Name: Stress-geïnduceerde antibiotica gevoeligheid testen op een chip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Leer een microfluidische methode voor snelle antibiotica gevoeligheidstesten van bacteriën onder stresscondities. Deze techniek maakt real-time monitoring van celviabiliteit mogelijk zonder bacteriële deling te volgen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken de ingenieurs en studenten van het Fraunhofer Center for Manufacturing Innovation. Voor het helpen bij het ontwerp, de bewerking en de automatisering van het experimentele systeem, bedanken we Andreas Prinzen, Holger Wirz, Doug Foss, David Chargin en Dr. Sudong Shu. We danken Julia Kuckartz, Melanie Zimmermann, Niko Kraetzmar, Tim Gumbel, Josh Villanueva, Minori Shimizu en Katarzyna Kuliga voor hulp bij het testen van experimentele protocollen en het verzamelen van gegevens. We erkennen Drs. Anne E. Carpenter en Mark-Anthony Bray van het Imaging Platform van het Broad Institute of Harvard en MIT voor hulp bij de ontwikkeling van de beeldanalyseroutine in CellProfiler. Het beschreven project werd gedeeltelijk ondersteund door awards R21AI079474 en 1R01AI101446 van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases of de National Institutes of Health. Het project werd ook ondersteund door Fraunhofer USA.

