Name: In vitro onderzoek naar de impact van immunoregulatoire Pathways op HIV-specifieke CD4 T-cellen Effectorfunctiemanipulatie Evalueer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Leer een in vitro-assay om immunoregulatoire paden in HIV-specifieke CD4 T-cellen te onderzoeken met behulp van antilichaamblokkade. Deze methode helpt onderzoekers bij het analyseren van cytokinesecretie en het herstel van effectorfunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Gordon Freeman voor het verstrekken van de anti-PD-L1 blokkerend antilichaam. Wij danken de klinische en laboratorium personeel van het Massachusetts General Hospital en alle deelnemers aan de studie voor hun waardevolle rol in dit project. Deze studie werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten van de National Institutes of Health (PO1 AI-080192; DEK), de National Heart Lung and Blood Institute van de National Institutes of Health (RO1 HL-092565; DEK). DEK wordt ondersteund door een Research Scholar Career Award van de Quebec Research Fund Health (FRQS). FP wordt ondersteund door een fellowship subsidie ​​van het Massachusetts General Hospital Uitvoerend Comite voor onderzoek en de Harvard Global Health Institute (HGHI).

1. Uitputting en Isolatie van PBMC via Ficoll scheiding <ol><li> Afbrekende CD8 + T cellen door menselijke CD8 + Uitputting Cocktail toevoegen van 50 ul / ml volbloed. </li><li> Meng goed en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (18-25 ° C). </li><li> Na incubatie mengen volbloed met HBSS (Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing zonder Ca 2 + of Mg 2 +) en laag over Histopaque. Spin bij 340 RCF gedurende 30 min (geen rem, trage acceleratie). </li><li> Verzamelen PBMC en over te dragen aan een nieuwe 50 ml conische. Wassen met 2x 45 ml RPMI 1640 aangevuld met 50 IU penicilline, 50 ug / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine en 1% HEPES door spinnen gedurende 10 minuten bij 340 RCF. </li></ol> 2. Antilichaam Blokkade en Antigeen-Specifieke Stimulatie van Cellen <ol><li> Resuspendeer cellen bij 2x10 6 per conditie in RPMI 1640 dat 10% menselijk serum aangevuld met 50 IU penicilline, 50 ug / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine en 1% HEPES,goed voor 500 ul per conditie. </li><li> Aliquot 500 pi celsuspensie per FACS buis. </li><li> Afhankelijk van de route onderzochte voeg PD-L1, IL-10Rα blokkerende antilichamen en / of isotype controles bij 10 ug / ml en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> Stimuleer cellen met een HIV-1 Gag peptide zwembad bij 1 ug / ml / peptide uiteindelijke concentratie. Ook een &quot;geen stimulatie&quot; controle voor elke blokkerende aandoening. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 48 uur. </li></ol> 3. Verzameling en analyse van Supernatant <ol><li> Na 48 uur, spin down FACS buizen voor 7 min bij 340 RCF. </li><li> Verzamel zorgvuldig de 2 x 225 pi supernatant in Eppendorf buizen voor Luminex bead arrays zonder de pellet te verstoren. </li><li> Inactiveren virus in het verzamelde supernatant met 25 pi 0,5% Tween-PBS tot een eindconcentratie van 0,05% PBS-Tween geven. </li><li> Store verzameld bovenstaande vloeistoffen die niet IMMEDiately in een -80 ° C vriezer. </li><li> Meet gewenste cytokine concentraties met behulp van Millipore Luminex kit volgens protocol van de fabrikant. </li></ol> 4. Collectie en fenotypische analyse van cellen via flowcytometrie <ol><li> Na het verzamelen supernatant, wassen cellen in 3 ml PBS. Spin cellen gedurende 7 minuten bij 340 RCF en giet overtollig wassen. </li><li> Vlek voor levensvatbaarheid met een levende / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Was de cellen in PBS gedurende 7 minuten bij 340 RCF en bij 4 ° C. Resuspendeer in 100 pl PBS 1% FBS. </li><li> Indien kleuring op monocyten of andere antigeen presenterende cellen, blok Fc receptoren door het toevoegen 1,4 ui FcR blokkerende reagens en vortex