Name: In vivo herprogrammeren van volwassen lichaamscellen te Pluripotentie door overexpressie van Yamanaka Factors (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T09:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Leer hoe volwassen hepatocyten in vivo worden herprogrammeerd naar pluripotentie via hydrodynamische injectie van plasmiden met Yamanaka-factoren. Deze methode biedt inzicht in celplasticiteit en regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC, Swindon, Verenigd Koninkrijk) en de Europese Commissie FP-7 Programma's NANONEUROHOP (PIEF-GA-2010-276051) en ANTICARB (HEALTH-2008-20157). AY werd ondersteund door een fulltime PhD-beurs van het Ministerie van Onderwijs (Turkije) en IL erkent gedeeltelijke ondersteuning van de British Council en de CAIXA Foundation (Spanje). De financiers hadden geen rol in de ontwerpstudie, gegevensverzameling en -analyse, besluit om te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript.

1. In vivo Reprogramming van leverweefsel door HTV-toediening van pDNA
<ol>
	<li>Laat vrouwelijke Balb/C-muizen, 6 weken oud, een week acclimatiseren in de dierenfaciliteit voordat er enige procedure wordt uitgevoerd.</li>
	<li>Bereid 0,9% zoutoplossing in gedistilleerd water en filter door een 0,22 μm microfilter.</li>
	<li>Bereid een oplossing met 75 μg pCX-OKS-2A en 75 μg van pCX-cMyc plasmide DNA in 1,5 ml 0,9% zoutoplossing per muis. Opmerking: Het totale injectievolume moet tussen 8-10% van het totale lichaamsgewicht liggen. 
	Opmerking: houd de muizen voorafgaand aan de injectie in een verwarmde kamer bij 37 °C tot de staartaderen gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd en uitgezet lijken.</li>
	<li>Induceer anesthesie met isofluraan voorafgaand (in de verwarmde kamer) en tijdens de injectie (met een anesthesiemasker).</li>
	<li>Toedien de pDNA-oplossing of zoutoplossingscontrole met een 27 G-sering door HTV-injectie. Opmerking: voor een succesvolle transfectie moet het totale volume in niet meer dan 5-7 sec worden geïnjecteerd.</li>
	<li>Controleer dat de dieren goed herstellen van de injectie.</li>
</ol>
2. Leverperfusie en isolatie van primaire hepactocyten voor qRT-PCR-studies
<ol>
	<li>Induceer op verschillende tijdstippen, waaronder 2, 4, 8, 12 en 24 dagen na HTV-injectie, diepe anesthesie met isofluraan.</li>
	<li>Spray 70% ethanol op de buik van het dier, maak een incisie door de huid op de ventrale middenlijn met chirurgische schaar en dissepeer de buikspierlaag om de ingewanden bloot te leggen.</li>
	<li>Snij het middenrif om de borstholte met schaar bloot te leggen en klem de cava-ader met vergrendelde pincetten.</li>
	<li>Verplaats de ingewanden naar rechts en de leverkwabben zodat zowel de inferieure cava als de poortader gemakkelijk toegankelijk zijn.</li>
	<li>Canuleer de inferieure cava-ader met een 22 G-katheter en snij de poortader door om overmatige druk te voorkomen.</li>
	<li>Begin de perfusie met 10 ml HBSS-buffer (Ca2+ en Mg2+ vrij, met bicarbonaat), voorverwarmd op 37 °C. Perfuseer de buffer langzaam met een 10 ml-sering, tot de lever wit wordt (3 min).</li>
	<li>Vervolg de perfusie met Lever Digest Medium, voorverwarmd op 37 °C, met een stromingssnelheid van 0,6 ml/min (gedurende 15 min) tot de lever gezwollen en los is. Opmerking: Overmatige vertering en perfusie kunnen hepatocyten of herprogrammeerde cellen beschadigen.</li>
	<li>Vervolg het experiment bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder de lever met een pincet na het doorknippen van de falciforme en coronaire ligamenten en was deze met Hepatocyte Wash Medium, terwijl u deze door een 100 μm celzeef haalt om een celsuspensie te verkrijgen.</li>
	<li>Verzamel de celsuspensie in 50 ml buizen en pas het volume aan tot 15 ml met Hepatocyte Wash Medium.</li>
	<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 50 g gedurende 4 min. Houd de temperatuur op 4 °C. Gooi de supernatant weg (die Kupffer- en epitheelcellen bevat) en suspendeer het cellys in 10 ml Hepatocyte Wash Medium. Opmerking: Het cellys moet heel voorzichtig worden gesuspendeerd, hepatocyten zijn zeer fragiele cellen.</li>
	<li>Herhaal de centrifugatieprocedure in totaal drie keer en suspendeer het uiteindelijke lys in 10 ml Hepatocyte Wash Medium.</li>
	<li>Schat het aantal cellen met behulp van een optische microscoop en een hemocytometer.</li>
	<li>Bereid aliquots van 2 x 106 cellen, centrifugeer bij 300 x g om alle cellen te herstellen en gooi de supernatant weg.</li>
	<li>Op dit punt kan het cellys worden ingevroren en bewaard bij -20 °C tot verdere verwerking of direct worden gebruikt voor de RNA-extractie.</li>
</ol>
3. Genexpressiestudie van geïsoleerde hepatocyten voor upregulatie van pluripotente genen
<ol>
	<li>Extracteer RNA uit 2 x 106 cellen met een spinkolomkit volgens de instructies van de leverancier.</li>
	<li>Gebruik 1 μg van het geëxtraheerde RNA om een twee-staps qRT-PCR uit te voeren volgens de instructies van de leverancier.</li>
	<li>Gebruik de hepatocyten van de met zoutoplossing geïnjecteerde dieren als controle om de relatieve genexpressie van herprogrammering, pluripotentie en hepatocytenmarkers te corrigeren.</li>
</ol>
4. Flowcytometrie-analyse van verhoogde pluripotentie op eiwitniveau
<ol>
	<li>Voer op dag 1 en 4 na injectie leverperfusie uit en isoleer primaire hepatocyten zoals hierboven aangegeven.</li>
	<li>Pas de celdichtheid aan tot 1 x 107 cellen/ml en bereid 100 μl aliquots voor.</li>
	<li>Fixeer de cellen met BD Cytofix-fixeerbuffer en maak doorlaatbaar met 1x BD Perm/Wash-buffer.</li>
	<li>Incubeer de cellen gedurende 30 min met anti-muis OCT4-PerCP-Cy5.5 of anti-muis Nanog-PE.</li>
	<li>Voeg negatieve en isotypecontroles toe.</li>
	<li>Analyseer de gekleurde cellen met een CyAn ADP High Performance Research Flow Cytometer.</li>
</ol>
5. Immunokleuring van leversecties voor markeringen van pluripotentie
<ol>
	<li>Perfuseer de lever vier dagen na injectie zoals hierboven aangegeven, maar alleen met HBSS-buffer om het bloed uit het leverweefsel te verwijderen.</li>
	<li>Snij een stuk leverweefsel en dompel het in 2-methylbutaan (voorgekoeld in vloeibare stikstof) om door te gaan

