Name: Een High-throughput-compatibele FRET-gebaseerde platform voor identificatie en karakterisering van modulatoren van de lichte keten van botulinum-neurotoxine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Leer een FRET-gebaseerde screeningmethode voor het identificeren van inhibitoren van botulinum-neurotoxine lichte keten. Dit high-throughput protocol versnelt ontdekking van nieuwe therapeutische verbindingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health (AI082190 aan T.J.D.) en het California Institute for Regenerative Medicine (TB1-01186 en CL1-00502).

Handmatige screening of IC50 Bepaling
Dit protocol kan worden gebruikt om de relatieve potentie van een verbinding (IC50 waarde) te bepalen door een verdunningsreeks van de verbinding voor te bereiden, of om handmatig te screenen op remmer van kleine moleculen bij een enkele concentratie.
1. Voorbereiding van buffers, reagentia en benodigde instrumentatie
<ol>
	<li>Bereid 50 ml testbuffer (40 mM HEPES, pH 7,4 en 0,01% Tween-20) voor en steriliseer gefilterd. De buffer kan gedurende enkele maanden op kamertemperatuur (RT) worden bewaard.</li>
	<li>Bereid een werkende verdunning van 70 nM recombinante botulinum neurotoxine/A lichtketting (LC/A (1-425))17 in testbuffer, voorzichtig vortex en bewaar op ijs. Het testen van elke verbinding vereist minimaal 120 µl van LC/A werkende verdunning.</li>
	<li>Bereid een werkende verdunning van 7 µM FRET-gebaseerde BoNT/A LC substraat in testbuffer met 10% DMSO. Verdun aanvankelijk een 5 mM stockoplossing van het substraat in een geschikt volume van 100% DMSO en voeg vervolgens langzaam (druppelgewijs) de testbuffer toe terwijl u voorzichtig mixt. Wikkel in folie en bewaar op ijs. Het testen van elke verbinding vereist minimaal 130 µl van de werkende substraatverdunning.</li>
	<li>Configureer een fluorescentie microtiterplaatlezer om de plaat 10 seconden op medium snelheid te schudden, en bewaak vervolgens de fluorescentie bij excitatie- en emissiegolflengten van 490 nm en 523 nm, respectievelijk, elke 5 min (kinetische modus) gedurende 90 min bij RT. Merk op dat de productvorming (dwz de toename in fluorescentie) gedurende deze periode lineair is (Figuur 1A).</li>
</ol>
2. Voorbereiding van verbindingsverdunningsreeks
<ol>
	<li>Bepaal het concentratiebereik van de verbinding (dwz aantal verdunningen in de verdunningsreeks en verdunningsfactor); het concentratiebereik wordt gekozen op basis van de verwachte IC50 waarde om een optimale curve-fit te garanderen. Voor verbindingen met een onbekende IC50, gebruik onverdunde verbinding stock als de hoogste verbindingsconcentratie.</li>
	<li>Label buisjes met de juiste verbindingsnaam en concentratie.</li>
	<li>Pipetteer 100% DMSO in alle buisjes om ze voor te bereiden op seriële verdunning van de verbinding. Een minimum van 2 µl eindverdunningsvolume wordt aanbevolen, waarbij 1 µl van elke concentratie per putje in de testplaat wordt gebruikt. Bijvoorbeeld, een standaard 1:3 verdunningsreeks vereist het mengen van 2 µl verbinding met 4 µl DMSO per buisje.</li>