1. Maak de PDMS-laag (figuur 1)
<ol><li>Meng PDMS en curing agent krachtig in een 10:1 verhouding. Om bellen te verwijderen, ontgast u het viskeuze mengsel gedurende 1 uur in een vacuümkamer bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Giet het PDMS op een schaal langzaam over de aluminium mal. Giet vanuit het midden en houd de mal waterpas. Zorg ervoor dat u de pinnen onbedekt laat. Stop met gieten zodra het streefgewicht is bereikt. Onze mal vereist 4 g PDMS en 0,4 g uithardend reagens.
</li>
	<li>Breng de mal waterpas in een oven en hard 's nachts uit bij 37 °C. Alternatieve uithardingstijden zijn 2 uur bij 60 °C of 1 uur bij 90 °C.
</li>
	<li>Ontleed de uitgeharde PDMS-laag langs de rand van de mal en pel deze voorzichtig van het matrijsoppervlak af met een tang. Reinig het matrijsoppervlak met 70% ethanol en een Q-tip.</li>
</ol>2. Monteer de stroomcel volgens figuur 2
Standaardassemblage van PDMS met glazen dia's gebeurt door middel van zuurstofplasmabehandeling van beide oppervlakken, wat zorgt voor lekvrije hechting tussen de PDMS- en microscoopglasschuif. In het gepresenteerde protocol zou de plasmabehandeling de chemische coating op de glazen dia vernietigen. Daarom is de dia drukdicht in plaats van plasmabehandeld.
<ol><li>Plaats het glazen raam in de zak van de stromingscel.</li>
	<li>Leg een gecoate glazen schuif over het glazen raam in de zak van de stroomcel met de actieve kant naar boven en plaats de PDMS-laag met kanalen naar beneden erop. Plaats de PDMS-schuif zo dat kanaalingangen uitlijnen met de doorvoergaten in de metalen plaat. Duw de lucht voorzichtig tussen de lagen uit.</li>
	<li>Draai de PDMS/glazen schuifeenheid zo dat het PDMS naar het glasraam kijkt. Overlap de PDMS-kanaalingangen met de doorvoergaten in de metalen plaat.</li>
	<li>Plaats de drukplaat erop en draai de schroeven vast.</li>
	<li>Plaats de geassembleerde stroomcel onder de microscoop. Stel de microscoopvergroting in op 60X en lijn de kanaalposities vooraf uit.</li>
</ol>3. Bereid logfasebacteriën voor
<ol><li>Dag voor het experiment: Ent 50 ml Mueller Hinton bouillon met 2% NaCl (MH2) met een bacteriekolonie. Schud 's nachts bij 250 tpm bij 37 °C. Een of twee bacteriestammen kunnen in één experiment worden bestudeerd voor de beschreven opstelling.
</li>
	<li>Voorafgaand aan het experiment: Meng 50 μl overnight bacteriekweek in 50 ml MH2 media. Schud bij 250 tpm gedurende 3 uur bij 37 °C om ervoor te zorgen dat de bacteriën zich in de logfase bevinden.</li>
</ol>4. Verwarm de componenten van de experimentele oplossing ten minste 10 minuten voordat ze nodig zijn
<ol><li>Ontdooi de fluorescerende kleurstof (5 mM bouillon) en lysostaphin (10 μg/ml bouillon) bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwarm het oxacillinepoeder op kamertemperatuur.</li>
</ol>5. Bereid de bacteriële suspensie voor en laad deze
<ol><li>Na het einde van 3 uur subcultuur: Neem 10 ml bacteriekweek en centrifugeer gedurende 2 minuten op 1.650 x g.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en de resuspend bacteriën in 1 ml verse MH2 media.</li>
	<li>Bevestig een korte lengte slang aan een Luer-slotspuit van 1 ml. Spoel de spuitslang door met 1 ml media. Laat een beetje media in de slang om luchtbellen te voorkomen bij het trekken van de bacteriële suspensie.</li>
	<li>Plaats 0,7 ml bacteriën type 1 in de spuit. Vul twee kanalen van de stroomcel met bacteriën type 1. Let erop dat de vloeistof na ca. 150 μl. De transparantie van het kanaal verandert omdat het gevuld is met bacteriën.
</li>
	<li>Als u experimenteert met meerdere bacterietypen, herhaalt u de laadprocedure voor bacteriën type 2 in de twee resterende kanalen van de stroomcel.</li>
	<li>Plaats de stroomcel gedurende 45 minuten in de incubator op 37 °C om bacteriële bezinking en bevestiging aan het schuifoppervlak mogelijk te maken.</li>
</ol>6. Bereid de experimentele oplossingen voor en laad ze
<ol><li>Bereid 140 μl fluorescerende verfoplossing van 0,5 mM door 14 μl fluorescerende kleurstoffen (5 mM) en 126 μl MH2-media te mengen.</li>
	<li>Verdun 10 mg oxacilline in 40 ml MH2-media om een eindconcentratie van 250 μg/ml oxacilline te verkrijgen.</li>
	<li>Bereid 130 ml regeloplossing met eindconcentraties van 0,25 μM fluorescerende kleurstof en 0,7 ng/ml lysostaphin. Meng hiervoor 65 μl fluorescerende kleurstof (0,5 mM), 9,12 μl lysostaphinbouillon (10 μg/ml) en 130 ml MH2-media.</li>