<ol><li>Blelloch, R., Venere, M., Yen, J., Ramalho-Santos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+In+The+Absence+Of+Drug+Selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells In The Absence Of Drug Selection.</a> Cell Stem Cell. 1, 245-247 (2007).</li>
<li>Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+Without+Viral+Integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration.</a> Science. 322, 945-949 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+Of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblasts+By+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction Of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblasts By Defined Factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+Of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Mouse+Embryonic+And+Adult+Fibroblast+Cultures+By+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction Of Pluripotent Stem Cells From Mouse Embryonic And Adult Fibroblast Cultures By Defined Factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Lines+Derived+From+Human+Somatic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived From Human Somatic Cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Gonzalez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Mouse-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+By+Transient+Expression+Of+A+Single+Nonviral+Polycistronic+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation Of Mouse-Induced Pluripotent Stem Cells By Transient Expression Of A Single Nonviral Polycistronic Vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 8918-8922 (2009).</li>
<li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Mouse+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Without+Viral+Vectors.+%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation Of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors. </a> Science. 322, 949-953 (2008).</li>
<li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piggybac+Transposition+Reprograms+Fibroblasts+To+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Piggybac Transposition Reprograms Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li>
<li>Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Transgene-Free+Induced+Pluripotent+Mouse+Stem+Cells+By+The+Piggybac+Transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Generation Of Transgene-Free Induced Pluripotent Mouse Stem Cells By The Piggybac Transposon.</a> Nat. Meth. 6, 363-369 (2009).</li>
<li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Reprogramming+To+Pluripotency+And+Directed+Differentiation+Of+Human+Cells+With+Synthetic+Modified+Mrna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Reprogramming To Pluripotency And Directed Differentiation Of Human Cells With Synthetic Modified Mrna.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+By+Direct+Delivery+Of+Reprogramming+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation Of Human Induced Pluripotent Stem Cells By Direct Delivery Of Reprogramming Proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Recombinant+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 381-384 (2009).</li>
<li>Anokye-Danso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Mirna-Mediated+Reprogramming+Of+Mouse+And+Human+Somatic+Cells+To+Pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Mirna-Mediated Reprogramming Of Mouse And Human Somatic Cells To Pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 8, 376-388 (2011).</li>
<li>Lin, S. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+Of+Somatic+Cell+Reprogramming+Through+Inducible+Mir-302+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation Of Somatic Cell Reprogramming Through Inducible Mir-302 Expression.</a> Nucleic Acids Res. , (2011).</li>
<li>Miyoshi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+Of+Mouse+And+Human+Cells+To+Pluripotency+Using+Mature+Micrornas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming Of Mouse And Human Cells To Pluripotency Using Mature Micrornas.</a> Cell Stem Cell. 8, 633-638 (2011).</li>
<li>Subramanyam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Targets+Of+Mir-302+And+Mir-372+Promote+Reprogramming+Of+Human+Fibroblasts+To+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple Targets Of Mir-302 And Mir-372 Promote Reprogramming Of Human Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Nat. Biotechnol. 29, 443-448 (2011).</li>
<li>Dolgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flaw+In+Induced-Stem-Cell+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flaw In Induced-Stem-Cell Model.</a> Nature. 470, 13 (2011).</li>
<li>Miura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+In+The+Safety+Of+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Variation In The Safety Of Induced Pluripotent Stem Cell Lines.</a> Nat. Biotech. 27, 743-745 (2009).</li>
<li>Pera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dark+Side+Of+Pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Dark Side Of Pluripotency.</a> Nature. 471, 46-47 (2011).</li>
<li>Saha, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Challenges+In+Using+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+To+Model+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Technical Challenges In Using Human Induced Pluripotent Stem Cells To Model Disease.</a> Cell Stem Cell. 5, 584-595 (2009).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+Of+Germline-Competent+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation Of Germline-Competent Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Varas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Show+No+Common+Retroviral+Vector+Insertions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Show No Common Retroviral Vector Insertions.</a> Stem Cells. 27, 300-306 (2009).</li>
<li>Jia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nonviral+Minicircle+Vector+For+Deriving+Human+Ips+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">A Nonviral Minicircle Vector For Deriving Human Ips Cells.</a> Nat. Meth. 7, 197-199 (2010).</li>
<li>Gonzalez, F., Boue, S., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+For+Making+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Reprogramming+A+La%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Methods For Making Induced Pluripotent Stem Cells: Reprogramming A La.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 231-242 (2011).</li>
<li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotency%3A+History%2C+Mechanisms%2C+And+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotency: History, Mechanisms, And Applications.</a> Genes Dev. 24, 2239-2263 (2011).</li>
<li>Gore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+Coding+Mutations+In+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic Coding Mutations In Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Nature. 471, 63-67 (2011).</li>
<li>Hussein, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+Number+Variation+And+Selection+During+Reprogramming+To+Pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Copy Number Variation And Selection During Reprogramming To Pluripotency.</a> Nature. 471, 58-62 (2011).</li>
<li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hotspots+Of+Aberrant+Epigenomic+Reprogramming+In+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hotspots Of Aberrant Epigenomic Reprogramming In Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Nature. 471, 68-73 (2011).</li>
<li>Yilmazer, A., De Lázaro, I., Bussy, C., Kostarelos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Cell+Reprogramming+Towards+Pluripotency+By+Virus-Free+Overexpression+Of+Defined+Factors.+%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">In Vivo Cell Reprogramming Towards Pluripotency By Virus-Free Overexpression Of Defined Factors. </a> Plos One. 8, (2013).</li>
<li>Liu, F., Song, Y. K., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics-Based+Transfection+In+Animals+By+Systemic+Administration+Of+Plasmid+Dna%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics-Based Transfection In Animals By Systemic Administration Of Plasmid Dna.</a> Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).</li>
<li>Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Levels+Of+Foreign+Gene+Expression+In+Hepatocytes+After+Tail+Vein+Injections+Of+Naked+Plasmid+Dna%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">High Levels Of Foreign Gene Expression In Hepatocytes After Tail Vein Injections Of Naked Plasmid Dna.</a> Hum. Gene. Ther. 10, 1735-1737 (1999).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Past%2C+Present%2C+And+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells: Past, Present, And Future.</a> Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).</li>
<li>Therapy Giacca, M. G. ene , Springer. (2010).</li>
<li>Colella, P., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aav-Mediated+Gene+Supply+For+Treatment+Of+Degenerative+And+Neovascular+Retinal+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Aav-Mediated Gene Supply For Treatment Of Degenerative And Neovascular Retinal Diseases.</a> Curr. Gene Ther. 10, 371-380 (2010).</li>
<li>Dayton, R. D., Wang, D. B., Klein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Advent+Of+Aav9+Expands+Applications+For+Brain+And+Spinal+Cord+Gene+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">The Advent Of Aav9 Expands Applications For Brain And Spinal Cord Gene Delivery.</a> Expert Opin. Biol. Ther. 12, 757-766 (2012).</li>
<li>Mccown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus+%28Aav%29+Vectors+In+The+Cns%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus (Aav) Vectors In The Cns.</a> Curr. Gene Ther. 11, 181-188 (2011).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Adeno-Associated+Viral+Vectors+For+Retinal+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel Adeno-Associated Viral Vectors For Retinal Gene Therapy.</a> Gene Ther. 19, 162-168 (2012).</li>
<li>Herweijer, H., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+And+Prospects%3A+Naked+Dna+Gene+Transfer+And+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Progress And Prospects: Naked Dna Gene Transfer And Therapy.</a> Gene Ther. 10, 453-458 (2003).</li>
<li>Wolff, J. A., Budker, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanism+Of+Naked+Dna+Uptake+And+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Genet%22%5BJournal%5D)">The Mechanism Of Naked Dna Uptake And Expression.</a> Adv. Genet. 54, 3-20 (2005).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Deze studie levert proof-of-principle bewijs van in vivo cel-herprogrammering naar pluripotentie na de efficiënte overdracht en overexpressie van de OKSM-factoren naar de lever van volwassen muizen. Met behulp van verschillende technieken zoals qRT-PCR, flowcytometrie, IHC of serumanalyse, werd het doelweefsel onderzocht om in vivo cel-herprogrammering te observeren. Zeer snel na de inductie van overexpressie van de OKSM-factor in het weefsel, werden pluripotentie-markers opgereguleerd op mRNA- en eiwitniveau (binnen 48 uur). Gedurende deze experimenten bleek dat tussen de 5-15% van de uit het weefsel geëxtraheerde cellen Nanog en Oct3/4 positief waren. Verder werden gedurende 120 dagen geen structurele of functionele afwijkingen in de lever waargenomen. Expressie van transgenen door HTV-injectie van plasmide-DNA in andere weefsels dan de lever (long, milt, nier en hart) is eerder gerapporteerd, maar de niveaus van genexpressie waren minstens 3 ordes van grootte lager dan die in hepatocyten30. De gegevens in deze studie geven aan dat herprogrammering van somatische cellen naar een pluripotente toestand in vivo veilig, snel en efficiënt is. Gezien de meerderheid van de bestaande in vitro cel-herprogrammeringsmethodologieën die over het algemeen pluripotente (iPS) celgeneratie binnen 3 weken bereiken met minder dan 1% efficiëntie32, kan in vivo herprogrammering naar pluripotentie zeer interessante alternatieven bieden. We veronderstellen dat het concept van in vivo herprogrammering naar pluripotentie kan worden toegepast op verschillende soorten somatische cellen met hoge efficiëntie (afhankelijk van de gebruikte vector), maar het niveau van functionele pluripotentie dat wordt bereikt in de in vivo herprogrammeerde cellen zal moeten worden bepaald. Bovendien, met de ontwikkeling van verbeterde protocollen en technologieën, kunnen in vivo herprogrammeerde cellen mogelijk worden geëxtraheerd en gebruikt voor doeleinden in de regeneratieve geneeskunde.
Er zijn enkele kritieke stappen die moeten worden gevolgd om volwassen, somatische cellen in vivo met hoge efficiëntie te herprogrammeren. Het bereiken van hoge niveaus van genexpressie in het doelweefsel is een voorwaarde. In deze studie werd dit geïllustreerd door de efficiënte overdracht en expressie van plasmide-DNA naar hepatocyten te gebruiken met behulp van HTV-injectie. De belangrijkste factoren voor HTV-injectie zijn het volume, dat tussen de 8-10% van het totale lichaamsgewicht van het dier moet zijn, en de snelheid van injectie, die binnen 5-7 seconden moet worden uitgevoerd. Muizen jonger dan 6 weken oud mogen niet worden gebruikt, omdat HTV-injectie meer weefselschade in de lever kan veroorzaken, wat de efficiëntie van cellulaire herprogrammering kan beïnvloeden. De genetische achtergrond van de dieren had geen invloed op het bepalen van de efficiëntie van in vivo herprogrammering, aangezien we eerder vergelijkbare niveaus van herprogrammering hebben gerapporteerd in zowel Balb/C als TNG-A muizen, de laatste een transgene stam die de eGFP reporter in het Nanog-locus heeft ingebracht en wordt gefokt op Sv129 achtergrond29.
We speculeren dat in vivo cel-herprogrammering naar een pluripotente toestand (die moet worden bepaald) kan worden toegepast op andere weefseltypen, op voorwaarde dat de OKSM-factoren efficiënt worden afgeleverd aan doelcellen, waardoor hoge niveaus van genexpressie mogelijk zijn. Een verscheidenheid aan niet-virale en virale genoverdrachtsvectoren zijn bestudeerd in preklinische en klinische onderzoeken om verschillende cel- en weefseltypen te targeten33. Bijvoorbeeld, voor neurale of oculaire weefsels zijn adeno-geassocieerde virussen de voorkeursvector voor efficiënte in vivo genoverdracht34-37, terwijl in spierweefsel injecties met naakt plasmide-DNA relatief hoge niveaus van genexpressie hebben laten zien38,39. Daarom moet de methode van genoverdrachtsvector zorgvuldig worden geselecteerd afhankelijk van het weefseltype om efficiënte en snelle in vivo cel-herprogrammering naar een pluripotente toestand te bereiken.

