Name: Met behulp Coculture te sporen Chemisch Mediated Interspecies Interacties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-31T19:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Leer cocultuurscreening voor microbiële interacties met Bacillus subtilis. Deze methode identificeert door microben uitgescheiden verbindingen die genexpressie veranderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteur dankt Roberto Kolter (Harvard Medical School) voor zijn waardevolle adviezen en begeleiding tijdens de ontwikkeling van deze coculture scherm. Zij dankt ook Matthew Powers voor het lezen van het manuscript voor de duidelijkheid, en Chia-Yi Cheng voor hulp bij het ​​verkrijgen van Figuur 6.

<ol><li>Berdy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+microbial+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot%22%5BJournal%5D)">Bioactive microbial metabolites.</a> J. Antibiot. 58, 1-26 (2005).</li>
<li>Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multiple+cell+types+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis.</a> FEMS Microbiol. Rev. 33, 152-163 (2009).</li>
<li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22, 945-953 (2008).</li>
<li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li>
<li>Shank, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+interactions+that+result+in+Bacillus+subtilis+forming+biofilms+are+mediated+mainly+by+members+of+its+own+genus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interspecies interactions that result in Bacillus subtilis forming biofilms are mediated mainly by members of its own genus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1236-1243 (2011).</li>
<li>Piston, D. W., Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J., Claxton, N. S., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPiston%2C+DW+%22Introduction+to+Fluorescent+Proteins%22">Introduction to Fluorescent Proteins</a>. , (2013).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol. Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> J. Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Nicolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condition-dependent+transcriptome+reveals+high-level+regulatory+architecture+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Condition-dependent transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis.</a> Science. 335, 1103-1106 (2012).</li>
<li>Middleton, R., Hofmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+shuttle+vectors+for+ectopic+insertion+of+genes+into+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">New shuttle vectors for ectopic insertion of genes into Bacillus subtilis.</a> Plasmid. 51, 238-245 (2004).</li>
<li>Shimotsu, H., Henner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+single-copy+integration+vector+and+its+use+in+analysis+of+regulation+of+the+trp+operon+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Construction of a single-copy integration vector and its use in analysis of regulation of the trp operon of Bacillus subtilis.</a> Gene. 43, 85-94 (1986).</li>
<li>Guerout-Fleury, A. M., Frandsen, N., Stragier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmids+for+ectopic+integration+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plasmids for ectopic integration in Bacillus subtilis.</a> Gene. 180, 57-61 (1996).</li>
<li>Semsey, S., Blaha, B., Koles, K., Orosz, L., Papp, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integrative+elements+of+rhizobiophage+16-3+can+integrate+into+proline+tRNA+%28CGG%29+genes+in+different+bacterial+genera%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Site-specific integrative elements of rhizobiophage 16-3 can integrate into proline tRNA (CGG) genes in different bacterial genera.</a> J. Bacteriol. 184, 177-182 (2002).</li>
<li>Charpentier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cassette-based+shuttle+vector+system+for+gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Novel cassette-based shuttle vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6076-6085 (2004).</li>
<li>Yang, H. Y., Kim, Y. W., Chang, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+integration-proficient+vector+based+on+the+site-specific+recombination+mechanism+of+enterococcal+temperate+phage+phiFC1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Construction of an integration-proficient vector based on the site-specific recombination mechanism of enterococcal temperate phage phiFC1.</a> J. Bacteriol. 184, 1859-1864 (2002).</li>
<li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites%3A+example+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Protoc. 1, 153-161 (2006).</li>
<li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn7%3A+a+target+site-specific+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Mol. Microbiol. 5, 2569-2573 (1991).</li>
<li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (60), e3796(2012).</li>
<li>Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structurally+diverse+natural+products+that+cause+potassium+leakage+trigger+multicellularity+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).</li>
<li>Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., Wade, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+culture+of+%27unculturable%27+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Strategies for culture of 'unculturable' bacteria.</a> FEMS Microbiol. Lett. 309, 1-7 (2010).</li>
<li>Romano, J. D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas-Saccharomyces+interactions%3A+influence+of+fungal+metabolism+on+bacterial+physiology+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas-Saccharomyces interactions: influence of fungal metabolism on bacterial physiology and survival.</a> J. Bacteriol. 187, 940-948 (2005).</li>
<li>Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+protein+component+of+the+Bacillus+subtilis+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix.</a> Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).</li>
<li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivating+the+uncultured%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cultivating the uncultured.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 15681-15686 (2002).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Een van de inherente beperkingen van dit protocol is doordat het op de cultivability van microbiële organismen. Zoals is goed gedocumenteerd 24 meeste microbiële leven op aarde kan (nog) niet worden gekweekt onder kweekomstandigheden onderzocht om date. Zo zal een groot aantal interacties tussen micro-organismen die zich voordoen in een natuurlijke omgeving onopgemerkt gebruik van deze aanpak. Aangezien onze wens is om niet alleen te identificeren waarin dergelijke wisselwerkingen, maar bestuderen ook mechani...