	<li>Bereid 130 ml antibioticaoplossing met eindconcentraties van 0,25 μM fluorescerende kleurstof, 0,7 ng/ml lysostaphin en 50 μg/ml oxacilline. Meng hiervoor 65 μl fluorescerende kleurstof (0,5 mM), 9,12 μl lysostaphinbouillon (10 μg/ml), 26 ml oxacilline (250 μg/ml) en 104 ml MH2-media.</li>
	<li>Vul twee spuiten van 60 ml met regeloplossing en twee spuiten van 60 ml met een antibioticumoplossing. Houd oplossingen gewikkeld in aluminiumfolie om lichtgeïnduceerde afbraak van de reagentia te voorkomen. Vul de spuiten te vol om rekening te houden met verlies als gevolg van het doorspoelen van de slang.
</li>
	<li>Verwijder luchtbellen uit de spuiten door te flikkeren. Bevestig en vul de ingangsslang aan de punt met de experimentele oplossing.</li>
	<li>Monteer spuiten op de pomp. Plaats de spuit eerst met het kleinste volume en vergrendel vervolgens de zuigerpositie. Plaats de rest van de spuiten op de pomp en knijp indien nodig in hun zuigers.</li>
	<li>Stel de pompsnelheid in op 1 ml/min en het pompvolume op 60 ml. Doe een flush met de pomp totdat een constante stroom vloeistof wordt gezien van alle spuiten.</li>
</ol>7. Stel de stroomcel onder de microscoop in
<ol><li>Verwijder de stroomcel uit de centrifuge en monteer deze op het microscoopstadium (afbeelding 3).</li>
	<li>Sluit de ingangs-/uitgangsslang aan op elk van de stroomcelkanalen (één ingang/één uitgang per kanaal). Het verzamelen van output in vier verschillende containers maakt het mogelijk om de uitgangsvolumes van afzonderlijke kanalen te meten.</li>
</ol>8. Voer het experiment van 60 minuten uit
<ol><li>Controleer de vooraf uitgelijnde posities vanaf stap 2.5. Als het gezichtsveld van de microscoop niet gecentreerd is op het kanaal en/of niet scherp is, past u de instellingen aan en slaat u de nieuwe posities op. Nauwkeurige scherpstelling is mogelijk niet mogelijk voordat de stroom begint vanwege de hoge dichtheid van geladen bacteriën.
</li>
	<li>Stel de acquisitietijd van het fasecontrast in op 10 msec en de fluorescentieverwervingstijd op 1.600 msec.</li>
	<li>Verkrijg fasecontrast- en fluorescentiebeelden voor elke positie voordat u de stroom start. Dit geeft een kwalitatieve schatting van de geladen bacteriedichtheid.
</li>
	<li>Start de vloeistofstroom en controleer onmiddellijk of de microscoop op de bodem van de kanalen is gericht.</li>
	<li>Maak fasecontrast- en fluorescentiebeelden van de doelgebieden binnen de eerste minuut van de stroom.</li>
	<li>Verkrijg afbeeldingen elke 2 minuten nadat de eerste set afbeeldingen is opgetreden totdat 60 minuten stroom heeft plaatsgevonden. Heroriënteer indien nodig.</li>
</ol>9. Desinfecteer de flowcel
<ol><li>Maak een 10% bleekoplossing in een bekerglas (100 ml). Vul 4 x 20 ml spuiten met 10 ml van het mengsel. Debubble de spuiten en bevestig ze aan de stroomcel. Het duurt ~ 1-2 minuten voordat de kanalen vrij zijn van bacteriën.
</li>
	<li>Stel de pompsnelheid in op 1 ml/min en het pompvolume op 3 ml. Ren 3 minuten.</li>
	<li>Vul 4 x 60 ml spuiten met 60 ml DI water. Debubble de spuiten en bevestig ze aan de stroomcel.</li>
	<li>Stel de pompsnelheid in op 1 ml/min en het pompvolume op 30 ml. Ren 30 minuten.</li>
	<li>Controleer de kanaalreiniging onder de microscoop.</li>
	<li>Demonteer de stroomcel. Gooi de gebruikte epoxyschuif weg. Week de stromingscelcomponenten gedurende 20 minuten in DI-water. Aan de lucht drogen.</li>
</ol>10. Analyseer afbeeldingen en genereer gegevens
<ol><li>Tel het aantal bacteriën in elke afbeelding. De open access software, CellProfiler wordt gebruikt om batch-beeldverwerking uit te voeren16. Een overzicht op hoog niveau van de CellProfiler-routine wordt samengevat in tabel 1. Het aantal bacteriën in het fasecontrastbeeld (Np) geeft het totale aantal bacteriën. Het aantal bacteriën dat zichtbaar is in het fluorescentiebeeld (Nf) geeft het aantal dode bacteriën aan.
</li>
	<li>Bereken het genormaliseerde bacteriële celdoodpercentage als functie van de tijd.<ol>
<li>Importeer Nf en Np voor individuele afbeeldingen in de data-analysesoftware.</li>
		<li>Bereken de fractie van dode bacteriën in elk kanaal op een specifiek tijdstip gegeven door de fractie (Nf / Np) op t = T.</li>
		<li>Trek de fractie dode bacteriën af die aan het begin van het experiment aanwezig zijn (t = 1 min) voor zowel de controle- als de experimentele kanalen.</li>