Ethische bezwaren over het gebruik van embryonale stamcellen zijn een van de beperkingen geweest in de ontwikkeling van stamcelonderzoek. De ontdekking door Yamanaka en collega's dat de geforceerde expressie van vier transcriptiefactoren (namelijk: Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc (OKSM)) kon leiden tot in vitro herprogrammering van somatische cellen in pluripotente cellen, zogenaamde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS-cellen), heeft echter nieuwe kansen geopend. Virale1-5 en non-virale6-10 genoverdracht, eiwit-cytoplasmatische translocatie11,12 en miRNA13-16 transfectie behoren tot de verschillende methoden die tegenwoordig worden gebruikt om iPS-cellen te genereren. Desondanks lijden dergelijke herprogrammeringsmethodologieën aan verschillende problemen die hun translatie naar de klinische praktijk beperken, zoals: a) ernstige beperkingen in de efficiëntie van celherprogrammering; b) het overheersende gebruik van virale vectoren; c) lange en meertrapse protocollen voor kweekcondities; en d) het risico van tumorigeniteit door implantatie van de in vitro gegenereerde iPS-cellen17-20.
Genoverdracht van gedefinieerde transcriptiefactoren3-5 door retrovirussen is de meest gebruikte methode om somatische cellen te herprogrammeren. Het bevat echter de risico's van de mogelijkheid van insertionele mutagenese, stabiele transductie en langdurige proto-oncogene expressie21,22. Non-virale genoverdrachtsvectoren zoals plasmide-DNA6,7,23 of RNA10 levering met behulp van liposomen of elektroporatie zijn ook onderzocht. Hoewel veiliger in vergelijking met virussen, bieden deze vectoren aanzienlijk beperkte transductie en herprogrammeringsefficiëntie24,25 .
Een van de centrale dogma's van dit opkomende veld is dat in vivo implantatie van iPS-cellen zal leiden tot hun ongecontroleerde differentiatie en de vorming van een tumorachtige massa (teratoma), bestaande uit verschillende weefsels uit de drie verschillende kiembladen. Daarom is het concept van herprogrammering naar pluripotentie voornamelijk gericht geweest op in vitro manipulaties van primair geëxtraheerde somatische cellen (meestal fibroblasten). Zoals hierboven beschreven, lijdt dit principe echter aan lange en complexe celkweekprotocollen, inclusief meerdere rondes van behandeling (genoverdracht, groeifactoren, antibiotica, antioxidanten) die zelf de risico's op teratoomvorming of andere vormen van tumorigenese bij implantatie van de cellen kunnen verhogen24-28.
Wij stellen voor dat herprogrammering van volwassen somatische cellen in vivo door de tijdelijke overexpressie van de OKSM-transcriptiefactoren niet leidt tot de vorming van teratomen29. De methode om dat te bereiken zal afhangen van het bereiken van hoge niveaus van transcriptiefactorexpressie binnen het doelweefsel op de meest veilige mogelijke manier. In deze studie hebben we een gevestigde virusvrije genoverdrachtstechnologie geselecteerd die efficiënt de lever heeft getargeerd om cellen in vivo naar pluripotentie te herprogrammeren. Deze technologie omvat grootvolume, snelle hydrodynamicale staartveneninspuiting (HTV) van plasmide-DNA30,31. Hoge expressieniveaus van getransfecteerde genen kunnen worden bereikt in volwassen hepatocyten na deze non-virale genoverdrachtsmethode. Bovendien minimaliseert deze technologie de potentiële risico's van het gebruik van virale vectoren (bijv. permanente genomische insertie, insertionele mutagenese).