Wij zijn geïnteresseerd in het begrijpen hoe de metabolieten die bacteriën afscheiden van invloed op de fysiologie en de ontwikkeling van naburige microben. Veel metabolieten zijn gekarakteriseerd op bioactieve effecten op andere microben. Twee goed beschreven voorbeelden omvatten antibiotica, die de groei van andere bacteriën remmen, en quorum sensing moleculen, die de globale genexpressie andere microben veranderen. Echter, bacteriën produceren vele andere kleine molecule natuurlijke producten die geen bekende bioactiviteiten 1 hebben. Onze hypothese is dat bacteriën zijn geëvolueerd en bewaard de mogelijkheid om een ​​aantal van deze metabolieten omdat ze laten zij de cellulaire fysiologie van hun microbiële buren in het complexe microbiële gemeenschappen waarin meeste bacteriën bestaan ​​moduleren. Bacillus subtilis celtypen Wij hebben onze studies gericht op chemisch gemedieerde microbiële interacties die Bacil betrekkenlus subtilis. Dit is niet alleen vanwege zijn status als de Gram-positieve bacterie model en de daaruit voortvloeiende genetische tools beschikbaar voor de manipulatie ervan, maar ook vanwege zijn vermogen om te differentiëren in gekenmerkt celtypen. Voorbeelden omvatten cellen die: zwemmen, produceren de extracellulaire matrix die nodig is voor robuuste biofilmvorming, competent voor het opnemen van DNA uit de omgeving, en sporulerende onder andere 2. Elk van deze celtypen expressie eigenschap transcriptionele regulon dat ze fysiologisch en / of fysisch verschillend van hun genetisch identiek siblings maakt. Onder vele groeiomstandigheden, meerdere celtypen samenleven als verschillende subpopulaties binnen een kolonie van B. subtilis cellen 3. Hoewel veel soorten bacteriën analoog celtype heterogeniteit kunnen vertonen, dit fenomeen is bijzonder goed bestudeerd in B. subtilis. In het bijzonder genen die zijn upregulated binnen elk van deze specifieke B. subtilis celtypen zijn geïdentificeerd. Identificeren van dergelijke genen opgereguleerd is essentieel voor het hier beschreven werk, omdat veel van deze microbiële fenotypes plaats moeilijk of onmogelijk direct waar te nemen. Bijvoorbeeld, we kunnen niet visueel een eigenschap detecteren zoals zwemmen op vaste (1,5%) agar platen, ook al is een subpopulatie van B. subtilis cellen produceren flagella onder die omstandigheden 3. Een ander voorbeeld is biofilm matrix-productie. Matrix productie kan worden gevisualiseerd door kolonie morfologie (zo het resulteert in macroscopisch rimpelige kolonies), maar alleen op bepaalde groeimedium en na meerdere dagen groei 4. Echter, door te weten welke genen opgereguleerd tijdens differentiatie, we kunnen transcriptionele reporters die als merkers voor cellulaire differentiatie in deze celtypes construeren. Reporterconstructieproducten Deze fluorescerende transcriptional reporters omvatten de promoters voor celtype specifieke genen besturen van de productie van een reportergen, bijvoorbeeld een fluorescerend eiwit. Voorbeelden zijn P hag-YFP (voor het zwemmen cellen), P TAPA-YFP (voor biofilm-matrix-producerende cellen), en P SSPB-YFP (voor sporulerend cellen), waarbij P x geeft de promotor regio voor gen-x. Deze reporter constructen geïntegreerd in een neutrale locus op chromosoom (figuur 1 en zie hieronder) zodat de natuurlijke regeling van het fenotype intact wordt gelaten. Echter, nu als een cel drukt dit fenotype, het drukt ook een fluorescerend eiwit. Dit zorgt voor een gemakkelijk gevisualiseerd uitlezen van de activering van bepaalde fenotypische gedrag, waardoor we het scherm voor microben die deze fysiologische respons te activeren. Hoewel dergelijke verslaggevers vaak worden gebruikt in de microbiologie, ze zijn niet in grote lijnen schermen om identif toegepasty metabole interacties tussen microben voordat deze methode werd beschreven 5. Er zijn een aantal belangrijke overwegingen bij het ontwerpen en bouwen van celtype-specifieke reporter stammen. Wij hebben uitsluitend transcriptionele fluorescente reporters gebruikt, hoewel andere soorten constructen zeker mogelijk. We ontmoedigen het gebruik van translationele fusies als merkers voor celtype differentiatie in ons scherm echter om twee redenen: 1) de wens om de natieve celtype-specifiek eiwit onverstoord verlaten, en 2) de erkenning dat een diffuse, cel- brede fluorescentie zal het makkelijker zijn op te sporen dan gelokaliseerde puncta