mengen. </li><li> Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C. </li><li> Voeg oppervlak antilichamen, vortex en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C in het donker. </li><li> Was de cellen met PBS 1% FBS, decanteren teveel wassen, en voeg 200 ul 4% paraformaldehyde. Broedenbij kamertemperatuur gedurende 20 min in het donker. </li><li> Was de cellen met PBS 1% FBS, resuspendeer in 250 pi PBS 1% FBS, en het verwerven van een multilaser flowcytometer (bijv. BD LSRII of Fortessa). </li></ol> 5. Analyse van de cellen via qRT-PCR <ol><li> Voor cellen niet geanalyseerd via flowcytometrie: na de inzameling supernatant, Lyse cellen in 300 pi Qiagen Buffer RLT die 1% beta-mercapto-ethanol. Bij stopzetting met protocol, kunnen cellen bij -80 ° C worden ingevroren na dit punt. </li><li> Isoleer RNA met een RNA isolatie kit volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Samenstel cDNA uit RNA met een cDNA synthese kit volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Uitvoeren van kwantitatieve PCR met SYBR Green technologie. </li><li> Een primer mix voor elke primer gebruikt, waaronder huishoudelijke genen (bijvoorbeeld IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH) door toevoeging primers voor nuclease-vrij water tot een eindconcentratie van 10 gevenuM. Blijf op ijs. </li><li> Maak een master mix voor elke primer door het toevoegen van 10,5 ul nuclease-vrij water, 12,5 ul SYBR groen, en 1 ui primer mix per plaat ook. Blijf op ijs. </li><li> Pipet 24 pi master mix in elk putje van de plaat die zal worden gebruikt. </li><li> Voeg 1 ul cDNA aan elk putje volgens template. </li><li> Cap putten en centrifuge plaat gedurende 3 min bij 800 RCF. </li><li> Run plaat op een qRT-PCR machine, bijvoorbeeld een Stratagene MX3005P instrument. </li></ol> 6. Aanpassing voor intracellulaire cytokine kleuring in 48 uur Voeg Brefeldine en Monensin 6 uur vóór intracellulaire cytokine kleuring. Brefeldine wordt toegevoegd in een concentratie van 10 ug / ml terwijl Monensin toegevoegd volgens de instructies van de fabrikant. Gemakshalve kan Brefeldine 12 uur vóór vlek bij een concentratie van 5 ug / ml toegevoegd. <ol><li> Na aanslag op het oppervlak, wassen cellen met PBS 1% FBS en vlek inextracellulaire cytokinen zoals IL-12, IFN-γ en TNF-α met een fixatie / permeabilisatie oplossing kit en protocol. </li><li> Was de cellen, resuspendeer in 250 pi PBS 1% FBS, en draaien op een multilaser flowcytometer (bijv. BD LSR II of Fortessa). </li></ol> 7. Aanpassing voor sorteren Cellen <ol><li> 16 uur na stimulatie, vlek voor levensvatbaarheid gebruik van Live / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit volgens het protocol van de fabrikant. Houd cellen op ijs tijdens gehele procedure. </li><li> Was de cellen met PBS gedurende 7 minuten bij 340 RCF en bij 4 ° C. Resuspendeer in 100 pl PBS 1% FBS. </li><li> Voeg oppervlak antilichamen, vortex mengen en incuberen cellen op ijs in het donker gedurende 20 minuten. </li><li> Was de cellen met PBS 1% FBS bij 340 RCF en bij 4 ° C en resuspendeer in 500 ul koud RPMI 1640 dat 10% foetaal runderserum aangevuld met 50 IU penicilline, 50 ug / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine en 1% HEPES. </li><li> Filter cellen met 5 ml polystyreenrene ronde bodem buis met Cell-zeef cap. </li><li> Bereid verzamelbuizen voor sorteren door toevoeging 200 pl RPMI 1640 dat 10% foetaal runderserum aangevuld met 50 IU penicilline, 50 ug / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine en 1% HEPES aan elke buis. Houd alle buizen op ijs tijdens het sorteren. </li><li> Live-sorteren van de cel subsets van de rente op een instrument (bijv. BD FACS Aria II) gelegen in een voorziening die is uitgerust voor biologisch gevaarlijk materiaal. </li><li> Nadat de cellen werden gesorteerd, plaats cellen terug in de incubator voor de gewenste tijdsduur en volgen verzameling supernatant / Luminex analyse en celpellet verzameling / PCR analyse. </li></ol>