		<li>Trek de fractie dode bacteriën in het controlekanaal af van die in het experimentele kanaal op elk moment met de volgende vergelijking: <img alt="Data Analysis Equation" fo:content-width="6in" height="217" src="/files/ftp_upload/50828/Data_analysis_equation.png" width="620">
</li>
		 <li>Grafiek DPnorm vs. t voor de loop van het experiment. Merk op dat een monster met een celdoodpercentage van meer dan 1% vatbaar wordt geacht, terwijl minder dan 0,5% sterfte indicatief is voor resistentie. Percentages die tussen deze twee afsnijdingen vallen, worden als onbepaald beschouwd en het monster moet opnieuw worden getest.
</li>
		<li>Gebruik een spreadsheet om resultaten van verschillende experimenten samen te vatten en te analyseren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+systems+for+pathogen+sensing%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Microfluidic systems for pathogen sensing: a review.</a> Sensors. 9, 4804-4823 (2009).</li>
<li>Yager, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+diagnostic+technologies+for+global+public+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microfluidic diagnostic technologies for global public health.</a> Nature. 442, 412-418 (2006).</li>
<li>Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+bacteria+and+determining+their+susceptibility+to+antibiotics+by+stochastic+confinement+in+nanoliter+droplets+using+plug-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+toxicological+complexity+by+multi-dimensional+screenings+in+microsegmented+flow%3A+modulation+of+antibiotic+interference+by+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles.</a> Lab Chip. 12, 474-484 (2012).</li>
<li>Chen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+susceptibility+testing+using+high+surface-to-volume+ratio+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels.</a> Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).</li>
<li>Churski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+of+antibiotic+toxicity+in+an+automated+microdroplet+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system.</a> Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).</li>
<li>Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chem. Biol. 6, 260-266 (2011).</li>
<li>Kim, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+monitoring+of+antibiotic+susceptibility+of+bacterial+biofilms+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 10, 3296-3299 (2010).</li>
<li>Peitz, I., van Leeuwen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+bacteria+growth+monitoring+by+automated+DEP-facilitated+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Single-cell bacteria growth monitoring by automated DEP-facilitated image analysis.</a> Lab Chip. 10, 2944-2951 (2010).</li>
<li>Kalashnikov, M., Lee, J. C., Campbell, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+rapid%2C+stress-induced+antibiotic+susceptibility+testing+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus.</a> Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).</li>
<li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28dimethylsiloxane%29+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).</li>
<li>Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+viability+and+antibiotic+susceptibility+testing+with+SYTOX+green+nucleic+acid+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).</li>
<li>Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+Staphylococcus+aureus+cell+wall+digestion+by+lysostaphin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin.</a> J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).</li>
<li>Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+envelope+stress+response+in+Gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).</li>
<li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+wall+as+target+for+attack%3A+past%2C+present%2C+and+future+research%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research.</a> Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li>
<li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+antibiotics+kill+bacteria%3A+from+targets+to+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">How antibiotics kill bacteria: from targets to networks.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).</li>
<li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+mechanism+of+cellular+death+induced+by+bactericidal+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics.</a> Cell. 130, 797-810 (2007).</li>
</ol>