<table><tbody><tr><td>pCX-OKS-2A pDNA</td><td>Addgene</td><td>19771</td><td>Verkregen van Addgene als bacteriële stab, plasmideproductie uitgevoerd in Plasmid Factory (Duitsland)</td></tr><tr><td>pCX-cMyc</td><td>Addgene</td><td>19772</td><td>Verkregen van Addgene als bacteriële stab, plasmideproductie uitgevoerd in Plasmid Factory (Duitsland)</td></tr><tr><td>0.22 &mu;m filter</td><td>Milliopore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott</td><td>B505</td><td></td></tr><tr><td>HBSS-buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td>Ca2+ en Mg2+ vrij, met bicarbonaat</td></tr><tr><td>Lever Digest Medium</td><td>Gibco</td><td>17703-034</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Wash Medium</td><td>Gibco</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;m celstrainer</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin RNA II kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.25</td><td>Kit voor RNA-isolatie uit cellen en weefsels</td></tr><tr><td>iScript cDNA-synthesekit</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>iO SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8880</td><td></td></tr><tr><td>Oct3/4 voorwaartse primer</td><td>Sigma</td><td>sequentie gegeven in opmerkingen</td><td>TGAGAACCTTCAGGAGATATGCAA</td></tr><tr><td>Oct3/4 omgekeerde primer</td><td>Sigma</td><td>sequentie gegeven in opmerkingen</td><td>CTCAATGCTAGTTCGCTTTCTCTTC</td></tr><tr><td>Sox2 voorwaartse primer</td><td>Sigma</td><td>sequentie gegeven in opmerkingen</td><td>GGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAG</td></tr><tr><td>Sox2 omgekeerde primer</td><td>Sigma</td><td>sequentie gegeven in opmerkingen</td><td>TCACATGTGCGACAGGGGCAG</td></tr><tr><td>C-myc voorwaartse primer</td><td>Sigma</td><td>sequentie gegeven in opmerkingen</td><td>CAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC</td></tr><tr><td>C-myc omgekeerde primer</td><td>Sigma</td><td>sequentie gegeven in opmerkingen</td><td>TTATGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTTCG</td></tr><tr><td>Nanog voorwaartse primer</td><td>Sigma</td><td>sequentie gegeven in opmerkingen</td><td>CAGAAAAACCAGTGGTTGAAGACTAG</td></tr><tr><td>Nanog omgekeerde primer</td><td>Sigma</td><td>sequentie gegeven in opmerkingen</td><td>GCAATGGATGCTGGGATACTC</td></tr><tr><td>Ecat1 voorwaartse primer</td><td>Sigma</td><td>sequentie gegeven in opmerkingen</td><td>TGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGAT</td></tr><tr><td>Ecat1 omgekeerde primer</td><td>Sigma</td><td>sequentie gegeven in opmerkingen</td><td>ATGGGCCGCCATACGACGACGCTCAACT</td></tr><tr><td>Rex1 voorwaartse primer</td><td>Sigma</td><td>sequentie gegeven in opmerkingen</td><td>ACGAGTGGCAGTTTCTTCTTGGGA</td></tr><tr><td>Rex1 omgekeerde primer</td><td>Sigma</td><td>sequentie gegeven in opmerkingen</td><td>TATGACTCACTTCCAGGGGGCACT</td></tr><tr><td>Alb voorwaartse primer</td><td>Sigma</td><td>sequentie gegeven in opmerkingen</td><td>GTTCGCTACACCCAGAAAGC</td></tr><tr><td>Alb omgekeerde primer</td><td>Sigma</td><td>sequentie gegeven in opmerkingen</td><td>CCACACAAGGCAGTCTCTGA</td></tr><tr><td>Aat voorwaartse primer</td><td>Sigma</td><td>sequentie gegeven in opmerkingen</td><td>CAGAGGAGGCCAAGAAAGTG</td></tr><tr><td>Aat omgekeerde primer</td><td>Sigma</td><td>sequentie gegeven in opmerkingen</td><td>ATGGACAGTCTGGGGAAGTG</td></tr><tr><td>Trf voorwaartse primer</td><td>Sigma</td><td>sequentie gegeven in opmerkingen</td><td>ACCATGTTGTGGTCTCACGA</td></tr><tr><td>Trf omgekeerde primer</td><td>Sigma</td><td>sequentie gegeven in opmerkingen</td><td>ACAGAAGGTCCTTGGTGGTG</td></tr><tr><td>B-actine voorwaartse primer</td><td>Sigma</td><td>sequentie gegeven in opmerkingen</td><td>GACCTCTATGCCAACACAGT</td></tr><tr><td>B-actine omgekeerde primer</td><td>Sigma</td><td>sequentie gegeven in opmerkingen</td><td>AGTACTTGCGCTCAGGAGGA</td></tr><tr><td>BD Cytofix fixatiebuffer</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>1x BD Perm/Wash-buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>anti-muis OCT4-PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>anti-muis Nanog-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>X100-Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Geitenserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>konijn pAb anti-OCT4</td><td>Abcam</td><td>ab19857</td><td>Gebruik in een concentratie van 3 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>konijn pAb anti-SOX2</td><td>Abcam</td><td>ab97959</td><td>Gebruik in een concentratie van 1 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>konijn pAb anti-Nanog</td><td>Abcam</td><td>ab80892</td><td>Gebruik in een concentratie van 1 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>muis mAb anti-SSEA1</td><td>Abcam</td><td>ab16285</td><td>Gebruik in een concentratie van 20 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>geiten pAb anti-konijn IgG gelabeld met Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>111-165-003-JIR</td><td>Gebruik in een concentratie van 1/250</td></tr><tr><td>geiten pAb anti-muis IgG gelabeld met Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-165-003-JIR</td><td>Gebruik in een concentratie van 1/250</td></tr><tr><td>VECTASHIELD montagemedium met DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT vloeibaar substraatsysteem</td><td>Sigma</td><td>B1911</td><td></td></tr><tr><td>Waterig montagemedium</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Fisher</td><td>AA433689M</td><td>Stockoplossing is 16%, gebruik het op 4%</td></tr><tr><td>Hematoxylinen en eosine</td><td>Sigma</td><td>GH53/HT110216</td><td></td></tr><tr><td>PAS-kleuring</td><td>Sigma</td><td>395B</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo herprogrammeren van volwassen lichaamscellen te pluripotentie door overexpressie van yamanaka factors