	<li>Bereid seriële verdunningen van verbindingen en vortex of meng voorzichtig tussen elke verdunning; verander pipetpunten tussen elke verdunning. Voor de standaard 1:3 verdunningsreeks, voeg 2 µl van de onverdunde verbinding toe aan 4 µl DMSO in de eerste buis van de verdunningsreeks en meng goed. Met een nieuw pipetpunt, verwijder 2 µl van de eerste verdunning en voeg toe aan 4 µl DMSO in de tweede buis; meng goed. Herhaal voor de resterende verdunningen. Zorg ervoor dat de verbindingsverdunningen goed worden gemengd om ervoor te zorgen dat de verbindingsconcentraties nauwkeurig zijn.</li>
	<li>Dek de verbindingsbuisjes af en laat ze bij kamertemperatuur rusten.</li>
</ol>
3. Plaatvoorbereiding en aanbrengen (Tabel 1)
<ol>
	<li>Verkrijg een vlakbodem, ondoorzichtige, zwarte 96-wells plaat. Zie de aanbevolen plaatopstelling in Tabel 1, waarbij elke verbindingsverdunningsreeks is geformatteerd in rijen van een 96-wells plaat. Dispenseer handmatig 1 µl van de respectieve verbindingsverdunning direct naar de bodem van elke overeenkomstige put (putjes 1-9). Dispenseer 1 µl van de hoogste concentratie van de te testen verbinding in put 11 (intrinsiek fluorescentiecontrole van de verbinding).</li>
	<li>Dispenseren handmatig 1 µl van een bekend krachtig remmer in put 12 (positieve controle), en 1 µl 100% DMSO in put 10 (negatieve controle).</li>
	<li>Met een geautomatiseerde pipettor, dispenseren 79 µl testbuffer naar de zijkant van putjes 1-10 en 12 (verbindingsverdunningen en positieve controle), en 89 µl naar de zijkant van put 11 (intrinsiek fluorescentiecontrole van de verbinding). Zorg ervoor dat de punt niet naar de bodem van de put komt waar de verbinding aanwezig is, zodat u de putjes niet kruisbesmetten.</li>
	<li>Vortex de LC/A werkende verdunning en gebruik een geautomatiseerde pipettor om 10 µl aan de zijkant van elke put toe te voegen, behalve put 11 (intrinsiek fluorescentiecontrole van de verbinding). Tik voorzichtig op de plaat om ervoor te zorgen dat alle toegevoegde enzym naar de bodem van de put gaat.</li>
	<li>Meng voorzichtig, dek af, en incubeer de plaat gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Deze incubatie biedt een voorevenwichtsstap voor de verbindingen om zich te binden aan LC/A vóór substraattoevoeging.</li>
</ol>
4. Substraattoevoeging en fluorescentiemeting
<ol>
	<li>Vortex voorzichtig het BoNT/A LC substraat, en voeg met een geautomatiseerde pipettor 10 µl substraat toe aan de andere kant van elke put. Zorg ervoor dat het substraat wordt toegevoegd aan de kant van de put tegenover waar het enzym eerder is toegevoegd.</li>
	<li>Tik voorzichtig op de plaat om de reagentia te mengen, plaats onmiddellijk in de plate reader en begin met de fluorescentiemeting met de instellingen die eerder in stap 1.4 zijn gespecificeerd.</li>
	<li>De enzymsnelheden worden berekend uit de helling van de lijn die wordt gegenereerd door het grafiek maken van de relatieve fluorescentie-eenheid (RFU) versus tijd tijdens de lineaire periode van de reactie.</li>
</ol>
<

