Verrijking en zuivering van menselijke embryonale stamcellen door detectie van celoppervlakantigenen met behulp van de monoklonale antilichamen TG30 en GCTM-2

Het algemene doel van deze procedure is om humane embryonale stamcelsubsets te sorteren op basis van hun celoppervlakte-antigeenbinding van de TG 30 en GC TM twee monoklonale antilichamen. Dit wordt bereikt door eerst humane embryonale stamcellen of HESC-culturen te dissociëren in enkele celsuspensies. In de tweede stap worden de HESC gekleurd met de monoklonale antilichamen, TG 30 en GCTM twee.

Ten slotte worden de cellen gescheiden door fluoresceine-geactiveerde celsortering en teruggeplaatst in cultuur. Uiteindelijk kan het kolonievormingsvermogen van de gesorteerd cellen worden beoordeeld door flowcytometrie en fasecontrastmicroscopie. Het voornaamste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals visuele observatie, is dat het een objectieve meting van pluripotentie op cel-voor-celbasis biedt voor een groot aantal cellen, en dit vergemakkelijkt de scheiding van de embryonale stamcellen van de gedifferentieerde cellen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van pluripotentie, zoals hoe veranderingen in de kweekomstandigheden kwantitatief verschillende humane embryonale stamcellen en humane geïnduceerde pluripotente stamcellen beïnvloeden. Het demonstreren van de procedure zal vandaag worden gedaan door onderzoekswetenschappers uit mijn laboratorium, George Zoe Hun Chi en Bay Wang, Om een Hess-enkelcellig suspensie te maken, begint u met het afzuiging van het Hess-kweekmedium uit twee T 75-kolven met een gekweekte Hess-cellijn. Was elke fles met 10 milliliter DPBS en bekijk vervolgens elke cultuur met drie milliliter van de triple E-geëxprimeerde dissociatieoplossing bij 37 graden Celsius en 5%CO2.

Na vijf minuten, tikt u op de zijkant van de fles om de cellen los te maken en bevestig vervolgens loslating onder de microscoop. Voeg vervolgens 10 milliliter koud kweekmedium toe aan elke fles met behulp van een steriele 10 milliliter pipette. Tritureer de gedissocieerde cellen voorzichtig meerdere keren tegen de fleswand om een overwegend enkelcellig suspensie te verkrijgen.

Nu worden de Hess-enkelcellig suspensies gepoold door een 70 micron celzeef in een steriele 50 milliliter polypropyleen buis om Hess-celoppervlakte-antigenen te kleuren. Eerst Eloqua ongeveer 100.000 cellen in 150 microliter media in elk van de zes controle 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Bewerk vervolgens de controlebuisjes en de resterende sorteervoorbeeld met de primaire antilichamen van belang in eindreactievolumes van 200 microliter en ongeveer negen milliliter respectievelijk in kweekmedium inclusief de isotype controles.

Plaats de buisjes horizontaal op ijs en meng ze voorzichtig gedurende 30 minuten op een schuddende platform. Na het spinnen van de cellen, gooit u het supernatant weg en spoelt u het sorteervoorbeeld in 20 milliliter koud kweekmedium en de controlemonsters in 200 microliter van hetzelfde. Bewerk nu het sorteervoorbeeld in een eindvolume van 2,5 milliliter met de juiste secundaire antilichamen in koud kweekmedium en de controles in een eindvolume van 200 microliter van hetzelfde. Voeg op dit moment ook vers bereid PE anti-US CD 90,2 antilichaam toe aan het juiste controlebuisje.

Meng de buisjes nogmaals voorzichtig horizontaal op ijs gedurende 30 minuten op een schuddende platform. Na het spinnen van de cellen, hervat u het sorteervoorbeeld in 20 milliliter koud kweekmedium en de controles in 200 microliter en was de cellen twee keer in het media. Hervat het sorteervoorbeeld in twee tot drie milliliter koud kweekmedium aangevuld met propidiumjodide en elk van de controles behalve de ongekleurde cellen in 300 microliter van hetzelfde.

Zeef vervolgens elke individuele celsuspensie door een 35 micron dekselcelzeef gekoppeld aan vijf milliliter polystyreen ronde bodem testbuisjes en centrifugeer de buisjes om eventuele resterende celsuspensie op de zeefdeksels in de buisjes te dwingen. Tik vervolgens op de zijkanten van de buisjes om elke enkelcellig suspensie te hervatten en plaats de cellen op ijs. Stel de flowcytometer in voor TG 30 GCTM twee fluoresceine-geactiveerde celsortering zodat de gedissocieerde Hess-celsuspensies worden afgesloten als enkele cellen om potentiële klonten en dubbeltjes te elimineren.

Verwijder vervolgens het potentiële puin met de voorwaartse en zijwaartse verstrooiingsgaten zodat alleen de intacte cellen worden gesorteerd. Sluit vervolgens de niet-levensvatbare cellen uit op basis van hun propidiumjodide-expressie. Sluit de muis-embryonale fibroblasten of meth feedercellen uit door negatieve selectie op basis van hun expressie van muis CD 90,2 pe.

Stel de TG 30 G CTM twee negatieve gang in overeenstemming met de achtergrondautofluorescentie voor de ongekleurde cellen en ook de isotypecontroles. De geïsoleerde levensvatbare HESC-fractie vrij van meth feeders kan vervolgens eindelijk worden gefractioneerd in TG 30 negatieve GCT M twee negatieve TG 30 lage GCT M twee lage TG 30 midden GC TM twee midden en TG 30 hoge GCTM twee hoge subpopulaties. Na het instellen van de flowcytometer, voegt u een milliliter van meth geconditioneerd media toe aan elk van de twee vijf milliliter polystyreen ronde bodem testbuisjes en plaatst u ze op ijs.

Herstel vervolgens 400.000 cellen elk van de gedifferentieerde TG 30 negatieve GC TM twee negatieve en de pluripotente TG 30 hoge GCTM twee hoge celsubfracties. Na het spinnen van de verzamelbuisjes, hervat u elk celpellet in een milliliter van vooraf geëquilibreerd MEF geconditioneerd media. Zaai vervolgens een vooraf geëquilibreerde, een derde MEF dichtheid T 75-fles met de HESC van elke fractie in meth geconditioneerd media. Kweek de celculturen bij 37 graden Celsius bij 5%CO2, en ververs het media dagelijks gedurende ongeveer twee weken.

Culturen van pluripotente TG 30 hoge GCTM twee hoge cellen tonen menselijke stamcel-achtige kolonies na een week en bereiken ongeveer 80%co fluentie bij negen tot elf dagen. Culturen van TG 30 negatieve GC TM twee