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) die het resultaat zijn van de herprogrammering van somatische cellen naar een pluripotente toestand door geforceerde expressie van gedefinieerde factoren bieden nieuwe mogelijkheden voor regeneratieve geneeskunde. Dergelijke klinische toepassingen van iPS-cellen zijn tot nu toe beperkt, voornamelijk vanwege de lage efficiëntie van de bestaande herprogrammeringsmethodologieën en het risico dat de gegenereerde iPS-cellen tumoren vormen bij implantatie.
We stelden ons voor dat de herprogrammering van somatische cellen naar pluripotentie in vivo zou kunnen worden bereikt door gentransfer van herprogrammeringsfactoren. Om cellen efficiënt in vivo te herprogrammeren, moeten hoge niveaus van de Yamanaka (OKSM) transcriptiefactoren worden geëxpresseerd in het doelweefsel. Dit kan worden bereikt door verschillende virale of nonvirale genvectoren te gebruiken, afhankelijk van het doelweefsel. In deze specifieke studie werd hydrodynamische staartvene-injectie (HTV) van plasmide-DNA gebruikt om de OKSM-factoren aan muishepatocellen te leveren. Dit leverde bewijs van in vivo herprogrammering van volwassen, somatische cellen naar een pluripotente toestand met hoge efficiëntie en snelle kinetiek. Bovendien werd er geen tumor- of teratoomvorming waargenomen in situ.
Er kan worden geconcludeerd dat het herprogrammeren van somatische cellen in vivo een potentiële aanpak kan bieden om snel, efficiënt en veilig verhoogde pluripotentie te induceren in vergelijking met protocollen die in vitro worden uitgevoerd, en kan in de toekomst worden toegepast op verschillende weefseltypes.