<ol><li>Schantz, E. J., Johnson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+use+of+botulinum+toxin+and+other+microbial+neurotoxins+in+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine.</a> Microbiol. Rev. 56, 80-99 (1992).</li>
<li>Sloop, R. R., Cole, B. A., Escutin, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+response+to+botulinum+toxin+injection%3A+type+B+compared+with+type+A%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Human response to botulinum toxin injection: type B compared with type A.</a> Neurology. 49, 189-194 (1997).</li>
<li>Willis, B., Eubanks, L. M., Dickerson, T. J., Janda, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strange+case+of+the+botulinum+neurotoxin%3A+using+chemistry+and+biology+to+modulate+the+most+deadly+poison%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">The strange case of the botulinum neurotoxin: using chemistry and biology to modulate the most deadly poison.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47, 8360-8379 (2008).</li>
<li>Tacket, C. O., Shandera, W. X., Mann, J. M., Hargrett, N. T., Blake, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+antitoxin+use+and+other+factors+that+predict+outcome+in+type+A+foodborne+botulism%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Equine antitoxin use and other factors that predict outcome in type A foodborne botulism.</a> Am. J. Med. 76, 794-798 (1984).</li>
<li>Capek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+Pharmacokinetic+Properties+of+Botulinum+Neurotoxin+Serotype+A+Protease+Inhibitors+Through+Rational+Design%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhancing the Pharmacokinetic Properties of Botulinum Neurotoxin Serotype A Protease Inhibitors Through Rational Design.</a> ACS Chem. Neurosci. 2, 288-293 (2011).</li>
<li>Schmidt, J. J., Bostian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+of+synthetic+peptides+by+type+A+botulinum+neurotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">Proteolysis of synthetic peptides by type A botulinum neurotoxin.</a> J. Protein Chem. 14, 703-708 (1995).</li>
<li>Schmidt, J. J., Bostian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoproteinase+activity+of+type+A+botulinum+neurotoxin%3A+substrate+requirements+and+activation+by+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">Endoproteinase activity of type A botulinum neurotoxin: substrate requirements and activation by serum albumin.</a> J. Protein Chem. 16, 19-26 (1997).</li>
<li>Schmidt, J. J., Stafford, R. G., Bostian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+A+botulinum+neurotoxin+proteolytic+activity%3A+development+of+competitive+inhibitors+and+implications+for+substrate+specificity+at+the+S1%27+binding+subsite%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Type A botulinum neurotoxin proteolytic activity: development of competitive inhibitors and implications for substrate specificity at the S1' binding subsite.</a> FEBS Lett. 435, 61-64 (1998).</li>
<li>Schmidt, J. J., Stafford, R. G., Millard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+assays+for+botulinum+neurotoxin+proteolytic+activity%3A+serotypes+A%2C+B%2C+D%2C+and+F%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem.%22%5BJournal%5D)">High-throughput assays for botulinum neurotoxin proteolytic activity: serotypes A, B, D, and F.</a> Anal. Biochem.. 296, 130-137 (2001).</li>
<li>Schmidt, J. J., Stafford, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorigenic+substrates+for+the+protease+activities+of+botulinum+neurotoxins+serotypes+A%2C+B%2C+and+F.%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fluorigenic substrates for the protease activities of botulinum neurotoxins serotypes A, B, and F.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 297-303 (2003).</li>
<li>Pellett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+cell+based+assays+for+botulinum+neurotoxin+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Progress in cell based assays for botulinum neurotoxin detection.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 257-285 (2013).</li>
<li>Boldt, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization+and+development+of+a+high-throughput+methodology+for+the+discovery+of+botulinum+neurotoxin+a+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization and development of a high-throughput methodology for the discovery of botulinum neurotoxin a inhibitors.</a> J. Comb. Chem. 8, 513-521 (2006).</li>
<li>Henkel, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+properties+of+botulinum+neurotoxin+subtypes+A3+and+A4%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Catalytic properties of botulinum neurotoxin subtypes A3 and A4.</a> Biochemistry. 48, 2522-2528 (2009).</li>
<li>Joshi, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+biologically+active+botulinum+neurotoxin--A+in+serum+using+high-throughput+FRET-assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of biologically active botulinum neurotoxin--A in serum using high-throughput FRET-assay.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 65, 8-12 (2012).</li>
<li>Smith, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reexamining+hydroxamate+inhibitors+of+botulinum+neurotoxin+serotype+A%3A+extending+towards+the+beta-exosite%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Reexamining hydroxamate inhibitors of botulinum neurotoxin serotype A: extending towards the beta-exosite.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 3754-3757 (2012).</li>
<li>Eubanks, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+and+in+vivo+disconnect+uncovered+through+high-throughput+identification+of+botulinum+neurotoxin+A+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 2602-2607 (2007).</li>
<li>Baldwin, M. R., Bradshaw, M., Johnson, E. A., Barbieri, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-terminus+of+botulinum+neurotoxin+type+A+light+chain+contributes+to+solubility%2C+catalysis%2C+and+stability.%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">The C-terminus of botulinum neurotoxin type A light chain contributes to solubility, catalysis, and stability.</a> Protein Expr. Purif. 37, 187-195 (2004).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Capkova, K., Hixon, M. S., McAllister, L. A., Janda, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+discovery+of+potent+inhibitors+of+botulinum+neurotoxin+A%3A+development+of+a+robust+LC+MS+based+assay+operational+from+low+to+subnanomolar+enzyme+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Toward the discovery of potent inhibitors of botulinum neurotoxin A: development of a robust LC MS based assay operational from low to subnanomolar enzyme concentrations.</a> Chem. Commun. , 3525-3527 (2008).</li>
<li>Pires-Alves, M., Ho, M., Aberle, K. K., Janda, K. D., Wilson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+fluorescent+proteins+as+enhanced+FRET-based+substrates+for+botulinum+neurotoxin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Tandem fluorescent proteins as enhanced FRET-based substrates for botulinum neurotoxin activity.</a> Toxicon. 53, 392-399 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De FRET-gebaseerde BoNT/A LC-test die hier wordt beschreven, is een aantrekkelijke methode voor het identificeren en karakteriseren van kleine moleculen die de BoNT/A LC-activiteit moduleren. De oplossingsgebaseerde aard van de test maakt dit protocol geschikt voor high-throughput screening zoals beschreven in de sectie Geautomatiseerde werking van de Protocoltekst. De Z-factor wordt vaak gebruikt om de geschiktheid van een test voor HTS-campagnes te bepalen18. Bepaald als Z = 1 – 3 (σp + σn</s...

