Covalente binding van BMP-2 op oppervlakken met een Zelf-geassembleerde monolaag Aanpak

Het algemene doel van deze procedure is om BMP twee moleculen covalent aan oppervlakken te binden zonder hun bioactiviteit te verliezen. Dit wordt bereikt door eerst een goudlaag op een substraat te vormen door fysische dampafzetting. De tweede stap is om een zelf-geassembleerde monolaag van mu NHSA bifunctionele NHS Thiol linker te creëren.

Vervolgens wordt RH BMP twee covalent aan de linker gebonden. De laatste stap is om de niet-gebonden BMP twee door middel van sonicatie te verwijderen. Uiteindelijk wordt een antilichaambindingstest gebruikt om de succesvolle binding van BMP twee op de oppervlakken aan te tonen en wordt de biologische activiteit van oppervlak-gebonden BMP twee in cellen bepaald door analyse van SMA 1 5 8 fosforylering.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van groeifactorbiologie, zoals of de initiële binding van groeifactoren aan hun receptoren op het celoppervlak voldoende is om signaalrespons te triggeren. De procedure wordt gedemonstreerd door twee leden van mijn laboratorium, Teresa Paul en Elizabeth Schwab. Om deze procedure te starten, reinig glasdekslips met precisiedoekjes en soniceer ze gedurende vijf minuten in een een-op-een mengsel van ethylacetaat en methanol.

Na sonicatie, spoel de substraten met methanol en droog ze onder stikstofstroming. Plaats de schone substraten in een sputtercoatingapparaat en vacuüm de kamer. Verwijder de bovenste chroomoxidelaag van het chroomdoel door 60 seconden te sputteren.

Bedek vervolgens het substraat met een 10 nanometer chroomlaag gevolgd door een 40 nanometer goudlaag. Wanneer u klaar bent, verwijder de goudsubstraten uit de kamer en zet ze opzij. Breng de goudsubstraten over in een tweehalsige ronde bodemkolf en incubeer ze in één millimolair M-U-N-H-S in DMF bij kamertemperatuur gedurende vier uur onder stikstofsfeer.

Na incubatie, soniceer de substraten in DMF gedurende twee minuten. Spoel ze met DMF en methanol en droog ze onder stikstofstroming. Verdun de RHB MP twee stockoplossing met één molair natriumchloride in PBS tot een eindconcentratie van 3,5 microgram per milliliter.

Pas deze werkoplossing aan op pH 8,5 met steriele 10 millimolair kaliumhydroxide onmiddellijk voor gebruik. Plaats een A-P-D-M-S ring bovenop het monster. Breng het substraat over naar een zesputsplaat om ervoor te zorgen dat alleen de substraatoppervlakken worden blootgesteld aan de incubatieoplossing.

Bekijk vervolgens de gefunctioneerde M-U-N-H-S substraten met de RHB MP twee werkoplossing bij vier graden Celsius gedurende de nacht. Na het verwijderen van de incubatiesupernatant, voeg één molair natriumchloride in PBS toe en soniceer de substraten gedurende twee minuten. Wanneer u klaar bent, was de substraten drie keer met steriele één molair natriumchloride in PBS om onspecifieke absorptie van antilichamen te blokkeren.

Bekijk de substraten in 5%BSA in PBS gedurende één uur bij kamertemperatuur. Bewerk vervolgens de substraten met een anti BMP twee antilichaamoplossing gedurende één uur bij kamertemperatuur. Wanneer u klaar bent, was de substraten twee keer met PBS en soniceer ze gedurende 30 seconden. Vervolgens bekijk de substraten in een HRP-geconjugeerd secundair antilichaamoplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en was ze vervolgens twee keer met PBS.

Gebruik de amply flu red test om HRP-enzymatische activiteit te meten bij 570 nanometer met een platelezer. Zaai eenmaal 10 tot de vijfde maand C two C 12 myoblasten per put in zesputsplaten in groeimedium en bekijk ze gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5%CO2. Zodra de platen uit de incubator zijn verwijderd, aspireer het medium uit de putten en laat de cellen drie tot vijf uur vasten in serumvrij DMEM voordat ze worden gezaaid op de functionele BMP twee substraatoppervlakken voor de onderzoek van kortetermijn signaal inductie. Vervang het medium met 200 microliters vers serumvrij DMEM en plaats de geïmmobiliseerde BMP twee substraten boven de cellen met behulp van fijnpuntpincet na incubatie bij 37 graden Celsius en 5%CO2.

Verwijder de substraten voorzichtig en aspireer het medium met een pipet. Was vervolgens de cellen twee keer met PBS en ga verder met de analyse van celresponsen met behulp van gelelektroforese en western blotting voor de analyse van langetermijn biologische activiteit. Plaats de cellen op de oppervlakken zoals eerder beschreven en kweek ze bij 37 graden Celsius en 5%CO2 in 2%FBS gedurende zes dagen.

Na incubatie. Beeld de cellen af met behulp van fluorescentiemicroscopie om te verifiëren dat RH BMP twee bindingsoppervlakken die geïmmobiliseerd RH BMP twee presenteren, werden geïncubeerd met een BMP twee specifiek antilichaam en een secundair antilichaam geconjugeerd met HRP. De geïmmobiliseerde RH BMP twee of I BMP twee op het oppervlak werd gedetecteerd vóór en na celstimulatie.

Hier wordt de succesvolle binding van RH BMP twee aan het oppervlak getoond in een bevestiging herkend door de anti BMP twee IgG. De geïmmobiliseerde RH BMP twee op het oppervlak werd gekwantificeerd met behulp van de amli flu red chole metrische test en de gegevens tonen aan dat na celstimulatie het eiwit nog steeds op het oppervlak werd gedetecteerd. Celresponsen op oppervlakken die geïmmobiliseerd RHB MP twee presenteren, werden geëvalueerd en vergeleken met het effect van niet-behandelde goudsubstraten. Hier werden C two C 12 cellen gedurende 30 minuten gestimuleerd door RHB MP twee functionele oppervlakken die van bovenaf naderen.

In dit model remt BMP twee de differentiatie van cellen in multinucleaire myobuizen en induceert osteoblastfenotypen. De activering van SMAD 1 5 8, die downstream reporters van de BMP twee signaalroute zijn, wordt geanalyseerd door western blotting zoals hier getoond. SM-fosforylering wordt waargenomen na 30 minuten stimulatie door I BMP twee, terwijl er geen fosforylering van SMAD 1 58 optreedt