binnen cellen (gemeen met translatiefusies). Reportergen selectie Na de beslissing om de transcriptie te gebruiken als een read-out, moet de reporter-gen worden geselecteerd (bijv. LacZ, fluorescentie, of luciferase). LacZ heeft het voordeel van de minst nodig specialeseerd materiaal te detecteren, maar er is een veel hogere waarschijnlijkheid van valse positieven onder milieu microben. In onze handen, het achtergrondniveau van Lac + organismen onder bodemmicroben was onbetaalbaar hoog (&gt;&gt; 10% van de bodem microben waren blauw (Lac +) op X-gal-platen; gegevens niet getoond). Het is mogelijk dat door titratie van de concentratie van X-gal in het medium, dit kan worden geoptimaliseerd om het gebruik van een X-gal reporter mogelijk, hoewel we dit niet geprobeerd. Luciferase met hoge gevoeligheid van detectie en de orthogonale reporter: er is bijna geen kans milieu microben inherent luminescerende. Toch vonden we het moeilijk om instrumenten te identificeren die onze instelling dat luminescentiedetectie toegestaan ​​over het hele Petri platen, zoals de meeste zijn ontworpen om alleen gelokaliseerde gebieden scannen in multi-well platen. Er kunnen ook complicaties visualiseren luminescerende kolonies op een wijze die ook toegestaan ​​gelijktijdige fysieke isolation induceren organismen. Hoewel het gebruik van vertrouwenspersonen kan dit mogelijk gemaakt hebben, we in plaats daarvan gekozen om fluorescerende transcriptionele verslaggevers, die zijn bewezen te werken in B. gebruiken subtilis, mits er afdoende gevoeligheid van detectie en lage valse positieve tarieven onder bodemorganismen, en mogen gebruiken van gemakkelijk beschikbare instrumentarium voor zowel visualisatie en isolatie procedures. Fluorofoor selectie De specifieke fluorofoor gekozen zal afhangen van uw bacteriën, agar groeimedium dat u gebruikt, en de specifieke fluorescentie filter stelt je beschikbaar hebt. Met onze instrumentatie, vonden wij dat zowel de B. subtilis kolonies zichzelf en de agar ze werden gekweekt op tentoongesteld minder achtergrond fluorescentie wanneer YFP (geel fluorescerend eiwit) filters werden gebruikt, het maken van die reporter superieur aan GFP (groen fluorescerend eiwit) in onze handen. Het codongebruik van fluorescente eiwittenvaak geoptimaliseerd voor eukaryoten, waardoor het belangrijk een fluorofoor ofwel bekend uit de literatuur te werken in bacteriën, of expliciet testen met een constitutieve promoter te selecteren. Een groot aantal steeds veranderende fluorescerend eiwit varianten beschikbaar 6, die zijn beoordeeld in een aantal bronnen 7,8, waarvan sommige leidraad uitdrukkelijk op het kiezen van een geschikt fluorescerend eiwit experiment 9. Promotor selectie De keuze van een promotor zal grotendeels afhangen van uw mobiele type of fenotype van belang. Voor organismen zoals B. subtilis enkele celtype specifieke reporter genen in de literatuur vastgesteld. Voor andere bacteriestammen, onderzoekt microarray of transcriptie gegevens zal nodig zijn om informatie over welke genen in hoge mate gereguleerd onder de voorwaarden aan te bieden waar uw celtype van belang is gemanifesteerd. Een recente studie gecatalogiseerd de transcriptie van B. subtilis onder 104 verschillende groeiomstandigheden behulp tegelwerk microarrays 10. Dit document geeft uitgebreide informatie over welke genen in hoge mate gereguleerd onder verschillende omstandigheden, die van onschatbare waarde is voor minder-goed gekarakteriseerd fenotypes. In plaats van het in kaart brengen precieze promotor regio&#39;s voor elk gen van belang, we meestal gewoon gebruik maken van de reeks 200-500 bp stroomopwaarts van het gen als de promotor. De exacte volgorde lengte is afhankelijk van de genomische context: kortere gebieden worden gebruikt wanneer nodig om te voorkomen zowel stroomopwaarts coderende gebieden van aangrenzende open leesramen. Neutrale loci en integratie Hoe te handhaven de reporterconstruct in uw bacteriestam wordt de laatste vraag in het ontwerpen van een fluorescerende transcriptionele reporter stam. In bacteriën, worden genen van belang regelmatig onderhoudenop plasmiden antibiotische selectie. Echter, kan het niet mogelijk zijn om antibiotica te gebruiken tijdens coculture zonder het doden van de milieu-microben. Als plasmiden stabiel gehandhaafd in bacteriën, kan het mogelijk zijn de bacteriën groeien met een reporter-plasmide