Botulinum neurotoxin A (BoNT/A), de krachtigste bekende toxine op dit moment (LD50 ~1 ng/kg)1, is een krachtige neurotoxine die wordt geproduceerd door de bacterie Clostridium botulinum. Binnen een getroffen gastheer, verstoort BoNT/A de neurotransmissie bij de neuromusculaire junctie door motorische neuronen te binden, in het cytosol te internaliseren en uiteindelijk neuronale eiwitten af te breken die essentieel zijn voor acetylcholine exocytose. Eenmaal in een neuron, kan BoNT/A tot wel enkele maanden aanhouden2. Langetermijnremming van acetylcholine-afgifte belemmert normale spiercontractie en resulteert in slappe verlamming, die in ernstige gevallen kan leiden tot cardiale en/of respiratoire falen. Vanwege zijn extreme potentie, gemakkelijke productie en langetermijneffecten binnen de gastheer, heeft de CDC alle BoNT-serotypen gelabeld als hoog-risico bioterrorisme-agenten.
De werkingsmechanisme van de toxine omvat talrijke stappen, waaronder binding aan neuronale oppervlaktereceptoren, cellulaire opname via receptor-gemedieerde endocytose en translocatie naar het neuron cytosol. BoNT/A bestaat uit twee ketens, een zware en een lichte keten, en beide ketens zijn vereist voor toxiciteit. De zware keten (HC) bevat bindings- en translocatiedomeinen, terwijl de lichte keten (LC) een zink-afhankelijke metalloprotease is die van de endosome naar het cytoplasma transloceert. Eenmaal in het cytosol, lokaliseert de LC/A metalloprotease zich aan de binnenste cytoplasmatische membraan en kleurt het membraangebonden gastheereiwit SNAP-25. SNAP-25 is een lid van de SNARE (Soluble N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment Protein Receptor) eiwitfamilie, die een cruciale rol speelt bij acetylcholine exocytose (beoordeeld in referentie3). LC/A-afbraak van SNAP-25 belemmert de SNARE-complexfunctie, wat de neurotransmitterafgifte van acetycholine remt en spiercontractie belemmert.
Momenteel is de behandeling voor botulisme beperkt en omvat vaak toediening van een equus neutraliserend antilichaam4; echter, omdat de toxine snel wordt geïnternaliseerd in neuronen, heeft het antilichaam een beperkte tijdsperiode voor toediening. Daarom geloven veel onderzoekers dat de BoNT/A LC een beter therapeutisch doelwit kan zijn. Omdat de LC een zink-afhankelijke metalloprotease is, is een aanpak om de LC/A-activiteit te remmen, het ontwikkelen van verbindingen die het actieve-site zinkion cheleren. Bijvoorbeeld, hydroxamaatverbindingen cheleren het actieve-site zink en hebben uitstekende in vitro potentie (Ki van de beste BoNT/A LC kleine molecuulremmer tot nu toe is 77 nM)5. Echter, veel kleine moleculen falen om door verschillende problemen ex vivo of in vivo te vorderen, waaronder slechte wateroplosbaarheid, snelle metabolisme, en/of hoge cytotoxiciteit. Daarom zijn nieuwe verbindingen met verbeterde farmacologische en farmacokinetische eigenschappen nodig. Kleine molecuulverbindingsidentificatie omvat vaak high-throughput screening (HTS) om nieuwe scaffolds te identificeren. Aanvankelijke methoden voor BoNT/A LC-activiteitsscreening waren gebaseerd op HPLC-detectie van korte peptide substraatafbraak, wat tijdrovend is en niet geschikt is voor HTS-toepassingen6-8. Vervolgens ontwikkelden Schmidt en collega's9 een high-throughput BoNT/A LC-activiteitsassay die een fluoresceïne-gelabelde peptide substraat gebruikt dat covalent aan een microtiterplaat is bevestigd. De BoNT/A LC kleurt het substraat en geeft fluoresceïne vrij, wat kan worden gekwantificeerd met een fluorometer. Het plaatformaat van deze assay maakt het mogelijk om talrijke verbindingen tegelijkertijd te screenen; echter, de assay vereist het labelen van synthetische peptiden met fluoresceïne en het coaten van de assayplaten met gederivatiseerde substraatmoleculen, wat bewerkelijk zijn. Een veel eenvoudiger methode voor het detecteren van BoNT/A LC-activiteit bij lage concentraties werd later beschreven door Schmidt et al., waarbij een reeks fluorogene substraten werd gebruikt om BoNT LC-activiteit in real time te monitoren10. Aanvullende technieken beschreven in de literatuur omvatten een depolarisatie na resonantie energieoverdracht-gebaseerde assay om BoNT-activiteit in ruwe extracten te detecteren en te kwantificeren; deze methode kan worden gebruikt voor high-throughput toepassingen10,11, hoewel het geavanceerde apparatuur vereist om fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET) en polarisatie signalen te meten. Ten slotte zijn er verschillende cel-gebaseerde modellen voor BoNT-intoxicatie gerapporteerd (beoordeeld in referentie11) die onderzoekers in staat zullen stellen om de vaak beperkende eigenschappen van eerder genoemde verbindingen te bestuderen, inclusief cytotoxiciteit, celpermeabiliteit en stabiliteit. Echter, de meeste van de bestaande cel-gebaseerde assays zijn niet geschikt voor HTS, en zijn arbeids- en tijdintensief.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor een HTS-methode die gebruikmaakt van de commercieel verkrijgbare FRET-gebaseerde BoNT/A LC substraat. Het substraat is gebaseerd op de SNAP-25-afbraaksequentie en is een synthetisch 13-mer peptide dat een terminaal fluorofoor en demper bevat. BoNT/A-afbraak scheidt de fluorofoor en demper, wat FRET afschaft en gemeten fluorescentie verhoogt, wat continu kan worden gemeten in een fluorometer plaatlezer. De assay wordt routinematig gebruikt in onze, evenals andere laboratoria, om nieuwe klassen van BoNT/A LC remmers te identificeren of om de relatieve potentie van eerder geïdentificeerde verbindingen te bepalen5,12-15. Deze assay is geschikt voor HTS vanwege zijn eenvoud, automatiseringspotentieel, lage materiaalkosten en vermogen om talrijke verbindingen tegelijkertijd te screenen (zie referentie16; Caglıet al., ingediend; Bompianiet al., in voorbereiding). Naast HTS kan deze assay worden gebruikt om de relatieve potentie van verbindingen te vergelijken door de IC50 waarde (concentratie vereist om 50