<ol><li>Zajac, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+immune+evasion+due+to+persistence+of+activated+T+cells+without+effector+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function.</a> J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).</li>
<li>Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+persistence+alters+CD8+T-cell+immunodominance+and+tissue+distribution+and+results+in+distinct+stages+of+functional+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment.</a> J. Virol. 77, 4911-4927 (2003).</li>
<li>Kwon, D. S., Kaufmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+detrimental+roles+of+IL-10+in+HIV+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Cytokine+Netw%22%5BJournal%5D)">Protective and detrimental roles of IL-10 in HIV pathogenesis.</a> Eur. Cytokine Netw. 21, 208-214 (2010).</li>
<li>Porichis, F., Kaufmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+PD-1+in+HIV+pathogenesis+and+as+target+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+HIV%2FAIDS+Rep%22%5BJournal%5D)">Role of PD-1 in HIV pathogenesis and as target for therapy.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 9, 81-90 (2012).</li>
<li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat%22%5BJournal%5D)">T cell exhaustion.</a> Nat. 12, 492-499 (2011).</li>
<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+PD-1+expression+on+HIV-specific+CD8%2B+T+cells+leads+to+reversible+immune+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction.</a> Nat. Med. 12, 1198-1202 (2006).</li>
<li>Day, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+expression+on+HIV-specific+T+cells+is+associated+with+T-cell+exhaustion+and+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression.</a> Nature. 443, 350-354 (2006).</li>
<li>Brockman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+is+up-regulated+in+multiple+cell+types+during+viremic+HIV+infection+and+reversibly+inhibits+virus-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-10 is up-regulated in multiple cell types during viremic HIV infection and reversibly inhibits virus-specific T cells.</a> Blood. 114, 346-356 (2009).</li>
<li>Barber, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+function+in+exhausted+CD8+T+cells+during+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection.</a> Nature. 439, 682-687 (2006).</li>
<li>Zhang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+up-regulation+is+correlated+with+HIV-specific+memory+CD8%2B+T-cell+exhaustion+in+typical+progressors+but+not+in+long-term+nonprogressors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors.</a> Blood. 109, 4671-4678 (2007).</li>
<li>Ndhlovu, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+immunomonitoring+models+of+HIV-1-specific+CD8+T-cell+responses+accurately+identify+subjects+achieving+spontaneous+viral+control%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control.</a> Blood. 121, 801-811 (2013).</li>
<li>Porichis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+of+HIV-specific+CD4+T+cells+to+PD-1+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade.</a> Blood. 118, 965-974 (2011).</li>
<li>Kwon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+CD25%2B+regulatory+T+cells+impair+HIV-1-specific+CD4+T+cell+responses+by+upregulating+interleukin-10+production+in+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes.</a> 86, 6586-6594 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Supernatant collectie is een noodzakelijk onderdeel van dit experimenteel ontwerp. Bij het oogsten supernatanten van de Luminex test werden monsters gemaakt en bewaard bij -80 ° C tot eiwitafbraak door cycli bevriezen-ontdooien te voorkomen. Invriezen en ontdooien kan hard werkwijzen voor eiwitten en door het minimaliseren van vries-dooi, wordt signaal gemaximaliseerd assays. Daarom is het makkelijker reproduceerbare en nauwkeurige gegevens te verkrijgen bij het werken vanuit monsters die zijn bevroren en ontdooid hetze...