gedragen in aanwezigheid van antibiotica aan de reporter bereiden voor screening, en vervolgens elimineren antibiotica tijdens de co-cultuur zich in de hoop dat het plasmide zal voldoende gehandhaafd om voor fluorescentie. Echter, als plasmiden gemakkelijk verloren gaan in je bacterie, of verloren gaan onder stress omstandigheden, zal dit geen haalbare optie. In veel gevallen zal de beste oplossing voor de reporter construct geïntegreerd op het bacteriële chromosoom, die stabiele handhaving van de reporter kan zelfs in de afwezigheid van selectie. Om de integratie van de normale expressie of regulatie van uw gen van belang niet te verstoren, adviseren wij in een buitenbaarmoederlijke website integreren op het chromosoom dat can fungeren als een &quot;neutrale locus.&quot; In B. subtilis deze integratie sites zijn genen die - wanneer veranderd - brengen een fenotype in bepaalde minimale media (waardoor integranten kunnen worden geïdentificeerd zonder antibioticum selectie), nog niet de groei of sporulatie prijzen in rijke media niet veranderen, en omvatten dergelijke genen als amyE, LACA, thrC, pyrD, gltA en saca (transporteren het vermogen om zetmeel te gebruiken, β-galactosiden, threonine, uracil, glutamaat en sucrose, respectievelijk) 11-13. Hoewel integratie in deze genen op betrouwbare wijze zijn gebruikt voor vele jaren B. subtilis (met name amyE en laca), kunnen soortgelijke kennis niet van genen in vele andere bacteriële soorten. Het gebruik van fagen hechtingsplaatsen zijn geweldig alternatief voor neutrale chromosoomintegratie websites: veel soortspecifieke 14-16, alsook van de algemene integratie sites zoals de Tn7 aanhechtingsplaats (att Tn7) hebbengeïdentificeerd en gebruikt voor gen-inserties in vele bacteriesoorten 17,18. Milieu-microben We maken gebruik van de bodem als een directe bron van milieu-microben voor onze coculture scherm. De bodem bevat een grote diversiteit aan microben, en veel van deze organismen rijke bron van natuurlijke producten. Door het gebruik van vloeibare suspensies van de bodem rechtstreeks op platen geplaatst met onze fluorescerende transcriptionele reporter stam (zonder voorafgaande isolatie van bacteriën uit de bodem), hebben we een aanzienlijke vereenvoudiging van de experimentele benadering. De bodem kan ofwel onmiddellijk na de oogst of bij -80 ° C voor toekomstig gebruik worden ingevroren. Onmiddellijk gebruik heeft het voordeel dat een grotere diversiteit aan microben potentieel kan worden gekweekt, ook die welke niet overleeft goed bevriezen. Het nadeel dat de concentratie van kweekbare bodemleven uit deze monsters onbekend is, waardoor het aantal scherm platen die worden gebruikt. Delayed gebruik heeft het voordeel dat de cfu / ml voor elke bron bodem vooraf kan worden bepaald, waardoor een optimale aantal kolonies worden gekweekt op elke zeefplaat. Het vereist echter dat de bodem organismen bestand zijn tegen bevriezing. Merk op dat diversificatie van de inductor zwembad wordt onderzocht (dwz de bodem bronnen) lijkt effectiever te zijn op nieuwe interspecies interacties te identificeren dan een grondige screening op dezelfde grond: grotere fylogenetische diversiteit werd waargenomen in de klappen die in onze matrix-inductie scherm extra bodem bronnen werden onderzocht in plaats van screening dezelfde grond bronnen grondiger (EA Shank en R. Kolter, Harvard Medical School, niet gepubliceerde resultaten). Overzicht De hier beschreven benadering is eenvoudig qua technische eisen. Het gaat om: 1) het construeren van een fluorescerende transcriptionele reporter in B. subtilis of eenandere bacteriële species plaats, 2) het identificeren van voorwaarden waaronder de reporter niet geactiveerd is, 3) het bereiden van porties van deze reporter stam en organismen worden gescreend (in ons geval de bodem, maar andere bronnen kunnen worden gebruikt in plaats), 4) het mengen van deze twee microben op vaste media, 5) het identificeren en isoleren vermeende inducerende organismen, en 6) bevestigt dat deze organismen inderdaad dit fenotype in een secundaire screening kan activeren. Eenmaal geïdentificeerd, deze organismen en hun metabolieten geven ons met chemische hulpmiddelen om bacteriële gedrag te moduleren, om bacteriële fysiologie en microbiële interacties te bestuderen, en om potentieel fungeren als nieuwe steigers voor toekomstige therapeutische verbindingen.