De microfluïdische methode is patent aangevraagd: Sauer-Budge A, Sharon A, Kalashnikov M, Wirz H, uitvinders; Methode en apparaat voor snelle detectie van bacteriële antibioticaresistentie / gevoeligheid patent PCT / US10 /33523.

Het gepresenteerde protocol werd gevalideerd en geoptimaliseerd in een reeks experimenten met methicillinegevoelige en methicillineresistente Staphylococcus aureus stammen10. Daarom moet dit protocol zonder wijziging rechtstreeks van toepassing zijn op andere stammen van S. aureus en andere antibiotica met werkingsmechanismen die de biosynthese van de bacteriële celwand beïnvloeden. Andere bacterietypen dan S. aureus kunnen variatie in de stressparameters vereisen: oplosbare (enzymat...

De opkomst van bacteriële resistentie versterkt de behoefte aan snelle op fenotype gebaseerde antibioticagevoeligheidstests om onze geneesmiddelen in laatste instantie te beschermen. Standaard gevoeligheidstests zijn gebaseerd op bacteriële groeiremming in aanwezigheid van antibiotica die meerdere (8-24) uur in beslag nemen. We hebben een nieuwe antibioticagevoeligheidstest ontwikkeld op een microfluïdisch platform dat afhankelijk is van de stressactivering van biosyntheseroutes om de werking van antibiotica te versnellen.
Antibiotica gevoeligheidstests op microfluïdische schaal hebben het voordeel van effectief monstergebruik, omdat ze kleine aantallen bacteriën vereisen. Bovendien kunnen microfluïdische apparaten worden gemulderd om meerdere monsters onder meerdere omstandigheden te testen1,2. Onlangs zijn een aantal microfluïdische methoden voor antibioticagevoeligheidstests gemeld3-9. In deze methoden worden bacteriën gekweekt in nano- en picoliterdruppels3,7, in het volledige volume van het microfluïdische kanaal4-6,8, of als enkele bacteriën elektrisch gelokaliseerd op het onderste oppervlak van kanaal9. Hoewel deze tests worden uitgevoerd in microfluïdische kanalen, monitoren ze allemaal de microbiële groei in de aan- en afwezigheid van antibiotica die vergelijkbaar zijn met traditionele methoden. Groeimetingen worden uitgevoerd via optische dichtheid, pH-gevoelige kleurstoffen of heldere veld-/fasecontrast- of fluorescentiebeelden. Hoewel sommige van deze tests sneller zijn dan traditionele methoden, detecteren ze elk passief antibioticaresistentie. Met andere woorden, deze methoden vereisen nog steeds dat de gebruiker wacht op bacteriegroei als de laatste uitlezing.
Daarentegen hebben we een methode ontwikkeld die een combinatie van afschuiving en enzymatische stress gebruikt om antibioticagevoelige biochemische routes te activeren10. Het uitdagen van de gestreste bacteriën met die antibiotica creëert een snellere gevoeligheidstest. Bacteriën die resistent zijn tegen het antibioticum zijn bestand tegen de stressvolle omstandigheden. Gevoelige bacteriën daarentegen worden snel gedood door de gecombineerde spanningen. Het percentage celdood na een uur, gemeten door microscopie met behulp van een fluorescerende dode celvlek, definieert het fenotype van de bacterie (resistent versus vatbaar).
Voor een succesvolle implementatie van onze methode moeten bacteriën worden geïmmobiliseerd op het onderste oppervlak van het microfluïdische kanaal. Op deze manier kunnen bacteriën worden blootgesteld aan verschillende spanningen en tegelijkertijd onder een microscoop in één vlak worden afgebeeld. Een gecoate microscoopglasschuif wordt gebruikt voor bacterieimmobilisatie. De dia is door de fabrikant voorgecoat met epoxidegroepen voor niet-specifieke eiwitbinding. De aspecifieke binding van deze epoxiden aan bacteriële oppervlakte-eiwitten hecht de bacteriën covalent aan het diaoppervlak.
Stammen worden getest onder identieke omstandigheden (shear + enzymatische stress) bij afwezigheid (controle) en aanwezigheid (experiment) van antibiotica. Fasecontrast en fluorescentiemicroscoopfoto's van elk kanaal worden gedurende een uur elke twee minuten automatisch gemaakt. Resistentiebenamingen worden vervolgens gemaakt door het percentage dode bacteriën in het experimentele kanaal te vergelijken met die in het controlekanaal. Na een uur wordt een monster met een celdoodpercentage van meer dan 1% als vatbaar beschouwd, terwijl minder dan 0,5% sterfte indicatief is voor resistentie. Percentages die tussen deze twee afsnijdingen vallen, worden als onbepaald beschouwd en het monster moet opnieuw worden getest.
Microfluïdische kanalen worden gedefinieerd in PDMS, een materiaal bij uitstek voor microfluïdische apparaten11. PDMS is optisch transparant in een breed scala aan golflengten, biocompatibel, inert, doorlaatbaar voor gassen en heeft een lage permeabiliteit voor vloeistoffen; daarom is het zeer geschikt voor deze experimenten.
Mechanische/schuifspanning wordt gecreëerd door de stroom van kamertemperatuurmedia over de geïmmobiliseerde bacteriën. (Opmerking: Het opwarmen van de media tot 37 °C heeft geen significant effect op de uitkomst van de test.) Geautomatiseerde spuitpompen forceren media (met dode celvlek +/- antibioticum, evenals optionele enzymatische stressoren) door de microfluïdische kanalen (200 μm x 400 μm) met een debiet van 1 ml/min om 6,25 kPa afschuifkracht of een afschuifsnelheid van 6.000 sec-1te geven. Dit percentage is gelijk aan of hoger dan eerder bestudeerde schuifspanningen op stafylokokken.
Het enzym, lysostaphin, werd geselecteerd voor voorbereidende experimenten omdat het directe schade aan de Staphylococcus celwand veroorzaakt. De concentratie lysostaphin (0,7 ng/ml) was voldoende om bacteriële celwandschade te veroorzaken, maar niet voldoende om bacteriële celdood zonder antibioticum te veroorzaken in het tijdsbestek van het experiment. Lysostaphin is niet nodig voor de juiste aanduiding van bacteriële gevoeligheid, maar het verhoogt wel het resultaat, wat leidt tot verhoogde celdood bij gevoelige stammen. Schuifspanning daarentegen is van cruciaal belang voor de testfunctie. Wanneer methicilline-gevoelige Staphylococcus aureus stammen worden behandeld met lysostaphin en oxacilline bij afwezigheid van stroom, wordt er in de loop van het experiment geen celdood geregistreerd.
De levensvatbaarheid van de cel wordt bewaakt met een fluorescerende dode celvlek12. De selectie van de kleurstof was gebaseerd op zijn vermogen om selectief alleen beschadigde cellen te bevlekken, de niet-toxiciteit voor levende cellen en de lage fluorescentie op de achtergrond, waardoor de directe toevoeging aan de celmedia zonder extra stappen mogelijk was. De selectie van een fluorescerende kleurstofconcentratie van 0,25 μM was om aanvaardbare signaalniveaus te bereiken tijdens een blootstellingstijd van 1,6 sec aan fluorescentie-excitatielicht.
De bèta-lactam, oxacilline, werd gebruikt in onze voorstudies. Methicilline-resistente S. aureus (MRSA) soorten zijn resistent tegen oxacilline en zullen in het tijdsbestek van het experiment geen merkbare celdood vertonen. De concentratie van 50 μg/ml werd bepaald in de voorstudies. Lagere concentraties antibiotica gaven minder scheiding tussen resistente en gevoelige stammen, terwijl hogere concentraties geen merkbaar verschil in experimentele resultaten veroorzaakten.
We hebben eerder gerapporteerd over de succesvolle ontwikkeling van een test die mechanische en enzymatische spanningen combineert die de bacteriële celwand13 rechtstreeks beïnvloeden met een antibioticum dat de biosynthese van de celwand remt14,15. Deze proof-of-principle experimenten werden uitgevoerd op een panel van MRSA en methicilline-gevoelige S. aureus (MSSA). Met de selectie van de juiste experimentele parameters moet onze methode echter van toepassing zijn op meerdere soorten bacteriën en meerdere klassen antibiotica.