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Teknova</td><td>H1021</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (HPLC-kwaliteit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (HPLC-kwaliteit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>96-well Black assay plaat</td><td>Costar</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>384-well Lage volume zwarte assay plaat</td><td>Greiner</td><td>788076</td><td></td></tr><tr><td>SNAPtide FITC/Dabcyl substraat</td><td>List Biological Laboratories</td><td>521</td><td>FRET-gebaseerde BoNT/A LC substraat</td></tr><tr><td>Pin cleaning oplossing</td><td>V&amp;P Scientific</td><td>VP 110</td><td></td></tr><tr><td>Lint-vrij blotting papier</td><td>V&amp;P Scientific</td><td>VP 540DB</td><td></td></tr><tr><td>Biomek Seal en Sample Aluminiumfolie deksels</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td></td></tr></tbody></table>

een high-throughput-compatibele fret-gebaseerde platform voor identificatie en karakterisering van modulatoren van de lichte keten van botulinum-neurotoxine

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Botulinum neurotoxin (BoNT) is een krachtig en mogelijk dodelijk bacterieel toxine dat zich bindt aan motorische neuronen van de gastheer, wordt geïnternaliseerd in de cel en intracellulaire eiwitten afbreekt die essentieel zijn voor de afgifte van neurotransmitters. BoNT bestaat uit een zware keten (HC), die de binding en internalisatie van gastheercellen mediëren, en een lichte keten (LC), die intracellulaire gastheereiwitten afbreekt die essentieel zijn voor de afgifte van acetylcholine. Terwijl therapieën die toxinebinding/internalisatie remmen een kleine tijdsvenster voor toediening hebben, hebben verbindingen die zich richten op de intracellulaire LC-activiteit een veel groter tijdsvenster voor toediening, wat bijzonder relevant is gezien de extreem lange halfwaardetijd van het toxine. In de afgelopen jaren zijn kleine moleculen zwaar geanalyseerd als mogelijke LC-remmers op basis van hun verhoogde cellulaire permeabiliteit in vergelijking met grotere therapeutischa (peptiden, aptamers, etc.). De identificatie van kandidaten omvat vaak high-throughput screening (HTS), waarbij grote bibliotheken van kleine moleculen worden gescreend op basis van hun vermogen om de functie van het therapeutische doelwit te moduleren. Hier beschrijven we een FRET-gebaseerde assay met een commercieel BoNT/A LC-substraat en recombinant LC die kan worden geautomatiseerd voor HTS van potentiële BoNT-remmers. Bovendien beschrijven we een handmatige techniek die kan worden gebruikt voor secundair follow-upscreening, of voor het vergelijken van de potentie van verschillende kandidaatverbindingen.