<table><tbody><tr><td>Spectrophotometer</td><td></td><td></td><td>Elk spectrofotometer dat in staat is om OD600 absorptiewaarden te meten.</td></tr><tr><td>Luria broth, Lennox</td><td>VWR</td><td>80017-484</td><td>Alternatieve mediabronnen kunnen nodig zijn.</td></tr><tr><td>Glazen bolletjes, 3 mm</td><td>VWR</td><td>26396-508</td><td></td></tr><tr><td>Gel laadtips, rond</td><td>VWR</td><td>29442-666</td><td></td></tr><tr><td>Glazen staafjes</td><td>VWR</td><td>59060-069</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie dissectie stereoscoop</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>De auteur gebruikte een Zeiss Stemi SV6 dissectie stereoscoop met een EXFO X-cite 120 fluorescente lichtbron, een long-pass YFP filter cube, een achromatisch 0.63X objectief, 10X oogstukken, en een Axio HRC HR digitale camera. Het meeste screenen werd gedaan met de focusring op 2.0-3.2X. Elke dissectie stereoscoop met fluorescentie mogelijkheden is prima, op voorwaarde dat je de juiste filters hebt voor de FP die je gebruikt. Het is het beste als er een sluiter is die je gemakkelijk laat schakelen tussen brightfield en fluorescense, evenals een stage die verlichting van boven en onder toelaat. Als je afbeeldingen wilt vastleggen, is een bijgevoegde camera ook noodzakelijk.</td></tr></tbody></table>

