatie van de levensvatbaarheid van de cel op basis van vermindering van de geel MTT en de productie van water oplosbare paarse formazan. Hier heeft de levensvatbaarheid van MCF-7 cellen na behandeling van nanogenomedicine geëvalueerd.

Cellulaire toxiciteit van Nanogenomedicine in MCF-7 cellijn: MTT-test

This video describes the colorimetric assay, methyl thiazole tetrazolium (MTT) assay, to measure drug-induced cytotoxicity in cancer cells and determine their metabolic activity. This assay is based on the metabolic conversion of tetrazolium salts into colored products, reflecting the mitochondrial activity of cells.

Methyl Thiazolyl Tetrazolium or MTT Assay: A Colorimetric Assay to Measure Drug Resistance via Determination of Metabolic Activity in Cancer Cells

Hier wordt real-time monitoring van het metabolisme van tumorcellen, gecombineerd met een in vivo kippenembryo chorio-allantoïsche membraan (CAM) model van metastase, gebruikt om nieuwe anti-kanker doelen/middelen te evalueren op hun vermogen om tumorcellen te sensitiviseren voor DNA-beschadigende chemotherapeutica.

Het evalueren van de effectiviteit van Cancer Drug Overgevoeligheid<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

Dit protocol wordt beschreven hoe synergie tussen een antikanker antilichaam en Antineoplastische drugs in preklinische modellen met behulp van de combinatie index vergelijking van Chou en Talalay beoordelen.

Potentiëring van antikanker antilichaam werkzaamheid door Antineoplastische Drugs: detectie van antilichaam-drug synergie met de combinatie Index vergelijking

Het protocol beschrijft een snelle, hoge doorvoer, betrouwbare, goedkope en onpartijdige test voor het efficiënt bepalen van cellulaire levensvatbaarheid. Deze test is vooral handig wanneer de mitochondriën van cellen zijn beschadigd, wat interfereert met andere tests. De test maakt gebruik van geautomatiseerd tellen van cellen bevlekt met twee nucleaire kleurstoffen - Hoechst 33342 en propidium jodide.

Een geautomatiseerde differentiële nucleaire kleuringtest voor nauwkeurige bepaling van Mitocan Cytotoxicity

Deze methodologie is gericht op het evalueren van biomateriaal cytotoxiciteit door de bereiding van oplosbare extracten, met behulp van levensvatbaarheidstests en fenotypische analyse, waaronder flowcytometrie, RT-PCR, immunocytochemie en andere cellulaire en moleculaire biologietechnieken.

Toegang tot de cytotoxiciteit en celrespons op biomaterialen

Hier beschrijven we een bioassay met behulp van 3-(4′,5′-dimethylthiazol-2′-yl)-2,5- difenyltetrazoliumbromide (MTT) om eerder gesynthetiseerde spirocyclische oximen te testen.

Gefunctionaliseerde spirocyclische heterocyclussynthese en cytotoxiciteitstest

Dit protocol presenteert een geautomatiseerde, op afbeeldingen gebaseerde high-throughput-techniek om verbindingen te identificeren die natural killer cel-gemedieerde borstkankerceldoding moduleren in de aanwezigheid van een therapeutisch anti-HER-2-antilichaam.

High-Content screening assay voor de identificatie van antilichaam-afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit modificerende verbindingen

De farmacologische targeting van ionkanalen is een veelbelovende benadering voor de behandeling van solide tumoren. Gedetailleerde protocollen worden verstrekt voor het karakteriseren van ionkanaalfunctie in kankercellen en het testen van de effecten van ionkanaalmodulatoren op de levensvatbaarheid van kanker.

Screening van ionkanalen in kankercellen

Hier presenteren we een methode om verbindingen te identificeren die het ADCC-mechanisme moduleren, een belangrijk kankerceldodend mechanisme van antitumorantilichamen. Het cytotoxische effect van NK-cellen wordt gemeten in sferoïden van borstkankercellen in aanwezigheid van Trastuzumab. Beeldanalyse identificeert levende en dode killer- en doelcellen in sferoïden.

Kwantificering van antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit in een tumorsferoïde model: aanvraag voor ontdekking van geneesmiddelen

Hier presenteren we een protocol voor een antilichaamafhankelijke, celgemedieerde cytotoxiciteit (ADCC) assay met behulp van een ADCC-bioassaykit. Deze methode biedt een waardevol hulpmiddel voor het ophelderen van het ADCC-mechanisme en het evalueren van het therapeutisch potentieel van antilichamen in kankerimmunotherapie.

Beoordeling van antilichaamafhankelijke, celgemedieerde cytotoxiciteit in kankercellen met behulp van antilichaamafhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit Reporter Bioassay

Leer de synthese en evaluatie van antikankermetalloïgene middelen met de MTT-test. Deze methode bepaalt IC50-waarden voor titanium- en vanadiumcomplexen in humane kankercellijnen.

Anticancer Metal Complexen: Synthese en cytotoxiciteit Evaluatie door de MTT-test

Meer video's verkennen