De FRET-gebaseerde BoNT/A LC-assay kan handmatig in een low-throughput-modus worden uitgevoerd om bekende remmers te karakteriseren of kleine bibliotheken te screenen; alternatief kan het protocol worden geschaald en geautomatiseerd voor high-throughput screening (HTS) met grote bibliotheken met als doel nieuwe BoNT/A LC-remmers te identificeren. Ongeacht de gekozen aanpak moet er na verloop van tijd een toename in fluorescentie worden waargenomen wanneer BoNT/A LC wordt geïncubeerd met het substraat (Figuur 1A</...

De lichte keten van het botulinum-neurotoxine type A (BoNT/A LC) is een metalloprotease die motorneuronen binnendringt, zijn substraat SNAP-25 splitst en de neurotransmissie verstoort, wat resulteert in slappe verlamming. Met behulp van een op hoog-doorvoer geschikte FRET-gebaseerde test, kunnen grote bibliotheken van kleine moleculen worden getest op hun impact op de enzymatische activiteit van BoNT/A LC.

Een High-throughput-compatibele FRET-gebaseerde platform voor identificatie en karakterisering van modulatoren van de lichte keten van botulinum-neurotoxine

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Het algemene doel van deze procedure is om kleine moleculen te screenen op botulinum neurotoxine, een lichte kettingremming. Dit wordt bereikt door eerst verbindingsverdunningsreeksen met hoge nauwkeurigheid en precisie voor te bereiden. De tweede stap is om verbindingsverdunningsreeksen over te brengen naar een zwarte 96-wellsplaat.Vervolgens wordt verdunde lichte kettingenzyme aan de plaat toegevoegd en wordt het enzym gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met de verbinding geïncubeerd. De laatste stap is het toevoegen van het lichte kettingfret-substraat om de reactie te initiëren, die wordt gemonitord met een fluorescentieplaatlezer. Uiteindelijk moeten secundaire screens die een niet-fluorescente peptide-substraat gebruiken, worden toegepast om de verbindingsactiviteit te bevestigen en meer rigoureuze kinetiekconstanten zoals de remmerdissociatieconstante of ki te bepalen.Het belangrijkste voordeel van deze assay ten opzichte van bestaande methoden zoals HPLC-gebaseerde of cel-gebaseerde methoden, is dat het eenvoudig uit te voeren is, gemakkelijk geautomatiseerd kan worden en kan worden gebruikt om de relatieve potentie van een aantal verbindingen te vergelijken. Individuen kunnen worstelen wanneer ze nieuw zijn voor deze methode bij het voorbereiden van een verbindingsverdunningsreeks en het correct mengen van de plaat zodra alle componenten zijn toegevoegd. Begin deze procedure door de buffers en reagentia voor te bereiden zoals beschreven in het tekstprotocol.Configureer de plate reader om de plaat gedurende 10 seconden op gemiddelde snelheid te schudden en vervolgens de fluorescentie te monitoren bij een excitatiegolflengte van 490 nanometer en een emissiegolflengte van 523 nanometer elke vijf minuten in kinetische modus gedurende een uur 30 minuten bij kamertemperatuur. Na het bepalen van het verbindingsconcentratiebereik, label buisjes met de juiste verbindingsnaam en concentratie, Eloqua, 100%dimethyl sulf oxide of DMSO voor alle buisjes om ze voor te bereiden op verbindingsgraanverdunning. Bereid vervolgens de seriële verdunning van de verbindingen voor de standaard een tot drie verdunningsreeksen.Voeg twee microliters van de onverdunde verbinding toe aan vier microliters DMSO in de eerste buis van de verdunningsreeks en meng goed met een nieuwe pipettetip. Verwijder twee microliters van de eerste verdunning en voeg toe aan vier microliters DMSO in de tweede buismix. Herhaal dit voor de resterende verdunningsreeksen.Zorg ervoor dat de verbindingsverdunnings goed worden gemengd om ervoor te zorgen dat de verbindingsconcentraties nauwkeurig zijn. Dek de verbindingsbuisjes af en zet ze opzij. Bij kamertemperatuur, verkrijg een platte bodem, ondoorzichtige zwarte 96-wellsplaat. Gebruik de aanbevolen plaatopstelling die te vinden is in het tekstprotocol.Handmatig doseer