met behulp coculture te sporen chemisch mediated interspecies interacties

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In de natuur, bacteriën zelden in een isolement bestaan, ze zijn in plaats omgeven door een divers scala van andere micro-organismen die de lokale omgeving te veranderen door het afscheiden van metabolieten. Deze metabolieten hebben het potentieel om de fysiologie en de differentiatie van hun microbiële buren moduleren en zullen waarschijnlijk een belangrijke rol in het opzetten en onderhouden van complexe microbiële gemeenschappen. We hebben een fluorescentie gebaseerde coculture scherm dergelijke chemisch gemedieerde microbiële interacties identificeren ontwikkeld. Het scherm omvat het combineren van een tl-transcriptionele reporter stam met milieu-microben op vaste media en waardoor de kolonies groeien in coculture. De fluorescerende transcriptionele reporter is ontworpen dat de gekozen bacteriestam fluoresceert wanneer het uitdrukken van een bepaald fenotype van belang (bijvoorbeeld biofilmvorming, sporulatie, virulentiefactor productie, enz..) Screening wordt uitgevoerd onder kweekomstandigheden where dit fenotype niet tot expressie (en dus de reporterstam typisch niet-fluorescerende). Wanneer een milieu microbe scheidt een metaboliet die dit fenotype activeert, diffundeert door de agar en activeert de fluorescente reporter construct. Hierdoor kan het inducerende-metaboliet producerende microbe te detecteren: zij zijn niet-fluorescerende kolonies meest proximaal van de fluorescerende kolonies. Zo, dit scherm kan de identificatie van milieuaspecten microben die dampdoorlatend metabolieten die een bepaalde fysiologische respons bij een reporter stam activeren produceren. Deze publicatie wordt beschreven hoe u: a) selecteer de juiste coculture screening voorwaarden, b) de voorbereiding van de verslaggever en milieu microben voor screening, c) voert de coculture scherm, d) isoleren vermeende inducerende organismen, en e) bevestigen hun activiteit in een tweede scherm. We ontwikkelden deze methode voor het screenen op bodemorganismen die biofilm matrix-productie in Bacillus subtilis activeren </em&gt;, maar we ook overwegingen bespreken voor de toepassing van deze aanpak naar andere genetisch handelbaar bacteriën.

Dit scherm werd gebruikt voor bodemorganismen identificeren afscheidende verbindingen die de fysiologie van B. veranderen subtilis. De hier beschreven resultaten richten op de matrix producerende cel type B. subtilis, die de eiwitten en exopolysaccharideproduktie die nodig zijn voor robuuste biofilmvorming in deze bacterie produceert. Wij selecteerden de promotor van het TAPA-sipW-TASA operon voor onze fluorescerende reporter construct (P TAPA-YFP). Dit operon code...

Bacteriën produceren uitgescheiden verbindingen die het potentieel heeft om de fysiologie van hun microbiële buren beïnvloeden. Hier beschrijven we een coculture scherm dat de opsporing van dergelijke chemisch gemedieerde interspecies interacties door het mengen bodemmicroben met fluorescerende transcriptionele reporter stammen van Bacillus subtilis op vaste media toelaat.

Met behulp Coculture te sporen Chemisch Mediated Interspecies Interacties

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om interacties tussen verschillende microben te identificeren die worden gemedieerd door uitgescheiden verbindingen en leiden tot veranderingen in bacteriële genexpressie. Dit wordt bereikt door het kweken van bacteriestammen die een fluorescerende transcriptionele reporter bevatten, met omgevingsmicroben als kolonies op agar Petri-schijven. De oranje cirkels vertegenwoordigen kolonies van de omgevingsmicroben.Terwijl de blauwe cirkels kolonies van de reporter zijn, maakt de groei op vaste media het mogelijk dat de metabolieten die deze kolonies produceren door de agar diffunderen en de genexpressie in nabijgelegen reporter-kolonies activeren. De potentiële hits die hier met sterren zijn aangegeven, zijn die kolonies die mogelijk verbindingen uitscheiden die de genexpressie in de reporter veranderen. Deze organismen worden geïsoleerd uit de co-cultuur-screenplaten.Deze potentiële inducers worden opnieuw getest in een secundaire screening om te bevestigen dat het de organismen waren die moleculen uitscheiden die de bacteriële genexpressie in de reporter veranderen. Hoewel deze methode inzicht geeft in de biofilmvormende interacties va

using-coculture-to-detect-chemically-mediated-interspecies

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Speare, L., et al. Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates a co-incubation assay used to study how bacterial strains compete in a shared environment. It is widely applied in microbiology to identify mechanisms, such as contact-dependent or contact-independent killing, that drive these interactions.

