Name: Whole-cell MALDI-TOF massaspectrometrie is een nauwkeurige en snelle methode om verschillende vormen van macrofaagactivering Analyseer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-26T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Ontdek whole-cell MALDI-TOF massaspectrometrie om activeringstoestanden van macrofagen snel en nauwkeurig te analyseren. Deze techniek biedt een reproduceerbare methode voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Richard Ouedraogo wordt ondersteund door een subsidie van het Ministère de la Santé (PHRC 2010). We danken Laurent Gorvel, Christophe Flaudrops en Nicolas Amstrong voor hun technische assistentie.

In het huidige protocol wordt de whole-cell MALDI-TOF-techniek gebruikt om een massaspectrum te verkrijgen dat wordt beschouwd als een vingerafdruk van het monster. Een bio-informatica-analyse maakte de vergelijking en classificatie van deze vingerafdrukken mogelijk. Er waren drie hoofdonderdelen in dit protocol:
<ol>
	<li>De voorbereiding van de biologische monsters: controlemacrofagen en macrofagen gestimuleerd met verschillende agonisten.</li>
	<li>De analyse van elk type monster met technische replica's door whole-cell MALDI-TOF MS.</li>
	<li>De bio-informatica-analyse van ruwe gegevens.</li>
</ol>
Bereid steriele oplossingen voor voor celisolatie en -kweek. Bereid alle reagentia voor en bewaar ze bij 4 °C
1. Bereiding van menselijke monocyten
<ol>
	<li>Bereid het celkweekmedium. Voeg 55 ml van humaan serum AB+ of foetaal bovien serum (FBS) en 5 ml van de antibioticumoplossing (penicilline op 10.000 UI/ml en streptomycine op 10.000 μg/ml; uiteindelijke concentratie van 100 UI/ml voor penicilline en 100 μg/ml voor streptomycine) toe aan RPMI 1640 medium (500 ml).
	<ol>
		<li>Isoleer perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) uit leukopacks (leukeconcentraten).
		<ol>
			<li>Bereid 50 ml buizen met 15 ml Ficoll. Verdun het bloed in zoutoplossing (vol/vol, 1/10). Deponeer 30 ml verdunde PBMC's op Ficoll zoals eerder beschreven26.</li>
			<li>Centrifugeer bij 700 x g gedurende 20 min. Herstel PBMC's op het grensvlak tussen Ficoll (dichtheid van 1,077 g/ml) en verdund plasma. Verdun PBMC's in kweekmedium en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bereid CD14+ monocyten uit PBMC's met behulp van magnetische kralen gecoat met anti-CD14-antilichamen. 
		Opmerking: Houd producten en cellen bij 4 °C totdat monocyten zijn verkregen.
		<ol>
			<li>Bereid een loopbuffer voor die bestaat uit fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,2, 0,5% bovien serumalbumine (BSA) en 2 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA).</li>
			<li>Los voorzichtig pellet PBMC's (107 cellen per test) op in 80 μl loopbuffer.</li>
			<li>Voeg 20 μl CD14 MicroBeads toe aan PBMC's. Meng en incubeer PBMC's gedurende 15 min. Was PBMC's met 5 ml loopbuffer en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min. Los voorzichtig pellet PBMC's op in 500 μl loopbuffer voor 108 PBMC's. 
			Opmerking: gebruik 500 μl loopbuffer voor PBMC-concentraties lager dan 108 PBMC's.</li>
			<li>Ga door met magnetische scheiding. 
			Opmerking: voor minder dan 2 x 108 PBMC's, gebruik MS-kolom; voor meer dan 2 x 108 PBMC's en minder dan 2 x 109 PBMC's, gebruik LS-kolom.</li>
			<li>Spoel voorkolom en kolom met loopbuffer (500 μl voor MS-kolom of 3 ml voor LS-kolom). Voeg PBMC's toe aan de voorkolom (wacht tot ongelabelde cellen door de kolom gaan). Spoel 3 keer met loopbuffer (500 μl voor MS-kolom of 3 ml voor LS-kolom). Verwijder de voorkolom.</li>
			<li>Plaats de kolom op 15 ml buizen. Voeg loopbuffer toe (1 ml voor MS-kolom of 5 ml voor LS-kolom) op de kolom en elueer CD14+ cellen door druk uit te oefenen op de kolom.</li>
			<li>Centrifugeer het eluaat bij 300 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg. Was het monocyten-pellet met 10 ml kweekmedium. 
			Opmerking: Analyseer de zuiverheid van de monocytenvoorbereiding met behulp van anti-CD14-antilichamen en stromcytometrie (klassiek hoger dan 95%).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Differentiatie van monocyten in macrofagen.
	<ol>
		<li>Incubeer monocyten (106 monocyten per putje in 6 putjesplaten) in 3 ml kweekmedium dat 10% humaan serum AB+ bevat bij 37 °C. Na 4 dagen vervangt u het kweekmedium dat humaan serum bevat door 3 ml kweekmedium dat 10% FBS bevat gedurende 3 extra dagen.</li>
		<li>Identificeer de verkregen celpopulatie als monocyte-afgeleide macrofagen (MDM's) door middel van stromcytometrie (zie Figuur 1).
		<ol>
			<li>Vervang het kweekmedium door 3 ml PBS. Schap MDM's met een rubberen politieman en verzamel MDM-suspensies. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min. Voeg PBS met 2% BSA toe aan gepelletiseerde MDM's en schud voorzichtig de celsuspensie. Pas de celconcentratie aan (106 MDM's in 200 ml PBS) en incubeer bij 4 °C.</li>
			<li>Voeg 10 ml anti-CD14-antilichamen en 10 ml anti-CD68-antilichamen toe aan de MDM-suspensie en incubeer bij 4 °C gedurende 20 min in het donker. 
			Opmerking: deze antilichamen moeten worden gelabeld met twee verschillende fluorochromen die consistent zijn met stromcy