Figuur 1 toont het overzicht van de procedure die de gentransfer van OKSM-coderende plasmiden naar de lever van muizen omvat en de verschillende technieken die zijn uitgevoerd om in vivo celreprogrammering te observeren. Na HTV-injectie van de plasmiden werd op dag 2 na injectie een significante toename in genexpressie van de getransfereerde reprogrammeringsfactoren (Oct3/4, Sox2, Klf4 en cMyc) op mRNA-niveau waargenomen. De expressie van deze factoren neemt na verloop van tijd af na de injectie, zoals getoond in Figuur 2a. Wat betreft de expressie van endogene pluripotentiemarkers (Nanog, Ecat1 en Rex1), waren hun niveaus op dag 2 en 4 na injectie significant verhoogd in vergelijking met die in hepatocyten van dieren die met saline waren geïnjecteerd, en keerden ze vanaf dag 8 terug naar de basiswaarden (Figuur 2b). Tegelijkertijd werd de dedifferentiatie van de hepatocytenpopulatie bevestigd door de downregulatie van hepatocyt-specifieke genen (Alb, Aat en Trf), die op dag 4 statistisch significant was en vanaf dag 8 de basiswaarden bereikte (Figuur 2d).
De expressie van Oct3/4 en Nanog op proteïneniveau werd onderzocht met flowcytometrie. Zoals getoond in Figuur 2c, wordt alleen Oct3/4 tot expressie gebracht op dag 1 na HTV-injectie, terwijl er voor de expressie van de endogene pluripotentiemarker Nanog tot dag 4 gewacht moest worden.
Het voorkomen van in vivo celreprogrammering werd verder bevestigd door immunohistochemische analyse van leverweefsels met anti-OCT4, anti-SOX2 en anti-Nanog antilichamen en door specifieke kleuring voor ALP-activiteit. Positieve cellen voor alle markers en enzymatische activiteit werden reproduceerbaar aangetroffen in de leverweefsels van OKSM-geïnjecteerde dieren, maar niet in de zoutoplossing-geïnjecteerde controles (Figuur 3).
De mogelijke toxische bijwerkingen en teratoomvorming door in vivo celreprogrammering via HTV-injectie van pDNA werden onderzocht door kwantificering van leverenzymgehaltes in serum, evenals H&amp;E- en PAS-kleuring van leverweefselsneden over een periode van 120 dagen. Tot dag 2 werden voorbijgaande en niet ernstige tekenen van weefselschade waargenomen, maar daarna niet meer. Er werd gedurende de studieperiode geen vorming van teratomen of enig teken van dysplasie of morfologische veranderingen waargenomen (Figuur 4). Er waren gedurende de gehele studie bij geen van de dieren hepatische structurele of functionele afwijkingen, zoals bevestigd door albumine- en leverenzymgehaltes en glycogeenkleuring van weefselsneden (Figuren 4b en c).
<img alt="In vivo injectie van herprogrammeringsfactoren, muisdiagram, plasmide, weefselanalyse, PCR, cytometrie." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1. Schematisch overzicht van de in vivo herprogrammeringsprocedure en de analyse ervan. Het protocol bestaat uit twee hoofdfasen: (i) toediening van herprogrammeringsfactoren in vivo en (ii) weefselextractie en monsteranalyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om de figuur in een groter formaat te bekijken</a>.
<img alt="Genexpressieanalyse; staafdiagrammen met relatieve expressiegegevens over meerdere dagen; figuren a-d; wetenschappelijke resultaten." fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 2"> 
Figuur 2. In vivo overexpressie van Yamanaka-transcriptiefactoren in de lever van volwassen muizen. Balb/C-muizen kregen via HTV-injectie uitsluitend 0,9% zoutoplossing, 75 μg pCX-OKS-2A en 75 μg pCX-cMyc in 0,9% zoutoplossing, en op dag 2, 4, 8, 12 en 24 werd er een RT-qPCR-analyse van hepatocyten uitgevoerd om de relatieve genexpressie te bepalen van: (a) getransfecteerde transcriptiefactoren (OKSM) en (b) endogene pluripotentiemarkers; (c) flowcytometrie-analyse van OCT3/4-positieve en Nanog-positieve cellen; (d) relatieve genexpressie van hepatocytmarkers zoals bepaald door RT-qPCR. Alle genexpressieniveaus werden genormaliseerd ten opzichte van de groep met HTV-injectie van zoutoplossing. (* p&lt;0,05 geeft een statistisch significant verschil aan vergeleken met de groepen met HTV-injectie van zoutoplossing, verkregen via variantieanalyse en de paarsgewijze vergelijking van Tukey). Figuur aangepast van Yilmazer et al.29 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig2large.jpg" target="_blank"> Klik hier om de figuur in een groter formaat te bekijken</a>.
<img alt="Vergelijking via immunofluorescentiemicroscopie van OCT4, SOX2, NANOG in cellen behandeld met zoutoplossing versus OKSM." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 3"> 
Figuur 3. In vivo herprogrammering van cellen in leverweefsel van volwassen muizen via immunohistochemie. Balb/C muizen kregen via HTV-injectie enkel 0,9% zoutoplossing, of 75 μg pCX-OKS-2A en 75 μg pCX-cMyc in 0,9% zoutoplossing. Op dag 4 werden de levers geoogst en werden bevroren weefselcoupes gekleurd met anti-OCT4, anti-SOX2 of anti-Nanog antilichamen om de immunoreactiviteit te beoordelen, of met BCIP/NBT om de ALP-activiteit in het weefsel te bepalen (40X). De schaalbalken representeren 100 μm. Figuur aangepast naar Yilmazer et al.29 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om de figuur in een groter formaat te bekijken</a>.
<img alt="Leverhistologie, enzymgehaltes en albumine bij behandeling met saline versus OKSM, experimentresultaten." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 4"> 
Figuur 4. Het effect van in vivo celreprogrammering op de leverfunctionaliteit en histopathologie. Balb/C-muizen die via HTV waren geïnjecteerd met ofwel 75 μg pCX-OKS-2A en 75 μg pCX-cMyc in 0,9% saline, of enkel 0,9% saline. Op dag 2, 4, 8, 12, 50 en 120 werden leverweefsels en sera geïsoleerd en verwerkt voor: (a) H&amp;E-kleuring; (b) gehaltes van leverenzymen; (c) gehaltes van albumine; (d) PAS-kleuring. Representatieve beelden zijn vastgelegd met lichtmicroscopie (10X). Schaalbalken representeren 100 μm. Figuur aangepast van Yilmazer et al.29 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om de grotere figuur te bekijken</a>.

