Met behulp Coculture te sporen Chemisch Mediated Interspecies Interacties

Het algemene doel van het volgende experiment is om interacties tussen verschillende microben te identificeren die worden gemedieerd door uitgescheiden verbindingen en leiden tot veranderingen in bacteriële genexpressie. Dit wordt bereikt door het kweken van bacteriestammen die een fluorescerende transcriptionele reporter bevatten, met omgevingsmicroben als kolonies op agar Petri-schijven. De oranje cirkels vertegenwoordigen kolonies van de omgevingsmicroben.

Terwijl de blauwe cirkels kolonies van de reporter zijn, maakt de groei op vaste media het mogelijk dat de metabolieten die deze kolonies produceren door de agar diffunderen en de genexpressie in nabijgelegen reporter-kolonies activeren. De potentiële hits die hier met sterren zijn aangegeven, zijn die kolonies die mogelijk verbindingen uitscheiden die de genexpressie in de reporter veranderen. Deze organismen worden geïsoleerd uit de co-cultuur-screenplaten.

Deze potentiële inducers worden opnieuw getest in een secundaire screening om te bevestigen dat het de organismen waren die moleculen uitscheiden die de bacteriële genexpressie in de reporter veranderen. Hoewel deze methode inzicht geeft in de biofilmvormende interacties van bacillus subtilis met bodemorganismen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals microbiële interacties die de virulentie-expressie in staphylococcus of pseudomona-soorten beïnvloeden. Inderdaad, het kan theoretisch worden toegepast om microbiële interacties te identificeren die de genexpressie voor elke reporter in elk genetisch hanteerbaar microbe veranderen. Na het genereren van fluorescerende reporterconstructies voor uw gekozen organisme, volgens het tekstprotocol, verzamelt u grond door de bovenste 0,5 centimeter van de blootgestelde grondoppervlakte te verwijderen voordat u een spatel gebruikt om grond en conische buizen te verzamelen, voegt u 0,85% steriele zoutoplossing toe in een verhouding van 10 milliliter per één gram grond om een grondslurry te maken en draait deze een minuut lang in een vortex om de bacteriën los te maken van de gronddeeltjes.

Laat de grondslurry een minuut bezinken, breng de bovenste waterige laag over in een verse buis, verdun de reporter- en grondmonsters volgens het tekstprotocol en breng 50 microliters van elk aan op het middelpunt van co-cultuur-screenplaten onder omstandigheden die de reporterconstructie alleen niet activeren. Plaats ook een grondmonster alleen en een reporter alleen als controles. Voeg ongeveer 23 millimeter steriele glazen kralen toe aan elke plaat en verspreid de cellen door de platen op het laboratoriumblad te houden en ze heen en weer te schudden.

Terwijl u draait totdat het vocht is opgenomen, draait u de platen om en gooit u de kralen in een afvalbeker met ethanol. Nadat u de co-cultuurplaten heeft geïncubeerd met behulp van fluorescentie en begint vanaf de bovenkant van de plaat, beweegt u de plaat langzaam heen en weer door het gezichtsveld naar heldere vlekken. Na één volledige draai draait u de plaat 90 graden en herhaalt u het proces.

Wanneer een fluorescerende vlek wordt gedetecteerd, zet u langzaam het helderveld aan en bepaalt u of de fluorescentie geassocieerd is met een bacteriekolonie. Om vermoedelijk inducerende organismen te isoleren, die de niet-fluorescente kolonies zullen zijn die zich dicht bij de fluorescerende kolonies bevinden. Plaats ze in het midden van het gezichtsveld en toegankelijk voor uw dominante hand, waarbij u de fluorescentielamp aan laat.

Zet langzaam het helderveld aan om de fluorescerende kolonie en omringende inducerende organismen te identificeren op basis van vorm en positie. Gebruik een glazen staaf om een ​​steriele ronde 200 microliter gel-ladingtip op te pakken en houd hem als een potlood vast. Laat uw buitenste palm tegen het podium rusten om het op het werkoppervlak te stabiliseren. Plaats vervolgens uw andere hand aan de binnenkant van uw duim om het opneemgereedschap te stabiliseren, waarbij u de pipettip boven het oppervlak van de plaat houdt.

Verplaats het naar het gezichtsveld en centreer het boven de kolonie die u wilt oppikken. De tip zal uit focus zijn. Gebruik de buitenrand van uw hand om de pipettip langzaam naar de te oppakken kolonie te laten draaien.

Raak het heel licht aan en probeer het aantal andere kolonies dat de tip raakt tot een minimum te beperken zonder de opneemtool te draaien. Strijk de tip op een sectie van een verse plaat. Na het oppikken van kolonies, incubeer platen volgens de richtlijnen van de assay.

Wanneer kolonies zichtbaar zijn, gebruikt u een stereoscoop om te bepalen of er één of meerdere soorten organismen op de plaat groeien opnieuw strekken Elke morfotype op een verse plaat en incubeer tot ze zijn gegroeid. Om te testen of vermoedelijk inducerende stoffen echte inducerende stoffen zijn, bereidt u weiden van de reporter en niet-fluorescente ouderlijke stammen voor. Nadat de platen zijn opgedroogd, gebruikt u steriele tandenstokers om cellen uit testkolonies te plukken.

Patch op een blanco plaat en vervolgens op de twee weidenplaten. Alternatief, resus, schors de vermoedelijk inducerende organismen in één milliliter vloeibaar medium in een steriele plastic vet en meet de OD 600 van de suspensies na het normaliseren van de OD van elke suspensie om een ​​OD 600 van 0,5 te bereiken, spot een microliter van elke suspensie op elk van de drie platen. Ten slotte, na het laten groeien van de organismen, gebruikt u fluorescentie onder een dissectiescoop om vermoedelijk inducerende organismen te identificeren die de fluorescerende reporter-stam activeren, maar niet de ouderlijke controlestam.

De screen hier werd gebruikt om bodemorganismen te identificeren die verbindingen uitscheiden die de genexpressie van een structureel onderdeel van de biofilmmatrix in b subtilis veranderen met behulp van een fluorescerende transcriptionele reporter. Ideaal zou elke co-cultuurplaat een één-op-één verhouding moeten bevatten van reporter tot bodemkolonies die nauw gespreid zijn individuele kolonies. Hier illustreren we hoe het hebben van een hoge verhouding van reporterkolonies die worden weergegeven als blauwe cirkels ten opzichte van bodemkolonies die worden weergegeven als bruine cirkels de zekerheid verhoogt bij het lokaliseren van de feitelijke inducerende organisme van co-cultuurplaten.

De inducerende bodemorganismen scheiden verbindingen a