<table><tbody><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen Corporation</td><td>S7020</td><td>Dead cell fluorescence stain</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich, Inc</td><td>A9418-5G</td><td>Gebaat voor lysostaphin opslag</td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma Aldrich, Inc</td><td>S8750-500G</td><td>Gebaat voor lysostaphin opslag</td></tr><tr><td>Lysostaphin&nbsp;</td><td>Cell Sciences</td><td>CRL309A</td><td>Komt als 1 mg vaste stof. Voor opslag: Oplossen in 20 mM natriumacetaat. Meng met BSA-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 1% BSA en 100 &micro;g/ml &nbsp;lysostaphin voor opslag&nbsp;</td></tr><tr><td>Oxacillin zout</td><td>Sigma Aldrich, Inc</td><td>28221-1G</td><td>Antibioticum</td></tr><tr><td>Mueller Hinton Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0757-17-6</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma Aldrixh</td><td>S3014-500G</td><td>2% toegevoegd aan Mueller-Hilton bouillon vóór autoclavage</td></tr><tr><td>1 ml, Luer-lock spuit&nbsp;</td><td>BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td><td>14-823-2F</td><td></td></tr><tr><td>2 oz, Luer-lock spuit</td><td>BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td><td>309653 - 60 mL</td><td>Overvullen tot ~65 ml</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70</td><td>Cambridge Scientific</td><td>9349</td><td></td></tr><tr><td>60X, Fluorescence/Phase contrast objectief</td><td>Olympus Corp.</td><td>LCPlan F1 60x/0.70 Ph2</td><td></td></tr><tr><td>Retiga 12-bit monochrome CCD camera</td><td>QImaging</td><td>RET-4000R-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>Microscope automatisering</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shutters fase contrast/fluorescentie</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H204/H202</td><td></td></tr><tr><td>X/Y Stage&nbsp;</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H107AENN</td><td></td></tr><tr><td>Focus motor</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H122</td><td></td></tr><tr><td>Joystick voor XYZ controle</td><td>PRIOR Scientific</td><td>CS152EF</td><td></td></tr><tr><td>Proscan Controller</td><td>PRIOR Scientific</td><td>H3-XY2</td><td></td></tr><tr><td>Image Acquisition Software</td><td>Fraunhofer CMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Cell Assembly en PDMS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Cell</td><td>BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI</td><td>3333-1044</td><td>Engineering tekeningen werden geproduceerd door Fraunhofer CMI</td></tr><tr><td>Glasvenster</td><td>Fraunhofer CMI</td><td>3333-1054</td><td>Glasvenster werd op de juiste maat gesneden bij Fraunhofer CMI</td></tr><tr><td>BOROFLOAT Venster 50 mm x 50 mm</td><td>Edmund Optics Inc.</td><td>NT48-543</td><td></td></tr><tr><td>Afdichtingsplaat</td><td>BU Scientific Instruments Facility</td><td>3333-1045</td><td></td></tr><tr><td>Epoxide glasplaat</td><td>Arrayit Corporation</td><td>SuperEpoxy 2</td><td></td></tr><tr><td>PDMS master</td><td>Fraunhofer CMI</td><td>3333-1053</td><td>Master gemaakt in aluminium of messing met UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine)</td></tr><tr><td>PDMS plaat ontwerp</td><td>Fraunhofer CMI</td><td>3333-1053</td><td></td></tr><tr><td>Tubing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moer, Super flensloos Tinytight, koploos, 1/16 inch, PEEK, groen&nbsp;</td><td>IDEX Health Science</td><td>M-644-03</td><td>Flow cell invoer/uitvoer zijn getapt voor deze ferrule</td></tr><tr><td>Ferrule, Tinytight, 1/16 inch, 6-40,.030 inch TH, PEEK met SS vergrendelingsring, zwart</td><td>IDEX Health Science</td><td>M-657</td><td></td></tr><tr><td>Moer, Super flensloos Tinytight, koploos, 1/16-1/32 inch, 1/4-28, PEEK, natuurlijk</td><td>IDEX Health Science</td><td>P-255</td><td></td></tr><tr><td>Ferrule, Super Falngeless, 1/16 inch, Tefzel (ETFE), geel</td><td>IDEX Health Science</td><td>P-259</td><td>Past op Luer-lock adapter</td></tr><tr><td>Tubing, Teflon FEP,.030 inch x 1/16 inch x 20 ft, groen&nbsp;</td><td>IDEX Health Science</td><td>1520G</td><td></td></tr><tr><td>Adapter, snelkoppeling vrouwelijk Luer naar vrouwelijk 1/4-28, PEEK, rood&nbsp;</td><td>IDEX Health Science</td><td>P-658</td><td></td></tr></tbody></table>