Tijdens aanhoudende virale infecties, virus-specifieke T-cellen te verwerven functionele stoornissen in een proces dat bekend staat als T-cel uitputting. Vroeg in vivo studies in muizen LCMV van chronische virale infectie aangegeven uitgeputte virus-specifieke T-cellen cytolytische functie verminderde tegen viraal geïnfecteerde cellen verliezen hun vermogen om te prolifereren en vermogen om cytokinen zoals IL-2, TNF-productie verminderde α en IFN-γ 1,2. Een complex netwerk van immuunregulerende paden, zoals PD-1 en IL-10, opgereguleerd tijdens chronische infecties en bijdragen T-cel dysfunctie (besproken in 3,4). In vivo toediening van blokkerende antilichamen tegen deze remmende trajecten in de LCMV muis model herstelde functie van uitgeputte virus-specifieke T-cellen en versterkte virale klaring, wat aangeeft dat T-cel uitputting is een gedeeltelijk reversibel fenomeen (beoordeeld in 5). Bevindingen op the LCMV model werd snel uitgebreid naar menselijke chronische virale infecties zoals HBV, HCV en HIV 5. Bij chronische HIV-1 infectie zijn PD-1 en IL-10 trajecten opgereguleerd in geïnfecteerde personen en parameters correleren met ziekteprogressie, rechtstreeks bij de virale lading en omgekeerd met de CD4 telling 6-8. Antilichaam blokkade van de PD-1 of IL-10 trajecten in vitro hersteld proliferatie van HIV-specifieke CD4 en CD8 T-cellen aangeeft dat, vergelijkbaar met de LCMV muismodel T cel uitputting bij mensen is een gedeeltelijk reversibel fenomeen. Echter, vanwege de delicate aard van experimenten op de menselijke monsters, alsook beperkingen in de gevoeligheid van in vitro assays, grondig onderzoek van het functionele herstel profielen die door deze maatregelen is opvallend afwezig. Proliferatietesten zijn geweest, tot nu toe, de enige betrouwbare in vitro test getest in de meeste studies, maar er is een opmerkelijk gebrek aan bewijs over het effect van deze interinterventies op: 1) het doden capaciteit van cytotoxische T-cellen, 2) het antivirale effect van T-cellen virale replicatie, 3) de cytokine secretie profiel, en 4) het effect op CD4 T-cel hulp van andere cel subsets. Intracellulaire cytokine kleuring (ICS) is een zeer nuttig en veel gebruikt flowcytometrie gebaseerde test die wordt gebruikt om de productie van cytokinen in verschillende celtypes in zowel muizen als mensen te detecteren. Het is ook gebruikt om het effect van antilichaam blokkade van remmende wegen onderzoeken. In ICS tests wordt cytokine secretie geblokkeerd door de toevoeging van Brefeldine en / of Monensin. Cytokinen opgesloten in de cellen worden vervolgens gedetecteerd met fluorescente antilichamen met polychromatische flowcytometrie. De duur van de test wordt meestal beperkt tot 6 of 12 uur na antigeenstimulatie aangezien zowel Brefeldine en monensine, die typisch worden toegevoegd binnen 2 uur antigeen Bovendien zijn giftig voor de cellen. De ICS-test is een krachtige techniek die nuttig i is geweestn het onderzoek van het effect van in vivo toediening van blokkerende interventie antilichaam in muizen wanneer cellen na een bepaalde tijd na blootstelling antilichaam 9 geëxtraheerd. Er zijn echter verscheidene beperkingen voor de toepassing van deze experimentele aanpak het effect van blokkade van remmende receptoren in humane monsters te evalueren. Bij het ​​uitvoeren antilichaam interventies remmende wegen in een 6 of 12 uur stimulatie in vitro (typisch het geval bij humane monsters), ofwel blokkade van remmende receptoren in de meeste gevallen niet de frequentie reageren antigeen-specifieke T-cellen te veranderen zoals gemeten met standaard ICS assays 6, 7. Metingen van per-cel cytokineproductie gemeten door gemiddelde of mediane fluorescentie-intensiteit hebben inconsistente resultaten 6, 7, 10 gegeven. Anderzijds, wanneer ICS wordt uitgevoerd op een laat tijdstip na stimulatie (bijvoorbeeld zes dagen), veranderingen in het aantal cytokineafscheidende cel kan worden waargenomen. De verschillen zijn een gecombineerd effect van veranderde proliferatie, overleving, en veranderingen in effector functie die zich ophopen in de bepaalde periode 6. Een manier om deze beperkingen te overwinnen gedeeltelijk is incuberen langere tijd (bijvoorbeeld 36 uur, 60 uur, enz..) Met het antigeen vóór de toevoeging van de cytokine secretie blocker zonder te wachten tot proliferatie te voorkomen. