Stress-geïnduceerde antibiotica gevoeligheid testen op een chip

Het algemene doel van het volgende experiment is om snel de gevoeligheid van bacteriën voor de antibiotica van belang te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst bacteriën in logfase te immobiliseren op de bodem van een microfluïdische kanaal. In de tweede stap wordt media met het antibioticum en een levende dode fluorescerende kleurstof met een hoge stroomsnelheid door het kanaal geduwd, waardoor de bacteriën worden belast en hun antibioticumgerichte biochemische routes worden geactiveerd.

Vervolgens worden fasecontrast- en fluorescentiebeelden automatisch om de twee minuten gedurende een uur verzameld om de levensvatbaarheid van bacteriën te controleren, genormaliseerde percentages bacteriële dood worden berekend uit de verkregen beelden op elk tijdstip van het experiment. Uiteindelijk wordt het antibioticagevoeligheidsfenotype van de bacteriën bepaald uit een toename van het genormaliseerde percentage celdood in de loop van de tijd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande fenotypische gevoeligheidstestmethoden zoals bouillon, verdunning of microcultuur, is dat onze methode niet vereist dat de bacteriële deling wordt gecontroleerd.

In plaats daarvan kunnen we hun gevoeligheidsprofiel direct uit de bestaande kleine populatie bepalen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de diagnose van resistente bacteriële infecties, omdat de methode snel is, gemakkelijk kan worden gemultiplext en geautomatiseerd. Om de PDMS-laag te maken, begint u met het ontgassen van een vers bereide PDMS-viskeuze mengsel in een vacuümkamer bij kamertemperatuur na een uur. Gebruik een weegschaal om de aluminium mal te vullen met een vooraf gedefinieerde massa van DGAs PDMS-mengsel. Giet de PDMS langzaam over het midden van de mal, zorg ervoor dat de mal genivelleerd blijft en dat de pinnen onbedekt blijven.

Laat de PDMS een nacht lang in een oven van 37 graden Celsius uitharden. De volgende ochtend, los de bovenste malplaat en verwijder voorzichtig de uitgeharde PDMS uit de mal om de flowcell te assembleren. Plaats eerst het glazen venster in de flowcell-pocket.

Leg vervolgens een gecoate glazen dia over het glazen venster in de pocket van de flowcell met de actieve kant naar boven. Plaats de vers gemaakte PDMS-laag met de kanalen naar beneden bovenop zodat de kanaalinvoer uitlijnt met de doorvoeren in de metalen plaat. Duw voorzichtig de lucht tussen de lagen uit en draai vervolgens de PDMS-glasplaatsamenstelling zodat de PDMS naar het glazen venster kijkt.

Laat de PDMS-kanaalinvoeren overlappen met de doorvoeren in de metalen plaat, en plaats vervolgens de drukplaat erop en draai de schroeven vast. Plaats nu de geassembleerde flowcell onder de microscoop, stel de microscoopvergroting in op 60 x en vooralign de kanaalposities om logfasebacteriën voor te bereiden voor het laden in de flowcell. Meng 50 microliter van de overnacht gekweekte bacteriekolonie van belang in 50 milliliter verse MH twee bouillon. Incubeer gedurende drie uur met schudden bij 250 RPM en 37 graden Celsius. Na de subcultuur centrifugeer 10 milliliter van de cultuur gedurende twee minuten bij 1.650 maal G en kamertemperatuur.

Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer de pellet in één milliliter verse MH twee media. Bevestig vervolgens een korte lengte slang aan een één milliliter spuit en spoel de slang met één milliliter media, laat een kleine hoeveelheid media in de slang achter om luchtbellen te voorkomen bij het aantrekken van de bacteriesuspensie. Laad vervolgens 0,7 milliliter van de bacteriën in de spuit en vul twee kanalen van de flowcell met de bacteriecelcultuur.

De transparantie van het kanaal verandert naarmate het met de bacteriën wordt gevuld. Bewaar vervolgens de flowcell gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius om de bacteriën toe te laten hechten aan het oppervlak van de dia. Om de oplossingen voor het experiment voor te bereiden.

Vul eerst twee 60 milliliter spuiten met vers bereide controleoplossing en twee 60 milliliter spuiten met vers bereide antibioticumoplossing. Klik op de spuiten om eventuele luchtbellen te verwijderen en bevestig vervolgens de invoerslang door de respectieve oplossingen door het uiteinde van de slang te duwen. Houd de oplossingen gewikkeld in aluminiumfolie om lichtgeïnduceerde afbraak van de reagentia te voorkomen.

Monteer nu de spuiten met experimentele oplossing op de pomp, een voor een. Pers hun plunjer indien nodig samen om ze op de pomp te passen. Vergrendel de spuiten op hun plaats met een spuithouder met dwarsbalk.

Stel de pompsnelheid in op één milliliter per minuut en het pompvolume op 60 milliliter en spoel de pomp totdat een stabiele vloeistomstroom uit alle spuiten te zien is. Begin nu het experiment door de flowcell uit de incubator te verwijderen en deze op de vooraf uitgelijnde microscoopstand te monteren. Verbind vervolgens een invoerslang afkomstig van een spuit en een uitvoerslang die naar een afvalfles gaat met elk van de flowcell-kanalen.

Op dit punt is het experiment volledig ingesteld en klaar om te beginnen. Stel de fasecontrastacquisitietijd in op 10 milliseconden en de fluorescentieacquisitietijd op 1600 milliseconden, en vervolgens verkrijg fasecontrast- en fluorescentiebeelden voor elke positie voordat u met de stroom begint. Houd er rekening mee dat vóór het begin van de stroombeeldvorming het mogelijk niet is om te focussen op de bodem van het kanaal vanwege de hoge dichtheid van beladen bacteriën in het kanaal.

Start nu de vloeistomstroom. Controleer onmiddellijk of de microscoop op de bodem van de kanalen is gericht. Neem vervolgens fasecontrast- en fluorescentiefoto's van de doelgebieden binnen de eerste minuut van de stroom.

Verkrijg beelden om de twee minuten na de eerste set afbeeldingen totdat 60 minuten stroom heeft plaatsgevonden. Herfocus zo nodig om ervoor te zorgen dat het experiment naar behoren verloopt, kan men de verworven fasecontrast- en fluorescentiegegevens onderzoeken. In dit gegevensmonster werd een gevoelige stam in kanalen één en twee geladen, terwijl een resistente stam in kanalen drie en vier zat.

Aan het einde van het experiment, voer een rein