Procedures voor het identificeren van Besmettelijke Prions na passage door het spijsverteringsstelsel van een vogelsoort

Het algemene doel van deze procedure is om het passeren van besmettelijk PreOn-materiaal door het spijsverteringsstelsel van Amerikaanse kraaien te documenteren. Dit wordt bereikt door eerst kraaien te voeren met besmettelijk PreOn-materiaal. De tweede stap is om het uitwerpsel van de kraaien gedurende vier uur na het voeren te verzamelen en voor te bereiden voor injectie in muizen.

Vervolgens worden muizen intraperitoneaal geïnoculeerd met één milliliter van het kruishomogenaat. De laatste stap is om muizen dagelijks te controleren totdat ze klinische tekenen van muis scrapy vertonen. Uiteindelijk wordt western blot-analyse gebruikt om de aanwezigheid van besmettelijk PreOn in het muismodel te bevestigen en de ziekteoverdracht te verifiëren.

Het idee dat kraaien CWD kunnen vervoeren, kwam op een winterdag bij ons toen we op weg waren naar een faciliteit met gevangen elanden waar we onderzoek deden en zagen dat elanden op de weg werden opgegeten door kraaien, en later die dag kwamen kraaien uit de lucht vanuit het niets, landden in de voerbakken, recht naast de elanden, poepten op het graan dat de elanden aten. Bovendien blijkt uit de literatuur dat veel kraaien die in de zomer door Colorado vliegen, in de winter in een geconcentreerd gebied in New Mexico overwinteren, en toevallig is dat gebied in New Mexico waar sommige CABD is opgedoken en het is honderd mijl honderden mijl verwijderd van het epicentrum van crack wasting disease. Dus deze twee waarnemingen brachten ons op het idee dat kraaien mogelijk een rol kunnen spelen bij het vervoeren van CWD door het landschap.

Een visuele demonstratie van deze technieken is van cruciaal belang, omdat onjuiste intraperitoneale en orale gavagetechnieken kunnen resulteren in de dood van onderzoeksdieren. Om te beginnen, voegt u vier druppels blauwe kleurstof toe aan een roerei en mengt u het goed. Trek vervolgens vijf milliliter van de kleurstof en eiermix in een twee-inch gavagenaald met één persoon die de kraai voorzichtig vasthoudt.

Open de snavel van de kraai wijd genoeg om door zijn keel te zien en steek voorzichtig de gavagenaald in zijn slokdarm. Als er enige veranderde ademhaling wordt opgemerkt, verwijder dan de spuit en probeer het opnieuw, omdat het mogelijk in de luchtpijp is geplaatst. Zodra zeker is dat de gavagenaald in de slokdarm zit, drukt u langzaam de inhoud van de spuit uit.

Controleer de kraai elke 30 minuten totdat er geen blauwgekleurd uitwerpsel meer wordt uitgescheiden. De testkraaien deden er ongeveer vier uur over om te stoppen met het uitscheiden van blauwgekleurd uitwerpsel. Voeg vervolgens één deel onbesmet C 57 zwarte zes muishersenstof toe aan vier delen steriele PBS en enkele glazen kralen in een kogelblender.

Homogeniseer het monster gedurende één tot vijf minuten totdat de gladde consistentie is bereikt. Herhaal het proces met terminaal zieke R ML Chandler-stam geïnfecteerde C 57 zwarte zes muishersenstofwaar. Centrifugeer vervolgens het homogene mengsel gedurende één minuut bij 3000 keer G.

Om de grotere deeltjes te verwijderen. Vervolgens verwijdert u het supernatant en verdunt u het met een gelijk volume steriele een XPBS om een ​​gewicht van 10% per volume van hersenmateriaal te genereren. Bewaar de monsters in PBS bij min 80 graden Celsius tot ze nodig zijn 17 uur voorafgaand aan het voeren.

Verwijder het voedsel, maar niet het water uit de kraaienkooien. Wijs de kraaien willekeurig toe aan behandelingsgroepen en voer elke kraai oraal met vijf milliliter vers ontdooid, normaal of geïnfecteerd muishersenstofwaar op met behulp van een twee-inch gavagenaald. Breng vervolgens de kraaien over in individuele kooien.

Verzamel en verzamel al het uitwerpsel binnen elke kooi gedurende vier uur na het voeren. Homogeniseer vervolgens het verzamelde uitwerpsel voor elke kraai in een blauwe kogelhomogenisator met glazen kralen tot een uniforme textuur is bereikt. Neem vervolgens 500 microliter van het mengsel en verdun het een op 20 met 9,5 milliliter steriele PBS, centrifugeer het verdunde feceshomogenaat gedurende 15 minuten.

Voeg 1, 300 keer G toe en breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe buis. Om de dreiging van een secundaire microbiële infectie te minimaliseren, voegt u één eenheid penicilline en één microgram streptomycine per milliliter homogenaat toe. Soniceer vervolgens de monsters in een 3000 MP ator op een vermogensinstelling van 70 gedurende 30 seconden om de membraan van eventuele overgebleven microben te verstoren.

Kies eerst willekeurig de muizen toe aan een van de vier hier getoonde groepen. Groep één ontvangt geïnfecteerde kraaienuitwerpselen. Groep twee ontvangt niet-geïnfecteerde kraaienuitwerpselen.

Groep drie ontvangt geïnfecteerd muishersenstof en groep vier ontvangt normaal muishersenstof. Trek vervolgens voor groepen MN één en twee één milliliter van de scrapy positieve of scrapy negatieve kraaienuitwerpselen op. Homogeniseer met behulp van een 25-gauge naald volgens het groepsnummer van de muis.

Pak vervolgens de muis vast aan zijn dorsale nekhaar. Gebruik de duim en wijsvinger en draai hem voorzichtig om de ventrale kant bloot te leggen. Verhoog het achterste uiteinde van de muis zodat zijn kop iets lager is.

Steek de naald een centimeter door de huid, een centimeter lateraal van de middenlijn en een tot twee centimeter voor de sacroiale gewricht. Trek vervolgens lichtjes terug en injecteer het homogeen langzaam in de lichaamsholte van de muis. Bereid vervolgens het bevroren muishersenstofwaar met en zonder scrappy voor voor injectie in de dieren in groep drie en vier.

Door eerst de haws stock-mengsels een op tien te verdunnen met steriele PBS. Injecteer vervolgens één milliliter van de verdunde scrapy positieve hersenstofwaar in muizen in groep drie en één milliliter van de verdunde scrapy negatieve hersenstofwaar in de muizen. In