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze methode om de kinetiek van cytokine secretie bepalen door HIV-specifieke CD4 en CD8 T-cellen 11,12, maar deze aanpak is niet in staat om kleine responsen detecteren en zal een geïntegreerd resultaat van de totale cytokine secretie optreedt niet geven Sinds stimulatie. Daarom ICS is niet gevoelig genoeg methode om de impact van blokkade van remmende wegen van de hoeveelheid cytokinen geproduceerd door geactiveerde T-cellen ten opzichte van cytokine mRNA kwantificatie of metingen van cytokine secretie in de supernatan detecterent tegelijkertijd punten. Bovendien, de meeste van de door geactiveerde T-cellen cytokines handelen autocriene wijze bijdraagt ​​aan positieve of negatieve terugkoppelingen door interactie met antigen presenterende cellen. Daarom toevoeging van Brefeldine of monensine gedurende de ICS bepaling voorkomt cytokine secretie en derhalve stimulering van T-cellen niet optimaal. Tenslotte wordt detectie van meerdere cytokinen met ICS beperkt door de beschikbaarheid en gevoeligheid van antilichamen voor de detectie van cytokinen met flowcytometrie en door beperkingen in het aantal fluorochromen die kunnen worden gecombineerd in een bepaald paneel. We hebben een zeer gevoelige in vitro experimentele aanpak het effect van immuunregulerende trajecten evalueren reguleren cytokine secretie door HIV-specifieke CD4 T-cellen en vervolgens CD4 hulp aan antigeen presenterende cellen (APC&#39;s) en natuurlijke killercellen (NK-cellen). Deze methode kan ook worden gebruikt om de impa evaluerenct van de blokkade van remmende moleculen op CD8 T-cel functie door het uitputten van de CD4 T-cellen uit PBMC of door het stimuleren van een optimale peptiden die worden alleen herkend door CD8 T-cellen. In tegenstelling tot intracellulaire cytokine kleuring assays, besloten we niet te bemoeien met de cytokine secretie door HIV-specifieke CD4 T-cellen om te kunnen: 1) voert een kwantificatie van de cytokine niveaus geproduceerd, 2) onderzoeken breder panel van cytokinen of effector moleculen, en 3) hoe de effecten van cytokinen geproduceerd door HIV-specifieke CD4 T-cellen op andere cel subsets. We stimuleren CD8 verarmde PBMC met een HIV-1 Gag peptideverzameling in aanwezigheid van blokkerende antilichamen voor de immuunregulerende route van belang. Nadat de gewenste tijd van incubatie, gewoonlijk 48 uur, verzamelen we de bovenstaande vloeistoffen te cytokineafscheiding meten met kraal arrays en het verzamelen van de cel pellets hetzij voor fenotypische analyse van de verschillende cel subsets of voor transcriptie analyse. Van de nota, bij tzijn 48 uur tijdstip, we niet een aanzienlijke populatie van delende T-cellen 12 detecteren. Dit is een flexibele aanpak en verscheidene aanpassingen van dit ontwerp kan worden toegepast op verschillende hypothesen pakken. Zo kan de individuele cel subsets (HIV-specifieke CD4 T-cellen of PD-1 hoge CD4 T-cellen, enz..) Worden gesorteerd na 12 uur incubatie voor verdere incubatie gedurende 36 uur gevolgd door verzameling supernatanten en celpellets meer in het bijzonder onderzoeken de impact van de blokkade ingrepen op cytokine secretie door bepaalde subpopulaties van PBMCs.