één microliter van de respectieve verbindingsverdunning rechtstreeks op de bodem van elke overeenkomstige put voor putten één tot negen, doseer één microliter van de hoogste concentratie verbinding om te worden getest op put.11. Om als de intrinsieke fluorescentiecontrole van de verbinding te dienen. Deze controle dient om te bepalen of de verbindingen zelf fluorescerend zijn en/of de substraathydrolyse beïnvloeden.Handmatig doseer één microliter van een bekend krachtig remmer op put, 12 als een positieve controle en één microliter van 100%DMSO op put. 10 als de negatieve controle met een geautomatiseerde pipetteerder. Doseer 79 microliters van de assaybuffer naar de zijkant van de putten één tot 10 en 12 en 89 microliters naar de zijkant van put, 11.Zorg ervoor dat u de tip niet aanraakt de bodem van de put waar de verbinding aanwezig is om kruisbesmetting van de putten te voorkomen. Vortex, het verdunde lichte ketting enzym en gebruik een geautomatiseerde pipetteerder om 10 microliters van het enzym toe te voegen aan de zijkant van elke put, behalve put 11. Tik voorzichtig op de plaat om ervoor te zorgen dat het totale volume van toegevoegd enzym naar de bodem van de put gaat, meng voorzichtig, dek af en incubeer de plaat gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Deze incubatie biedt een voorevenwichtsstap voor de verbindingen om aan de lichte ketting te binden. Vóór toevoeging van het substraat, vortex de botulinum neurotoxine lichte kettingsubstraat voorzichtig. Voeg vervolgens met een geautomatiseerde pipetteerder 10 microliters van het substraat toe aan de zijkant van elk.Zorg ervoor dat u het substraat toevoegt aan de zijkant van de put tegenover waar het enzym eerder werd toegevoegd. Tik voorzichtig op de plaat om de reagentia onmiddellijk te mengen. Plaats de plaat in een fluorescentiemicrotiterplaatlezer en begin met het eerder geconfigureerde programma.Nadat het programma is voltooid, bereken de enzymsnelheden door de relatieve fluorescentie-eenheid tegen tijd te plotten en de helling van de lijn te berekenen tijdens de lineaire periode van de reactie. Bereid voor op geautomatiseerde werking voor hoogdoorlaatscreening zoals beschreven in het tekstprotocol. Een gedeelte van het hoogdoorlaatscreeningsprotocol zal worden gedemonstreerd door een postdoc in mijn laboratorium. Hij zal laten zien hoe verbindingen worden overgebracht naar platen voor hoogdoorlaatscreening met behulp van laboratoriumautomatiseringsapparatuur Na het doseren van verdund botulinum neurotoxine, een lichte ketting enzym in de assayplaat.Wijzig gebieden op het platform van de vloeistofbeheerdier voor de verbindingsplaten, assayplaten en containers met reinigingsoplossingen. Programmeer de vloeistofbeheerdier om de verbindingsplaten en de assayplaten op de aangewezen posities te plaatsen en de platendekken te verwijderen voordat ze worden gestempeld. Kalibreer de stempelprogrammasoftware en zorg ervoor dat de stempelpennen ondergedompeld zijn, maar niet het bodem van de assayplaat krassen.Stempel 50 nanoliters van de verbinding rechtstreeks in de assayplaat die acht microliters botulinum neurotoxine bevat. Een lichte ketting. Reinig de pennen na elke plaat door ze in DMSO te dompelen en vervolgens te drogen op blootstellingspapier en herhaal dit proces met isopropanol en methanol.Ten slotte droog de pennen over de ventilator nadat de verbindingen zijn

a-high-throughput-compatible-fret-based-platform-for-identification

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Een voor hoge doorvoer geschikt FRET-gebaseerd platform voor identificatie en karakterisering van modulatoren van botuline-neurotoxine-lichtketens

De BoTest Matrix botulinum neurotoxine (BoNT) opsporingsanalyses snel te zuiveren en te kwantificeren BoNT uit een reeks van monstermatrices. Hier presenteren we een protocol voor de detectie en kwantificering van BoNT uit zowel vaste als vloeibare matrices en demonstreren van de test met BOTOX, tomaten en melk.