Deze studie toont de herprogrammering van somatische cellen naar pluripotentie in vivo zonder de vorming van teratomen. We gebruikten hydrodynamische injectie in de staartader van plasmide-DNA dat codeert voor de Yamanka-factoren om de in vivo herprogrammering van volwassen hepatocyten in cellen met verbeterde pluripotentie te induceren.

In vivo herprogrammeren van volwassen lichaamscellen te Pluripotentie door overexpressie van Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het induceren en beoordelen van herprogrammering van somatische cellen naar pluripotentie in hun in vivo micro-omgeving. Dit wordt bereikt door een spuit te laden met plasmide-DNA's die de Yamanaka-factoren coderen en deze hydrodynamisch te injecteren in de staartader van een A BC muis als tweede stap. Primaire hepatocyten worden geïsoleerd uit leverweefsel en relevante gen- en eiwitexpressieniveaus worden bestudeerd door real-time Q-R-T-P-C-R en flowcytometrie.Vervolgens worden hele leverweefsels gesneden en gekleurd door verschillende technieken om de herprogrammering van het weefsel te bevestigen en de toxiciteit van de procedure te evalueren. Resultaten worden verkregen die verschillen in gen- en eiwitexpressie van herprogrammerings-, pluripotentie- en hepatocytspecifieke markeringen laten zien. Bovendien wordt de veiligheid van de aanpak ook gevalideerd met biochemisch en histologisch bewijs.Het belangrijkste voordeel van het herprogrammeren van somatische cellen in vivo is dat het snel, efficiënt en tijdelijk gebeurt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van herprogrammering. Bijvoorbeeld, de resultaten van het induceren van pluripotentie in volwassen in vivo.Om te beginnen anesthetiseer een zes weken oude vrouwelijke bulby muis. Bereid vervolgens een plasmide-DNA-oplossing ENC voor die de Yamanaka-factoren codeert en een zoutoplossing als controle, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Om de transfectie succesvol te laten verlopen, injecteer de volledige dosis in niet meer dan vijf tot zeven seconden op vooraf bepaalde tijdstippen na de injectie. Isoleer de primaire hepatocyten door de borstholte bloot te leggen en de lever te perfunderen met voorverwarmde HBSS-buffer en vervolgens leverdigestiemedium perfundeer met een stroomsnelheid van 0,6 liter per minuut gedurende 15 minuten tot de lever opgezwollen en los wordt.Vervolgens verwijder de lever met een pincet na het doorknippen van de falor en coronaire ligamenten. Voor meer details over de isolatie van primaire levercellen, zie de stappen in deze aanvullende JoVE video. Was vervolgens de lever met hepatocytwasmiddel terwijl je het door een 100 micron celzeef laat lopen.Om een celsuspensie te verkrijgen, verzamel de celsuspensie in 50 milliliter buizen en pas het volume aan tot 15 milliliter met hepatocytwasmiddel. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie gedurende vier minuten bij vier graden Celsius bij 50 G. Gooi het supernatant weg en suspendeer het celpellet.In 10 milliliter hepatocytwasmiddel moet het celpellet voorzichtig worden gesuspendeerd, aangezien hepatocyten zeer fragiele cellen zijn. Herhaal de centrifugatieprocedure in totaal drie keer en suspendeer het laatste pellet in 10 milliliter hepatocytwasmiddel. Schat vervolgens het celgetal met behulp van een hemo cytometer en een optisch microscoop om de genexpressie van geïsoleerde hepatocyten te bestuderen.Begin met het centrifugeren van twee keer 10 tot de zesde cellen bij 300 keer G en gooi het snat weg. Extraheer vervolgens het RNA uit de cellen met een spinkolomkit door de instructies van de leverancier te volgen. Gebruik vervolgens één microgram van het geëxtraheerde RNA van de behandelings- en controlegroepen om een twee-staps Q-R-T-P-C-R uit te voeren om te zoeken naar veranderingen in de niveaus van herprogrammerings-, pluripotentie- en hepatocytmarkers.Om de verhoogde pluripotentie van cellen op het eiwitniveau te analyseren, neem de geïsoleerde hepatocyten en pas de dichtheid van de cellen aan tot eenmaal 10 tot de zevende cellen per milliliter. Voor flowcytometrie, bereid 100 microliter aliquots van de celsuspensie voor en fixeer ze vervolgens in 100 microliters BD cyto. Fixeer fixeerbuffer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Na fixatie, pellet de cellen en resus, suspendeer ze in 100 microliters van één X BD permeatiewasbuffer en incubeer gedurende 10 minuten, kamertemperatuur.Incubeer vervolgens de cellen gedurende 30 minuten met primaire antilichamen voor transcriptiefactoren die in pluripotente cellen worden uitgedrukt. Dit omvat anti-muis T vier per CP SCI 5.5 of anti-US nag pe. Zorg ervoor om ook negatieve en isotype controles op te nemen.Analyseer vervolgens de gekleurde cellen in de flowcytometer met per CP sci 5.5 en PE kanalen vier dagen na injectie van de plasmide-DNA cryo sectie, de lever zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Incubeer vervolgens methanol gefixeerde secties in blokkeerbuffer bij kamertemperatuur gedurende één uur, gevolgd door twee wasstappen gedurende vijf minuten elk met wasbuffer. Voeg vervolgens anti T vier anti sokken twee en anti nag primaire antilichamen toe op aparte slides, zorg ervoor dat het leverweefsel volledig wordt bedekt.Bedek de monsters om preventieve aberratie en incubeer de secties een nacht bij vier graden Celsius. De volgende dag, was de secties drie keer gedurende vijf minuten elk met wasbuffer. Incubeer ze vervolgens gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur met hun respectieve secundaire antilichamen na incubatie.Was de leversecties drie keer gedurende vijf minuten elk met PBS. Monteer ze in dappy anti-fade medium en bescherm ze met deksels. Visualiseer vervolgens de slides met een epifluorescentiemicroscoop.Warm de cryo secties gedurende 15 minuten op kamertemperatuur en fixeer ze met 4% paraform aldehyde gedurende twee minuten. Laat de slides vervolgens gedurende 30 minuten aan de lucht drogen. Eenmaal droog, incubeer de secties met B-C-I-P-N-B-T vloeibaar substraat gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.Gedurende deze tijd zal de oplossing reageren met alkalische fosfatase in het weefsel om een onoplosbaar precipitaat te vormen dat zichtbaar is onder de microscoop. Na 30 minuten, was de slides met gedistilleerd water en monteer ze met waterige montage media. Vang vervolgens beelden op met behulp van lichtmicroscopie op dagen 4, 8 12 en 120.Na transfectie, verzamel 300 microliter bloed direct uit de hartkamer. Houd het bloed op ijs terwijl de verschillende monsters worden verzameld om te voorkomen dat het te vroeg stol. Zodra alle monsters zijn verzam