stress-geïnduceerde antibiotica gevoeligheid testen op een chip

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

We hebben een snelle microfluïdische methode ontwikkeld voor het testen van de gevoeligheid van antibiotica in een stressgebaseerde omgeving. Vloeistof wordt met hoge snelheden doorgegeven over bacteriën die op de bodem van een microfluïdisch kanaal zijn geïmmobiliseerd. In aanwezigheid van stress en antibiotica sterven gevoelige bacteriestammen snel af. Resistente bacteriën overleven deze stressvolle omstandigheden echter. De hypothese achter deze methode is nieuw: stressactivatie van biochemische routes, die doelwit zijn van antibiotica, kan het testen van de gevoeligheid van antibiotica versnellen. In vergelijking met standaard antibioticagevoeligheidstestmethoden wordt de snelheidsbeperkende stap - bacteriële groei - weggelaten tijdens het aanbrengen van antibiotica. De technische implementatie van de methode is in een combinatie van standaardtechnieken en innovatieve benaderingen. De standaardonderdelen van de methode omvatten bacteriële kweekprotocollen, het definiëren van microfluïdische kanalen in polydimethylsiloxaan (PDMS), cel levensvatbaarheidsmonitoring met fluorescentie en batchbeeldverwerking voor het tellen van bacteriën. Innovatieve onderdelen van de methode zijn in het gebruik van kweekmediastroom voor mechanische stresstoepassing, gebruik van enzymen om de bacteriën te beschadigen maar niet te doden, en het gebruik van microarray substraten voor bacteriële aanhechting. Het ontwikkelde platform kan worden gebruikt bij de ontwikkeling en het testen van antibiotica en niet-antibiotische geneesmiddelen. In vergelijking met de standaard bacteriële suspensie-experimenten kan het effect van het medicijn herhaaldelijk worden in- en uitgeschakeld gedurende gecontroleerde periodes. Repetitieve observatie van dezelfde bacteriepopulatie is mogelijk in de loop van hetzelfde experiment.

De gegevens in figuur 4 tonen de respons van een gevoelige Staphylococcus aureus stam in de loop van de tijd in een antibioticumbevattend microfluïdisch kanaal. Fasecontrastbeelden die na 1 minuut en aan het einde van het 1 uur durende experiment zijn verkregen, zijn weergegeven in de figuren 4A en B. De geanalyseerde 1 uur gegevens zijn weergegeven in figuur 4C met de bacteriën gemarkeerd in rood (5.828 totaal). Overeenkomstige fluore...

We hebben een microfluïdisch platform ontwikkeld voor snelle antibioticagevoeligheidstests. Vloeistof wordt met hoge snelheden doorgegeven over bacteriën die op de bodem van een microfluïdisch kanaal zijn geïmmobiliseerd. In aanwezigheid van stress en antibiotica sterven gevoelige bacteriestammen snel af. Resistente bacteriën kunnen deze stressvolle omstandigheden echter overleven.

Stress-geïnduceerde antibiotica gevoeligheid testen op een chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om snel de gevoeligheid van bacteriën voor de antibiotica van belang te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst bacteriën in logfase te immobiliseren op de bodem van een microfluïdische kanaal. In de tweede stap wordt media met het antibioticum en een levende dode fluorescerende kleurstof met een hoge stroomsnelheid door het kanaal geduwd, waardoor de bacteriën worden belast en hun antibioticumgerichte biochemische routes worden geactiveerd.Vervolgens worden fasecontrast- en fluorescentiebeelden automatisch om de twee minuten gedurende een uur verzameld om de levensvatbaarheid van bacteriën te controleren, genormaliseerde percentages bacteriële dood worden berekend uit de verkregen beelden op elk tijdstip van het experiment. Uiteindelijk wordt het antibioticagevoeligheidsfenotype van de bacteriën bepaald uit een toename van het genormaliseerde percentage celdood in de loop van de tijd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande fenotypische gevoeligheidstestmethoden zoals bouillon, verdunning of microcultuur, is dat onze methode niet vereist dat de bacteriële deling wordt gecontroleerd.In plaats daarvan kun

stress-induced-antibiotic-susceptibility-testing-on-a-chip

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Het ontwerp van een eenvoudige een-dag workflow regeling voor bacteriële pathogenen diagnostiek maakt het mogelijk snelle herkenning van infecties in het bloed. Het opnemen van acht klinisch relevante bacteriële doelen en de resistentie tegen antibiotica profielen biedt de arts een eerste inzicht op dezelfde dag, wat kan leiden tot meer adequate therapie.

