Een High-throughput-compatibele FRET-gebaseerde platform voor identificatie en karakterisering van modulatoren van de lichte keten van botulinum-neurotoxine

Het algemene doel van deze procedure is om kleine moleculen te screenen op botulinum neurotoxine, een lichte kettingremming. Dit wordt bereikt door eerst verbindingsverdunningsreeksen met hoge nauwkeurigheid en precisie voor te bereiden. De tweede stap is om verbindingsverdunningsreeksen over te brengen naar een zwarte 96-wellsplaat.

Vervolgens wordt verdunde lichte kettingenzyme aan de plaat toegevoegd en wordt het enzym gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met de verbinding geïncubeerd. De laatste stap is het toevoegen van het lichte kettingfret-substraat om de reactie te initiëren, die wordt gemonitord met een fluorescentieplaatlezer. Uiteindelijk moeten secundaire screens die een niet-fluorescente peptide-substraat gebruiken, worden toegepast om de verbindingsactiviteit te bevestigen en meer rigoureuze kinetiekconstanten zoals de remmerdissociatieconstante of ki te bepalen.

Het belangrijkste voordeel van deze assay ten opzichte van bestaande methoden zoals HPLC-gebaseerde of cel-gebaseerde methoden, is dat het eenvoudig uit te voeren is, gemakkelijk geautomatiseerd kan worden en kan worden gebruikt om de relatieve potentie van een aantal verbindingen te vergelijken. Individuen kunnen worstelen wanneer ze nieuw zijn voor deze methode bij het voorbereiden van een verbindingsverdunningsreeks en het correct mengen van de plaat zodra alle componenten zijn toegevoegd. Begin deze procedure door de buffers en reagentia voor te bereiden zoals beschreven in het tekstprotocol.

Configureer de plate reader om de plaat gedurende 10 seconden op gemiddelde snelheid te schudden en vervolgens de fluorescentie te monitoren bij een excitatiegolflengte van 490 nanometer en een emissiegolflengte van 523 nanometer elke vijf minuten in kinetische modus gedurende een uur 30 minuten bij kamertemperatuur. Na het bepalen van het verbindingsconcentratiebereik, label buisjes met de juiste verbindingsnaam en concentratie, Eloqua, 100%dimethyl sulf oxide of DMSO voor alle buisjes om ze voor te bereiden op verbindingsgraanverdunning. Bereid vervolgens de seriële verdunning van de verbindingen voor de standaard een tot drie verdunningsreeksen.

Voeg twee microliters van de onverdunde verbinding toe aan vier microliters DMSO in de eerste buis van de verdunningsreeks en meng goed met een nieuwe pipettetip. Verwijder twee microliters van de eerste verdunning en voeg toe aan vier microliters DMSO in de tweede buismix. Herhaal dit voor de resterende verdunningsreeksen.

Zorg ervoor dat de verbindingsverdunnings goed worden gemengd om ervoor te zorgen dat de verbindingsconcentraties nauwkeurig zijn. Dek de verbindingsbuisjes af en zet ze opzij. Bij kamertemperatuur, verkrijg een platte bodem, ondoorzichtige zwarte 96-wellsplaat. Gebruik de aanbevolen plaatopstelling die te vinden is in het tekstprotocol.

Handmatig doseer één microliter van de respectieve verbindingsverdunning rechtstreeks op de bodem van elke overeenkomstige put voor putten één tot negen, doseer één microliter van de hoogste concentratie verbinding om te worden getest op put.11. Om als de intrinsieke fluorescentiecontrole van de verbinding te dienen. Deze controle dient om te bepalen of de verbindingen zelf fluorescerend zijn en/of de substraathydrolyse beïnvloeden.

Handmatig doseer één microliter van een bekend krachtig remmer op put, 12 als een positieve controle en één microliter van 100%DMSO op put. 10 als de negatieve controle met een geautomatiseerde pipetteerder. Doseer 79 microliters van de assaybuffer naar de zijkant van de putten één tot 10 en 12 en 89 microliters naar de zijkant van put, 11.

Zorg ervoor dat u de tip niet aanraakt de bodem van de put waar de verbinding aanwezig is om kruisbesmetting van de putten te voorkomen. Vortex, het verdunde lichte ketting enzym en gebruik een geautomatiseerde pipetteerder om 10 microliters van het enzym toe te voegen aan de zijkant van elke put, behalve put 11. Tik voorzichtig op de plaat om ervoor te zorgen dat het totale volume van toegevoegd enzym naar de bodem van de put gaat, meng voorzichtig, dek af en incubeer de plaat gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Deze incubatie biedt een voorevenwichtsstap voor de verbindingen om aan de lichte ketting te binden. Vóór toevoeging van het substraat, vortex de botulinum neurotoxine lichte kettingsubstraat voorzichtig. Voeg vervolgens met een geautomatiseerde pipetteerder 10 microliters van het substraat toe aan de zijkant van elk.

Zorg ervoor dat u het substraat toevoegt aan de zijkant van de put tegenover waar het enzym eerder werd toegevoegd. Tik voorzichtig op de plaat om de reagentia onmiddellijk te mengen. Plaats de plaat in een fluorescentiemicrotiterplaatlezer en begin met het eerder geconfigureerde programma.

Nadat het programma is voltooid, bereken de enzymsnelheden door de relatieve fluorescentie-eenheid tegen tijd te plotten en de helling van de lijn te berekenen tijdens de lineaire periode van de reactie. Bereid voor op geautomatiseerde werking voor hoogdoorlaatscreening zoals beschreven in het tekstprotocol. Een gedeelte van het hoogdoorlaatscreeningsprotocol zal worden gedemonstreerd door een postdoc in mijn laboratorium. Hij zal laten zien hoe verbindingen worden overgebracht naar platen voor hoogdoorlaatscreening met behulp van laboratoriumautomatiseringsapparatuur Na het doseren van verdund botulinum neurotoxine, een lichte ketting enzym in de assayplaat.

Wijzig gebieden op het platform van de vloeistofbeheerdier voor de verbindingsplaten, assayplaten en containers met reinigingsoplossingen. Programmeer de vloeistofbeheerdier om de verbindingsplaten en de assayplaten op de aangewezen posities te plaatsen en de platendekken te verwijderen voordat ze worden gestempeld. Kalibreer de stempelprogrammasoftware en zorg ervoor dat de stempelpennen ondergedompeld zijn, maar niet het bodem van de assayplaat krassen.

Stempel 50 nanoliters van de verbinding rechtstreeks in de assayplaat die acht microliters botulinum neurotoxine bevat. Een lichte ketting. Reinig de pennen na elke plaat door ze in DMSO te dompelen en vervolgens te drogen op blootstellingspapier en herhaal dit proces met isopropanol en methanol.

Ten slotte droog de pennen over de ventilator nadat de verbindingen zijn