<ol><li>Mass Gross, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMass+Gross%2C+J+%22Spectrometry%3A+A+Textbook%22">Spectrometry: A Textbook</a>. , Springer-Verlag. Berlin. (2011).</li>
<li>Villanueva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+Peptide+Profiling+by+Magnetic+Particle-Assisted%2C+Automated+Sample+Processing+and+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry.%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Serum Peptide Profiling by Magnetic Particle-Assisted, Automated Sample Processing and MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 76 (6), 1560-1570 (2004).</li>
<li>Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+as+a+Diagnostic+and+a+Cancer+Biomarker+Discovery+Tool+Opportunities+and+Potential+Limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molec.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry as a Diagnostic and a Cancer Biomarker Discovery Tool Opportunities and Potential Limitations.</a> Molec. Cell. Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).</li>
<li>Pusch, W., Kostrzewa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry+in+Screening+and+Diagnostic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Application of MALDI-TOF Mass Spectrometry in Screening and Diagnostic.</a> 11 (20), 2577-2591 (2005).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li>
<li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+and+Protein+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry and Protein Analysis.</a> Science. 312 (5771), 212-217 (2006).</li>
<li>Carbonnelle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+two+MALDI-TOF+mass+spectrometry+systems+for+bacterial+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Robustness of two MALDI-TOF mass spectrometry systems for bacterial identification.</a> J. Microbiol. Methods. 89 (2), 133-136 (2012).</li>
<li>Bizzini, A., Jaton, K., Romo, D., Bille, J., Prod’hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization%E2%80%93Time+of+Flight+Mass+Spectrometry+as+an+Alternative+to+16S+rRNA+Gene+Sequencing+for+Identification+of+Difficult-To-Identify+Bacterial+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry as an Alternative to 16S rRNA Gene Sequencing for Identification of Difficult-To-Identify Bacterial Strains.</a> J. Clin. Microbiol. 49 (2), 693-696 (2011).</li>
<li>Buchanan, C. M., Malik, A. S., Cooper, G. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualisation+of+peptide+hormones+in+cultured+pancreatic+islet+alpha-+and+beta-cells+by+intact-cell+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct visualisation of peptide hormones in cultured pancreatic islet alpha- and beta-cells by intact-cell mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 (21), 3452-3458 (2007).</li>
<li>Ouedraogo, R., Flaudrops, C., Ben Amara, A., Capo, C., Raoult, D., Mege, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+circulating+immune+cells+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Global analysis of circulating immune cells by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> PloS One. 5 (10), 13691 (2010).</li>
<li>Munteanu, B., von Reitzenstein, C., Hänsch, G. M., Meyer, B., Hopf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+robust+and+automated+protein+analysis+of+cell+differentiation+and+of+primary+human+blood+cells+by+intact+cell+MALDI+mass+spectrometry+biotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sensitive robust and automated protein analysis of cell differentiation and of primary human blood cells by intact cell MALDI mass spectrometry biotyping.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404 (8), 2277-2286 (2012).</li>