<table><tbody><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum AB</td><td>Gemini BioProducts</td><td>100-512</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Mediatech</td><td>30 001 CI</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Mediatech</td><td>25 005 CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Mediatech</td><td>25060CI</td><td></td></tr><tr><td>FcR blocking reagent, human</td><td>Miltenyi</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail </td><td>Stem Cell</td><td>15663</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td><td>Invitrogen</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Improm-II Reverse Transcription System</td><td>Promega</td><td>A3800</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix</td><td>Agilent</td><td>600830</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337100</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&#947; primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA</td></tr><tr><td>GAPDH primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG</td></tr></tbody></table>

in vitro onderzoek naar de impact van immunoregulatoire pathways op hiv-specifieke cd4 t-cellen effectorfunctiemanipulatie evalueer

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T-cel uitputting is een belangrijke factor in niet pathogeen klaring tijdens chronische virale infecties. Immuunregulerende wegen, zoals PD-1 en IL-10, opgereguleerd na deze voortdurende blootstelling aan antigeen en bijdragen aan het verlies van proliferatie, cytolytische verminderde functie en verminderde cytokine productie door CD4 en CD8 T-cellen. In het muizenmodel van LCMV infectie toediening van blokkerende antilichamen tegen deze twee wegen aangevuld T cel responsen. Er is echter nog geen in vitro test om het effect van deze blokkade op cytokine uitscheiding in cellen van humane monsters te bepalen. Ons protocol en experimentele aanpak zijn wij in staat nauwkeurig en efficiënt te kwantificeren het herstel van de productie van cytokines door HIV-specifieke CD4 T-cellen van HIV-geïnfecteerde patiënten. Hier, we tonen een in vitro experimenteel ontwerp dat de metingen van cytokine secretie mogelijk maakt door HIV-specifieke CD4 T-cellen en hun impact op andere cell subsets. CD8 T-cellen werden uitgeput uit volbloed en de resterende PBMCs werden geïsoleerd via Ficoll scheidingsmethode. CD8-verarmde PBMC werden vervolgens geïncubeerd met blokkerende antilichamen tegen PD-L1 en / of IL-10Rα en na stimulatie met een HIV-1 Gag peptideverzameling werden cellen geïncubeerd bij 37 ° C, 5% CO2. Na 48 uur werd supernatant verzameld voor cytokine analyse met kralen arrays en celpellets werden verzameld voor of fenotypische analyse met flowcytometrie of transcriptionele analyse met qRT-PCR. Voor meer gedetailleerde analyse, werden verschillende celpopulaties verkregen door selectieve deelverzameling uitputting uit PBMC of door het sorteren met behulp van flowcytometrie alvorens te worden beoordeeld in het zelfde assays. Deze methoden geven een zeer gevoelige en specifieke benadering van de modulatie van cytokinine productie van antigeen-specifieke T-helpercellen en functionele interacties tussen verschillende populaties van immuuncellen bepalen.