Isolatie en kwantificering van botulineneurotoxine uit complexe matrices gebruiken BoTest Matrix Testen

Hier laten wij het gebruik van fluorescente Alexa kleurstof gekoppeld met α-bungarotoxine aan GABAA-receptor oppervlak lokalisatie en endocytose in hippocampale neuronen meten. Door het gebruik van constructies, voorzien van een korte extracellulaire tag die bindt α-bungarotoxin, kan de analyse van plasmamembraaneiwit endocytische mensenhandel worden bereikt.

Met behulp van een α-bungarotoxin Binding Site Tag om te studeren GABA A receptor membraanlokalisatie en handel

Botulinum neurotoxin is een van de krachtigste toxines onder categorie-A biobedreigingen, maar er is geen therapeutisch middel beschikbaar na blootstelling. De benadering van beeldvorming met hoge inhoud is een krachtige methodologie voor het identificeren van nieuwe remmers, omdat het multiparameter screening mogelijk maakt met behulp van biologisch relevante motorneuronen, het primaire doelwit van dit toxine.

Een hoog gehalte Imaging Assay voor Identificatie van botulineneurotoxine Remmers

Een aangepast protocol wordt beschreven om muis ES-cellen te differentiëren in gedefinieerde populaties van zeer zuivere neuronen die functionerende synapsen en opkomend netwerkgedrag vertonen. Elektrofysiologische analyse toont het verlies van synaptische transmissie aan na blootstelling aan botulinum neurotoxine serotypen /A-/G en tetanus neurotoxine.

Functionele Evaluatie van Biologische Neurotoxines in Networked Cultures van stamcel-afgeleide centrale zenuwstelsel Neuronen

We presenteren een open source hoog gehalte analyse (HCA) instrument gebruik te maken van geautomatiseerde fluorescentie lifetime imaging (FLIM) voor het testen van eiwit interacties met behulp van Förster resonance energy transfer (FRET) op basis van uitlezingen. Data-acquisitie voor deze openFLIM-HCA instrument wordt bestuurd door software geschreven in μManager en data-analyse wordt uitgevoerd in FLIMfit.

Open Source High Content Analysis Door gebruik te maken van de automaten Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

We beschrijven een reproduceerbaar, geautomatiseerd en onbevooroordeeld beeldvormingssysteem voor het karakteriseren van de neuromusculaire junctiefunctie met behulp van menselijk gemanipuleerd skeletspierweefsel en optogenetische motoneuronen. Dit systeem maakt de functionele kwantificering van neuromusculaire connectiviteit in de loop van de tijd mogelijk en detecteert verminderde neuromusculaire functie veroorzaakt door neurotoxinen en myasthenia gravis patiëntenserum.

Engineering en karakterisering van een optogenetisch model van de menselijke neuromusculaire junctie

Hier wordt een protocol gepresenteerd met behulp van Leishmania major promastigoten om de binding, cytotoxiciteit en signalering geïnduceerd door porievormende toxines te bepalen. Een proof-of-concept met streptolysine O wordt verstrekt. Andere toxines kunnen ook worden gebruikt om de genetische mutanten die beschikbaar zijn in L. major te gebruiken om nieuwe mechanismen van toxineresistentie te definiëren.

Het ontcijferen van het moleculaire mechanisme en de functie van porievormende toxines met behulp van Leishmania major

Dit protocol biedt een standaard high-throughput screeningworkflow voor industriële micro-organismen. Het omvat het construeren van een mutantenbibliotheek via ARTP-mutagenese, het uitvoeren van positieve druppelscreening met geautomatiseerde microfluidica en vervolgens het verifiëren van de resultaten. De betrouwbaarheid van de workflow werd gevalideerd door het screenen van krachtige B. coagulans-stammen .

Hoogdoorvoerscreening van L-melkzuur-hyperproducerende bacilluscoagulansmutanten met behulp van een geautomatiseerd druppel-microflufluïdisch platform

Leer een FRET-gebaseerde screeningmethode voor het identificeren van inhibitoren van botulinum-neurotoxine lichte keten. Dit high-throughput protocol versnelt ontdekking van nieuwe therapeutische verbindingen.

Een High-throughput-compatibele FRET-gebaseerde platform voor identificatie en karakterisering van modulatoren van de lichte keten van botulinum-neurotoxine (Video) | JoVE Journal

Een High-throughput-compatibele FRET-gebaseerde platform voor identificatie en karakterisering van modulatoren van de lichte keten van botulinum-neurotoxine

Meer video's verkennen