<li>Feng, H., Sim, L. C., Wan, C., Wong, N. S. C., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+characterization+of+protein+productivity+and+production+stability+of+CHO+cells+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Rapid characterization of protein productivity and production stability of CHO cells by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 25 (10), 1407-1412 (2011).</li>
<li>Ouedraogo, R., Daumas, A., Ghigo, E., Capo, C., Mege, J. -L., Textoris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+MALDI-TOF+MS%3A+A+new+tool+to+assess+the+multifaceted+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Whole-cell MALDI-TOF MS: A new tool to assess the multifaceted activation of macrophages.</a> J. Proteomics. 75 (18), 5523-5532 (2012).</li>
<li>Amann, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+profiling+of+proteins+in+lung+cancer+cells+from+fine-needle+aspirates+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Selective profiling of proteins in lung cancer cells from fine-needle aspirates by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin. Cancer Res. 12 (17), 5142-5150 (2006).</li>
<li>Maurer, K., Eschrich, K., Schellenberger, W., Bertolini, J., Rupf, S., Remmerbach, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+brush+biopsy+analysis+by+MALDI-ToF+Mass+Spectrometry+for+early+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Oral brush biopsy analysis by MALDI-ToF Mass Spectrometry for early cancer diagnosis.</a> Oral Oncol. 49 (2), 152-156 (2013).</li>
<li>Ishii, K. J., Koyama, S., Nakagawa, A., Coban, C., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+innate+immune+receptors+and+beyond%3A+making+sense+of+microbial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Host innate immune receptors and beyond: making sense of microbial infections.</a> Cell Host Microbe. 3 (6), 352-363 (2008).</li>
<li>Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization comes of age.</a> Immunity. 23 (4), 344-346 (2005).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nat. Rev. Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).</li>
<li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> J. Immunol. 181 (6), 3733-3739 (2008).</li>
<li>Biswas, S. K., Sica, A., Lewis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+macrophage+function+during+tumor+progression%3A+regulation+by+distinct+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of macrophage function during tumor progression: regulation by distinct molecular mechanisms.</a> J. Immunol. 180 (4), 2011-2017 (2008).</li>
<li>Cassetta, L., Cassol, E., Poli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+World+J%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in health and disease.</a> Sci. World J. 11, 2391-2402 (2011).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).</li>
<li>Mantovani, A., Sica, A., Sozzani, S., Allavena, P., Vecchi, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+system+in+diverse+forms+of+macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization.</a> Trends Immunol. 25 (12), 677-686 (2004).</li>
<li>Delaby, A., Gorvel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+monocyte+dynamics+in+Q+fever+granuloma+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Defective monocyte dynamics in Q fever granuloma deficiency.</a> J. Infect. Dis. 205 (7), 1086-1094 (2012).</li>
<li>Gibb, S., Strimmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDIquant%3A+a+versatile+R+package+for+the+analysis+of+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MALDIquant: a versatile R package for the analysis of mass spectrometry data.</a> Bioinformatics. 28 (17), 2270-2271 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren. RO, JLM en CC zijn uitvinders van een internationaal patent WO 2011/154650, genaamd "Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF".