Bij de uitvoering cytokine metingen gebruik van deze in vitro systeem, is het essentieel om de antigeen-specifieke responsen in vergelijking met de controlegroep die geen stimulatie onderscheiden. In het algemeen hebben wij rekening positieve reacties als alle waarden van de antigene stimulatie die ten minste drie-voudige toename van cytokinen in vergelijking met de controlegroep die geen stimulatie en waarvan in het lineaire bereik van de test geven. Wij maken gebruik van een hoge gevoeligheid kraal reeks test...

We ontwikkelden een in vitro assay om de rol van immuunregulerende trajecten in de regulatie van cytokine secretie door HIV-specifieke CD4 T-cellen te onderzoeken.

In vitro onderzoek naar de impact van immunoregulatoire Pathways op HIV-specifieke CD4 T-cellen Effectorfunctiemanipulatie Evalueer

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Het algemene doel van deze procedure is om de cytokine secretie, transcriptie en morfologische impact van gestimuleerde T-cellen te analyseren. Gebruik eerst een FI call-gradiënt om de perifere CD acht gedepleteerde bloedmononucleaire cellen van de met HIV geïnfecteerde individuen te isoleren. Incubeer de cellen vervolgens met ofwel de isotype controle of het blokkerende antilichaam van belang. Stimuleer vervolgens de cellen met het antigeen van belang.Centrifugeer vervolgens de celculturen om supernatanten te verzamelen voor cytokinemetingen en celpellets voor fenotypische analyse of transcriptionele analyse indien gewenst. Pas dit protocol aan om de individuele celtypen te sorteren door middel van flowcytometrie. Resultaten op cytokine secretie. Fenotypische of transcriptionele analyse kan de impact van antilichaamblokkering van remmende paden op het herstel van de effectorfunctie van HIV-specifieke CD vier T-cellen laten zien.Deze in vitro assay kan effectief worden gebruikt om cytokineniveaus te kwantificeren die worden hersteld door de blokkering van remmende paden om een breed panel van effectormoleculen te onderzoeken en ook om de impact van cytokinen geproduceerd door HIV-specifieke C voor T-cellen op andere celsubsets te evalueren. Megan Hart, een onderzoekstechnicus van ons laboratorium, zal nu deze procedure demonstreren, Depleteer de CD acht positieve T-cellen door de humane CD acht positieve depletiecocktail toe te voegen op 50 microliters per milliliter vol bloed goed mengen en 20 minuten in te cuberen. Bij kamertemperatuur meng het volbloed met hank's buffer.Laat nu voorzichtig het bloed lagen op zijn histo pack, centrifugeer vervolgens de gradiënt bij 540 RCF gedurende 30 minuten. Verzamel de laag van perifere bloedmononucleaire cellen. Breng de cellen over naar een nieuwe 50 milliliter conische buis en was twee keer met 45 milliliters compleet RPMI 1640.Re-suspendeer de gewassen cellen in compleet RPMI 1640. Geef vervolgens 500 microliters celsuspensie per faxbuis. Afhankelijk van het onderzochte pad, voeg de blokkerende antilichamen toe.Voeg ook de isotype controles toe aan de geschikte buizen. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten in de celcultuur incubator. Stimuleer vervolgens de cellen met een HIV een gag peptide pool.Voeg ook een controle zonder stimulatie toe voor elke blokkerende conditie. Cultiveer de cellen gedurende 48 uur. Pellet de cellen door centrifugatie en vervolgens zonder de pellet te verstoren.Breng twee keer 225 microliters supernatant over naar EOR buizen voor de luminex speed arrays om het virus te inactiveren bij 25 microliters van 0,5%PBS tween. Meet vervolgens de gewenste cytokineconcentraties met behulp van het Millipore luminex kit volgens het protocol van de fabrikant. Na het wassen van de cellen in drie milliliters PBS, kleur voor levensvatbaarheid en suspendeer de cellen vervolgens in 100 microliters PBS bevattend 1%FBS als er voor monocyten of andere antigeenpresenterende cellen wordt gekleurd bij 1,4 microliters FCR blokkeringsreagens vortex om te mengen en incubeer gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.Voeg vervolgens de oppervlakteantilichamen toe, vortex en incubeer gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius in het donker. Na één wassing bij 200 microliters van 4% para formaldehyde en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten in het donker. Na één wassing, suspenderen we de cellen in 250 microliters van 1%FBS voor analyse op een multilaser flow cytometer voor kwantitatieve R-T-P-C-R lyce de cellen in 300 microliters van kyogen buffer, RLT bevattend 1%Beamer keto ethanol isoleer RNA, volgens het protocol van de fabrikant met behulp van een RNA isolatie kit.Synthesiseer nu CD NA uit de RNA met behulp van een CD NA synthese kit en volgens het protocol van de fabrikant. Maak vervolgens een primer mix voor elke primer, inclusief de huishoudelijke genen door primers toe te voegen aan nuclease vrij water en op ijs te bewaren. Voor elke versterkingsmastermix, voeg 10,5 microliters nuclease vrij water, 12,5 microliters cyber groen en één microliter primer mix per plaat toe.Pipet nu 24 microliters van de mastermix in elke reactie. Voeg ook één microliter van CD NA toe aan elk, wel volgens het sjabloon. Dek de wel af en centrifugeer de plaat gedurende drie minuten bij 1500 RCF.Voer vervolgens de plaat uit op een AQRT PCR R machine voor celoppervlaktekleuring. Voeg de felden en monin kleurstoffen toe ongeveer zes uur voorafgaand aan intracellulaire cytokinekleuring. Was vervolgens de cellen met 1%FBS in PBS en kleur voor intracellulaire cytokinen met behulp van een fixatie permeabilisatie oplossingskit en protocol na het wassen van de cellen.Zodra we de pellets suspenderen in 250 microliters van 1%FBS, voeren we de monsters uit op een multilaser flow cytometer 16 uur na stimulatie en kleuren voor levensvatbaarheid met behulp van de live dode fixabele dode celkleuringskit. Volgens het protocol van de fabrikant, na één PBS wassing, suspenderen we de cellen in 100 microliters van 1%FBS bij de oppervlakteantilichamen vortex om te mengen en incubeer de cellen op ijs in het donker gedurende 20 minuten. Was de cellen eenmaal en suspendeer de cellen in 500 microliters koude aangevulde RPMI 1640.Media filter de cellen vervolgens door een celstrainer en breng over in een vijf milliliter polystyreen ronde bodembuis. Breng vervolgens bij 200 microliters van aangevulde RPMI 1640 media naar elke verzamelbuis. Houd alle buizen op ijs tijdens het sorteren, sorteer de celsubsets van belang op een instrument dat zich bevindt in een faciliteit die is uitgerust voor biogevaarlijke materiaalcultuur.De gesorteerd cellen gedurende de gewenste hoeveelheid tijd. Volgende met luminex en PCR analyseanalyse in dit experiment, CD acht gedepleteerde PBMC stimulatie met een HIV V een gag peptide pool resulteert in een mediane 800-voudige toename voor interferon gamma productie. Het niveau van interferon gamma transcripten werd verhoogd met een mediane tienvoudige toename na stimulatie.In deze in vitro analyse van HIV-specifieke CD vier T-celfunctie geven de resultaten een sterke correlatie aan tussen interferon gamma-eiwitsecretie en interferon gamma mRNA-niveaus. Interessant is dat stimulatie door het HIV gag peptide

in-vitro-assay-to-evaluate-impact-immunoregulatory-pathways-on-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Tregs zijn krachtige onderdrukkers van het immuunsysteem. Er is een gebrek van unieke oppervlakte markers om ze te definiëren, dus, de definities van Tregs zijn vooral functioneel. Hier beschrijven we een...

Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance

This video showcases an apoptosis assay in cancer cells induced by pre-activated effector T cells. By co-culturing these cells with cancer cells marked with fluorescent nuclei, a caspase-cleavable fluorogenic substrate is added. Apoptotic cancer cells will display a different color in their nuclei, leading to dual fluorescence. This dual fluorescence is indicative of cancer cells undergoing apoptosis.