Coincubation Assay for Studying Competitive Interactions Between Bacterial Strains

Source: Nathoo, N., et al. A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates a hydroponic co-cultivation system for studying plant–bacteria interactions under sterile conditions. Plant seedlings are transferred into a sterile, acidic growth medium, incubated, and inspected for contamination before inoculation with Agrobacterium. The activated bacteria attach to plant...

A Co-Cultivation System to Study the Molecular Responses of Plant Hosts and Interacting Bacteria

Source: Temkin, M. I. et al. High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates an in vitro assay to study microbial interactions between Corynebacterium propinquum and Staphylococcus in a co-culture.

An In Vitro Assay to Study Microbial Interactions in Co-Culture

Bacteriën kunnen tijdens hun leven schadelijke of gunstige mutaties ophopen. In een populatie van cellen kunnen individuen die gunstige mutaties hebben geaccumuleerd, snel hun medemens overtreffen. Hier presenteren we een eenvoudige procedure om intraspecies-concurrentie in een bacteriële celpopulatie in de loop van de tijd te visualiseren met behulp van fluorescerend gelabelde individuen.

Monitoring intraspecies competitie in een bacteriële celpopulatie door cocultivatie van fluorescerend gelabelde stammen

Het beschreven hydroponische cocultivatiesysteem ondersteunt intacte planten met metalen maasschermen en cocultivateert ze met bacteriën. Plantweefsel, bacteriën en gescheiden moleculen kunnen vervolgens afzonderlijk worden geoogst voor stroomafwaartse analyses, waarbij tegelijkertijd wordt toegelaten dat de moleculaire reacties van zowel plantaardige hosts als interactieve microben of microbiomen worden onderzocht.

Een hydroponisch co-cultuursysteem voor gelijktijdige en systematische analyse van plant- / microbe moleculaire interacties en signalering

Bacteriën coderen diverse mechanismen voor het aangaan van interbacteriële concurrentie. Hier presenteren we een op cultuur gebaseerd protocol voor het karakteriseren van concurrerende interacties tussen bacteriële isolaten en hoe ze van invloed zijn op de ruimtelijke structuur van een gemengde populatie.

Coincubation assay voor het kwantificeren van concurrerende interacties tussen Vibrio fischeri isolaten

De co-cultuur interactie testen gepresenteerd in dit protocol zijn goedkoop, hoge doorvoer, en eenvoudig. Deze testen kunnen worden gebruikt om microbiële interacties in co-cultuur te observeren, interactie patronen te identificeren en het remmende potentieel van een microbiële stam van belang tegen menselijke en milieu pathogenen te karakteriseren.

Co-Culture-tests met hoge doorvoer voor het onderzoek naar microbiële interacties

Dit live-bacteriële celbeeldvormingsprotocol maakt visualisatie mogelijk van interacties tussen meerdere bacteriële soorten op het eencellige niveau in de tijd. Time-lapse imaging maakt het mogelijk om elke bacteriesoort in monocultuur of cocultuur te observeren om interspecies interacties te ondervragen in bacteriële gemeenschappen met meerdere soorten, waaronder individuele celmotiliteit en levensvatbaarheid.

Kinetische visualisatie van single-cell interspecies bacteriële interacties

We beschrijven een aanpak om invasieve celsubpopulaties in realtime te detecteren en vast te leggen. Het experimentele ontwerp maakt gebruik van Real-Time Cellular Analysis door veranderingen in de elektrische impedantie van cellen te monitoren. Invasieve kanker, immuun-, endotheel- of stromale cellen in complexe weefsels kunnen worden vastgelegd en de impact van coculturen kan worden beoordeeld.

Real-time detectie en vastlegging van invasieve celsubpopulaties uit coculturen

Dit protocol biedt een uitgebreide richtlijn voor het opzetten en kwantitatief monitoren van co-culturen, inclusief fotoautotrofe suikerafscheidende cyanobacteriën en heterotrofe gisten.

Assemblage en kwantificering van co-culturen die heterotrofe gist combineren met fototrofe suikerafscheidende cyanobacteriën

Leer cocultuurscreening voor microbiële interacties met Bacillus subtilis. Deze methode identificeert door microben uitgescheiden verbindingen die genexpressie veranderen.

Met behulp Coculture te sporen Chemisch Mediated Interspecies Interacties

Meer video's verkennen