Dit protocol beschrijft het gebruik van MALDI-TOF-MS op eukaryote hele cellen. Hier illustreren we de nauwkeurigheid van de methode door de meerdere activeringstoestanden van macrofagen in reactie op hun micro-omgeving te analyseren.
Het succes van het protocol is afhankelijk van enkele cruciale stappen. Ten eerste kan elke oplossingsverontreiniging het spectra veranderen. Het is bijvoorbeeld belangrijk om cellen in PBS te wassen om kweekmedium en serumeiwitten te verwijderen voordat ze op het...

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) is een populaire massaspectrometrietechniek om biologische monsters te bestuderen. Het gebruik van een laserstraal en een energie-absorberende matrix maakt een zachte ionisatieproces mogelijk: de verdamping en ontstaan van grote, meestal enkelvoudig geladen biomoleculen. Dit proces wordt desorbentie/ionisatie genoemd, wat het acroniem MALDI rechtvaardigt. Deze ionen worden vervolgens versneld door het aanbrengen van spanning en komen in een TOF-analysator terecht, die de scheiding van deze ionen en de kwantificering van hun respectieve massa's mogelijk maakt1.
MALDI-TOF MS is uitgebreid gebruikt in de biologie, chemie en geneeskunde om moleculen en biomarkers2-4 te identificeren of post-translationele modificaties op eiwitten5,6te monitoren7,8. Recentelijk hebben verschillende groepen MALDI-TOF MS toegepast op de identificatie van micro-organismen uit klinische monsters. Deze microbiologische toepassing wordt nu routinematig gebruikt in klinische omgevingen. Whole cell MALDI-TOF heeft veel voordelen in vergelijking met klassieke toepassingen van MALDI-TOF MS. Monsters met hele cellen worden direct verwerkt, waardoor tijdrovende stappen om grote hoeveelheden materiaal te fractioneren of te scheiden worden vermeden. Bovendien is er geen karakterisering van de verschillende pieken nodig: het hele spectrum wordt beschouwd als een vingerafdruk van het monster, en matching-algoritmen vergelijken het geteste spectrum met een database van referentiespectra.
Wij en anderen hebben deze whole-cell analysetechniek toegepast op eukaryotische cellen. Er kunnen veel toepassingen van deze techniek worden afgeleid: (1) identificeren van de belangrijkste celtypen uit een gemengd monster9-11; (2) beoordelen van de levensvatbaarheid van celculturen in de tijd (inclusief kwaliteitscontrole in industriële toepassingen)12; (3) monitoren van activeringstoestanden van een enkele celtype13; (4) beoordelen van de maligne transformatie van een klinisch monster14,15.
Hier beschrijven we het gebruik van whole-cell MALDI-TOF MS om de verschillende polarisatiefenotypes van macrofagen in reactie op cytokinen of hitte-gedode bacteriën te verkennen. Macrofagen spelen een centrale rol in de immuunrespons op microbiële pathogenen. Ze detecteren infectieuze agentia in de weefsels via patroonherkenningreceptoren die in staat zijn om geconserveerde microbiële patronen te detecteren, zoals lipopolysaccharide (LPS)16. Macrofagen zijn professionele antigeen-presenterende cellen die interageren met T-cellen om de adaptieve immuunrespons op te starten. T-cellen beïnvloeden macrofagen door cytokinen af te geven die de microbiëcide activiteit van macrofagen versterken of reguleren. Door analogie met de Th1/Th2 lymfocytpolarisatie zijn inflammatoire, microbiëcide en tumoricide macrofagen geclassificeerd als M1 macrofagen en immunoregulator macrofagen als M2 macrofagen17-19. De term M1 verwijst naar de klassieke activering van macrofagen door type I cytokinen, zoals interferon (IFN)-γ en tumornecrosefactor (TNF), of bacteriële producten, zoals LPS18,20-23, terwijl macrofagen geactiveerd door alternatieve routes (interleukine (IL)-4, IL-10, Transforming Growth Factor-β1 worden beschouwd als M2 macrofagen19,24,25. De hoge fenotypische en functionele plasticiteit van macrofagen in reactie op hun micro-omgeving maakt deze macrofagen bruikbaar om subtiele veranderingen te analyseren door een MALDI-TOF MS-aanpak.