in-vivo-reprogramming-adult-somatic-cells-to-pluripotency

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont de procedure voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van induceerbare lentivirus die uitdrukken Oct4, Sox2, c-Myc en Klf4.

Het genereren van iPS Cellen van MEF door gedwongen Expressie van Sox-2, okt-4, c-Myc en Klf4

De Stemgent Dox Induceerbare Mouse TF lentivirus Set kan herprogrammeren muis embryonale fibroblasten (MEF) om geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen. Hier hebben we het protocol voor DOX-induceerbare expressie van muis herprogrammering transcriptiefactoren Oct4 te tonen, om Sox2, Klf4 en c-Myc genereren iPS kolonies die uitdrukken gemeenschappelijke MES pluripotentie markers.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen door herprogrammeren embryonale fibroblasten van muizen met een vier transcriptiefactor, Doxycycline Induceerbare Lentivirale transductiesysteem

Tonen we het protocol voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met behulp van lentivirus-gemedieerde levering van de menselijke factoren Oct4, Sox2, NANOG, en Lin28. Pluripotentie werd bevestigd door morfologie en de aanwezigheid van embryonale stamcellen (ES) cel-specifieke merkers.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van menselijke fibroblasten herprogrammeren met de Stemgent Human TF lentivirus Set

We presenteren een protocol voor een efficiënte herprogrammering van menselijke somatische cellen in het menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) met behulp van retrovirale vectoren die coderen voor Oct3 / 4, Sox2, Klf4 en c-myc (OSKM) en de identificatie van de opnieuw aangeleerd hiPSC door live kleuring met Tra- 1-81 antilichaam.

Selecteren en isoleren van Koloniën van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen geherprogrammeerd tegen Adult Fibroblasten

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vormen een bron van patiënt-specifieke weefsels voor klinische toepassingen en fundamenteel onderzoek. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) die van bevroren buffy coats in viraal-vrije iPSCs met niet-integrerende episomale plasmiden herprogrammeren.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

Beschikbaarheid van somatische SCs is van cruciaal belang voor regeneratieve geneeskunde, ziekte modellering en inzicht te krijgen in de eigenschappen van de SC. Hier presenteren we experimentele strategieën om te herprogrammeren, in vitro, gedifferentieerde volwassen cellen in hun overeenkomstige uitbreidbaar weefsel-specifieke stam/voorlopercellen door de voorbijgaande uitdrukking van de enkele transcriptionele co activator YAP.

DOVO Generatie van somatische stamcellen door YAP/TAZ

Hier beschrijven we een klinisch relevante, hoog rendement, feeder-vrije methode om te herprogrammeren menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van gemodificeerde mRNAs codering herprogrammering factoren en volwassen microRNA-367/302 nabootst. Ook inbegrepen zijn methoden om herprogrammering efficiëntie, te beoordelen vouw klonale iPSC kolonies en bevestigen van de expressie van de pluripotent markering TRA-1-60.

RNA gebaseerde herprogrammering van menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen

Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna's (NM-Rna's) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

De studie van de lever sinusoïdale endotheelcellen (SEC) moeten worden uitgevoerd met primaire cellen afkomstig van het dier als geen cel-lijnen bestaan. Deze methode is gebaseerd op de lever spijsvertering en differentiële centrifugatie voor SEC zuivering voor latere kweken en experimenteren.

In vivo Lever endocytose gevolgd door zuivering van levercellen door leverperfusie

Leer hoe volwassen hepatocyten in vivo worden herprogrammeerd naar pluripotentie via hydrodynamische injectie van plasmiden met Yamanaka-factoren. Deze methode biedt inzicht in celplasticiteit en regeneratieve geneeskunde.

In vivo herprogrammeren van volwassen lichaamscellen te Pluripotentie door overexpressie van Yamanaka Factors

Meer video's verkennen