Eendaagse Workflow Regeling bacteriële pathogenen detectie en antimicrobiële resistentie testen van Blood Cultures

Source: Liu, P. C., et al. Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a microfluidic chip to visualize and compare the growth and morphology of wild-type and trimethoprim-resistant E. coli strains under trimethoprim antibiotic stress.

Bacterial Growth on a Microfluidic Chip to Study Antibiotic Drug Resistance

Source: Zhang, M. et. al., Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the application of stimulated Raman scattering microscopy to assess susceptibility to antibiotics by tracking deuterium-labeled metabolic activity. By monitoring carbon–deuterium signals, the method enables rapid detection of resistant and susceptible bacterial populations.

Detection of Bacterial Antibiotic Susceptibility Using a Stimulated Raman Scattering Microscope

This video demonstrates a conductimetric biosensor assay to study the interaction of an antibody with a target antigen immobilized on a transducer chip. The biosensor is engineered to have a bifunctional chimeric protein — a β-lactamase enzyme with a functional catalytic site fused to a nanobody for binding to the immobilized target antigen. Upon binding, the catalytic hydrolysis of an antibiotic substrate by the β-lactamase enzyme generates an electrical signal — confirming the...

&beta;-Lactamase-Based Conductimetric Biosensor Assay for Protein-Protein Interactions

We beschrijven een goedkope, configureerbare morbidostat die de karakterisering van antibioticaresistentie mogelijk maakt door de medicijnconcentratie dynamisch aan te passen. Het apparaat kan worden geïntegreerd met een multiplex microfluïdisch platform. De benadering kan worden opgeschaald voor laboratoriumstudies naar antibioticaresistentie.

Ontwerp en gebruik van een Low Cost, Automatiseren Morbidostat voor Adaptive evolutie van bacteriën onder antibioticum selectie

Antimicrobiële synergie testen wordt gebruikt ter beoordeling van het effect van twee of meer antibiotica in combinatie gebruikt en worden doorgaans uitgevoerd door een van twee methoden: de dambord array of de bepaling van de tijd-doden. Hier presenteren we een geautomatiseerd, inkjet printer-bijgewoonde dambord matrix synergie techniek en een studie van de klassieke tijd-kill synergie.

Antimicrobiële synergie testen door de Inkjet Printer-bijgewoonde geautomatiseerde dambord matrix en de handmatige methode van de tijd-kill

Dit protocol presenteert een snelle antimicrobiële gevoeligheidstest (ASAT) binnen 2,5 uur door eencellige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van het D2O-metabolisme. Deze methode is van toepassing op bacteriën in de urine of volbloedomgeving, die transformerend is voor snelle eencellige fenotypische ASAT in de kliniek.

Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests door gestimuleerde Raman-verstrooiing Beeldvorming van deuteriumincorporatie in een enkele bacterie

Dit protocol beschrijft het ontwerp en het gebruik van een isolatiechip (iChip) voor in situ kweek van recalcitrante bodemmicroben in hun natuurlijke omgeving. Het beschrijft ook de in situ kweek van antimicrobieel producerende bodembacteriën. Het protocol kan worden aangepast om bacteriën te herstellen uit diverse niches met andere gewenste eigenschappen.

In situ Isolatie en kweek van weerbarstige bodembacteriën met behulp van een isolatiechip (iChip)

Dit protocol beschrijft een volledig geïntegreerde methode op basis van een microfluidische chip en LAMP, die point-of-care detectie mogelijk maakt van 15 pathogenen die lagere luchtweginfecties veroorzaken bij IC-patiënten binnen één uur.

Snelle point-of-care detectie van pathogenen voor infecties van de onderste luchtwegen bij IC-patiënten

Een lensless on-chip fluorescentie microscopie platform is aangetoond dat kan afbeelding fluorescerende voorwerpen over een ultra-breed-of-view van bijvoorbeeld,&gt; 0,6-8 cm2 met &lt;4μm resolutie met behulp van een steekproef op basis van compressie-algoritme decodering. Zo'n compacte en wide-field fluorescerende on-chip beeldvormende modaliteit kan waardevol zijn voor high-throughput cytometrie, zeldzame-cel onderzoek en microarray-analyse.

Lensless fluorescentie microscopie op een chip

Leer een microfluidische methode voor snelle antibiotica gevoeligheidstesten van bacteriën onder stresscondities. Deze techniek maakt real-time monitoring van celviabiliteit mogelijk zonder bacteriële deling te volgen.

Stress-geïnduceerde antibiotica gevoeligheid testen op een chip

Meer video's verkennen