whole-cell maldi-tof massaspectrometrie is een nauwkeurige en snelle methode om verschillende vormen van macrofaagactivering analyseer

Whole-cell MALDI-TOF Mass Spectrometry is an Accurate and Rapid Method to Analyze Different Modes of Macrophage Activation

MALDI-TOF is een veelgebruikte massaspectrometrietechniek in de chemie en biochemie. Het is ook toegepast in de geneeskunde om moleculen en biomarkers te identificeren. Recentelijk is het in de microbiologie gebruikt voor de routine-identificatie van bacteriën die zijn gekweekt uit klinische monsters, zonder voorbereidings- of fractioneringsstappen. Wij en anderen hebben deze whole-cell MALDI-TOF massaspectrometrietechniek met succes toegepast op eukaryote cellen. Huidige toepassingen variëren van identificatie van celtypen tot kwaliteitscontrole-evaluatie van celcultuur en diagnostische toepassingen. Hier beschrijven we het gebruik ervan om de verschillende polarisatiefenotypen van macrofagen in reactie op cytokines of hittedode bacteriën te onderzoeken. Het maakte de identificatie mogelijk van macrofaagspecifieke vingerafdrukken die representatief zijn voor de diversiteit van proteomische reacties van macrofagen. Deze toepassing illustreert de nauwkeurigheid en eenvoud van de methode. Het protocol dat we hier beschreven hebben, kan nuttig zijn voor het bestuderen van de immuunrespons van de gastheer in pathologische omstandigheden of kan worden uitgebreid tot bredere diagnostische toepassingen.

Het doel van het huidige protocol is om de nauwkeurigheid van whole-cell MALDI-TOF MS aan te tonen bij het beoordelen van de responsiviteit van macrofagen op hun micro-omgeving.
Figuur 1 beschrijft de preparatie van gestimuleerde macrofagen uit bloedmonsters. Figuur 2 representeert de analyse van monocyten en MDM's via flowcytometrie. Merk op dat monocyten CD14 tot expressie brachten, maar geen CD68 (Figuur 1A). Omgekeerd brachten MDM's CD68 t...

Dit protocol beschrijft het gebruik van hele-cel MALDI-TOF massaspectrometrie op eukaryote cellen. Hier illustreren we de nauwkeurigheid van deze techniek door de meerdere activeringstoestanden van macrofagen te analyseren als reactie op hun micro-omgeving.

Whole-cell MALDI-TOF massaspectrometrie is een nauwkeurige en snelle methode om verschillende vormen van macrofaagactivering Analyseer

MALDI-TOF is an extensively used mass spectrometry technique in chemistry and biochemistry. It has been also applied in medicine to identify molecules and ...