An In Vitro Assay for Studying the Cytotoxicity of Pre-Activated CD8+ T Cells against Cancer Cells

CD4+ regulatorische T-cellen zijn krachtige immuunmodulatoren en hebben belangrijke functies in immuunhomeostase. Het gebrek aan deze cellen in perifeer bloed maakt functionele studies uitdagend, specifiek in de context van HIV-1-infectie. We beschrijven hier een methode om functionele CD4+ Tregs te isoleren en uit te breiden van perifeer bloed van HIV-1-geïnfecteerde individuen.

Nieuwe tools om regulatoire T-cellen van HIV-1-geïnfecteerde individuen Expand

Nieuwe generaties van functionele testen zoals gamma interferon (IFN-γ) ELISPOT, die cytokineproductie detecteren op enkele cel en bieden zowel kwantitatieve als kwalitatieve karakterisering van T cel responsen kunnen worden gebruikt om celgemedieerde immuunresponsen tegen varicella zoster beoordelen virus (VZV).

Ontwikkeling van een IFN-γ ELISpot Assay aan varicella-zoster virus-specifieke-cel gemedieerde immuniteit na transplantatie van navelstrengbloed

Hier beschrijven we een hoogwaardige vloeistofchromatografie-gekoppelde massaspectrometrie (HPLC-MS/MS) test om het immunosuppressivum tacrolimus in gedroogde bloedvlekken te kwantificeren met behulp van een eenvoudige handmatige eiwitprecipitatiestap en online kolomextractie.

Kwantificering van de Immunosuppressieve tacrolimus op opgedroogd bloed Spots Met behulp van LC-MS / MS

Dit protocol beschrijft de methoden voor het construeren van een gehumaniseerd muismodel voor beenmerg/lever/thymus met stamcelgebaseerde geëngineerde immuniteit tegen HIV-infectie.

Stamcel-Based Engineered immuniteit tegen HIV infectie in het gehumaniseerde muismodel

Hier beschrijven we een protocol om het fenotype van regulatorische T-cellen (Treg) te analyseren die zijn geïsoleerd uit naïeve en chronisch lymphocytaire choriomeningitis-virus geïnfecteerde muizen. Daarnaast bieden we een proces om de onderdrukkende activiteit van de Treg-cellen te evalueren.

Fenotypische en functionele analyse van geactiveerde regulatoire T-cellen Geïsoleerd van Chronische Lymfatische choriomeningitis-virus geïnfecteerde muizen

Hier presenteren we een protocol bij het opwekken van tolerantie in transplantatie, en beoordelen van in vitro en in vivo de onderdrukkende capaciteit van afzonderlijke cel subsets van de ontvanger en de immuunstatus van de ontvanger naar donor of exogene antigenen.

In Vitro en In Vivo beoordeling van T-, B- en myeloïde cellen onderdrukkende activiteit en humorale reacties van transplantatie ontvangers

We beschrijven hier een flow Cytometry-based in vivo doden assay die het mogelijk maakt onderzoek van immunodominance in chemo T lymfocyten (CTL) Reacties op een model tumor antigeen. Wij bieden voorbeelden van hoe deze elegante assay kan worden gebruikt voor mechanistische studies en voor de effectiviteit van geneesmiddelen testen.

Maatwerk in vivo chemo tests om Immunodominance in tumor-specifieke CD8+ T Cell responsen te bestuderen

We beschrijven een procedure om het vermogen van farmacologische middelen te beoordelen om tolerogene dendritische cellen te genereren uit naïeve van monocyten afgeleide dendritische cellen in vitro en om hun potentie te valideren door autologe regulerende T-celgeneratie te genereren.

Een eenvoudige en efficiënte methode voor het testen van immunomodulerende middelen voor het genereren van tolerogene dendritische cellen uit menselijke CD14+ -monocyten

Dit protocol biedt een in vitro co-kweekstrategie om de effecten van regulerende T-cellen op de proliferatie en differentiatie van effector T-cellen te onderzoeken.

In vitro Functionele analyse van regulerende T-cellen: Focus op proliferatie en differentiatie

Leer een in vitro-assay om immunoregulatoire paden in HIV-specifieke CD4 T-cellen te onderzoeken met behulp van antilichaamblokkade. Deze methode helpt onderzoekers bij het analyseren van cytokinesecretie en het herstel van effectorfunctie.

In vitro onderzoek naar de impact van immunoregulatoire Pathways op HIV-specifieke CD4 T-cellen Effectorfunctiemanipulatie Evalueer (Video) | JoVE Journal

In vitro onderzoek naar de impact van immunoregulatoire Pathways op HIV-specifieke CD4 T-cellen Effectorfunctiemanipulatie Evalueer

Meer video's verkennen