In dit experiment wordt whole cell multi-massaspectrometrie gebruikt. Om de verschillende activatietoestanden van macrofagen nauwkeurig te analyseren, worden de macrofagen eerst afgeleid van CD 14-positieve monocyten, waarna de cellen worden gestimuleerd met agonisten zoals cytokinen en bacteriën. Analyseer de monsters via moly to op een stalen target, waarbij de eiwitten worden gescheiden en er voor elk monster een spectrum wordt verkregen.Resultaten van specifieke fingerprints kunnen onderscheid maken tussen verschillende activatietoestanden van een enkele eukaryote cel, de macrofaag, op basis van een bio-informatische analyse van de spectra verkregen via whole cell MALDI mass spectrometry. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals flowcytometrie is dat deze snel, eenvoudig en goedkoop is. In dit experiment tonen we aan dat reproduceerbare spectra werden verkregen van macrofagen en dat verschillende activatietoestanden konden worden onderscheiden door whole cell MALDI.We verkrijgen ook spectra van BBMC, wat nuttig kan zijn voor de diagnose van de gastheerrespons op een infectie. Deze methode kan inzicht bieden in de activatietoestanden van immuuncellen. Het zou ook kunnen worden toegepast op andere systemen, zoals concept-profilering ter vervanging van bijvoorbeeld extra analyse tijdens een operatie. Isoleer de cellen uit opax in buizen van 50 milliliter.Voeg 15 milliliter toe, verdun het bloed tienvoudig in zoutoplossing. Scheid vervolgens 30 milliliter van het verdunde bloed op de fol-gradiënt. Na het terugwinnen van de ring van P BMCs, worden de cellen op ijs bewaard.Resuspendeer de gepelletteerde P BMC's voorzichtig in 80 microliters running buffer. Voeg 20 microliters magnetische beads toe die gecoat zijn met anti CD 14 antilichamen. Meng en incubeer gedurende 15 minuten.Was één keer met vijf milliliter running buffer en centrifugeer bij 300 Gs gedurende vijf minuten. Resuspendeer de gepelletteerde cellen voorzichtig in 500 microliter running buffer. Selecteer de juiste kolom voor magnetische scheiding.Spoel de preco en de kolom met loopbuffer. Laad vervolgens de pbmc op de preco. Breng een magnetisch veld aan en spoel drie keer met loopbuffer.Verwijder de pre-cal en plaats de kolom op een buis van 15 milliliter. Voeg running buffer toe en elueer de CD 14-positieve cellen door druk uit te oefenen op de kolom. Centrifugeer vervolgens.Centrifugeer bij 300 Gs gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant. Was het monocytenpellet met 10 milliliters kweekmedium.Neem een aliquot van het medium om de zuiverheid van de monocytenpreparatie te bepalen via flowcytometrie met behulp van anti-CD 14-antilichamen. Zaai de monocyten uit in drie milliliter kweekmedium met 10% menselijk serum AB positief en kweek deze gedurende vier dagen. Vervang vervolgens het medium door RPMI aangevuld met 10% FBS en identificeer de verkregen celpopulatie als monocytafgeleide macrofagen via flowcytometrie.Stimuleer de monsters volgens het experimentele ontwerp. Nadat de gestimuleerde MDM's zijn gewassen met PBS, worden de cellen met de rubberen policeman losgeschraapt en de MDM-suspensies verzameld. Pellet de cellen door centrifugatie en was ze vervolgens eenmaal in PBS om sporen van FBS te verwijderen.Pellet de M dms door centrifugatie en resuspendeer de pellets in 20 µL PBS. Analyseer de cellen onmiddellijk of bewaar ze in PBS bij -80 °C tot aan de analyse. Om de CHCA-matrix te bereiden, voegt u 500 µL acetonitril, 250 µL 10% trifluorazijnzuur en 250 µL HPLC-water toe aan een vial.Voeg vervolgens 10 µL CHCA-mix toe en sonicate de matrix gedurende ten minste 20 minuten. Centrifugeer 5 minuten bij 13 000 Gs, bewaar het supernatant en gooi de pellet weg. Maak daarna het gepolijste stalen target vochtig met warm kraanwater en wrijf dit af met precisie-witpapier.Voeg 70% ethanol toe en wrijf de RINs schoon met water. Voeg vervolgens 70% ethanol toe en wrijf schoon met precisiepapier. Dompel het doelobject onder in 70% ethanol en sonicize gedurende ten minste 15 minuten.Bedek het target met 500 µL tot 1 mL 80% droog fluoro-zuur, wrijf en veeg af met precisiepapier. Spoel vervolgens af met HPLC-water zonder te wrijven. Droog het target bij kamertemperatuur.Ontdooi nu voorzichtig de MDM-monsters op ijs. Meng de MDM-celсусpensie door te pipetteren en breng één µL aan op het MALDI-target. Voeg één µL van de MALDI-matrixoplossing toe aan het monster.Voor technische replicates. Breng 12 tot 16 monsters per assay aan; deze verdampen spontaan bij kamertemperatuur. Plaats nu de stalen target met de monsters in de massaspectrometer.Configureer de massaspectrometer en start de data-acquisitie. Elk spectrum bestaat uit een lijst met pieken met de respectievelijke massa's en intensiteiten die de relatieve abundantie aangeven. Gebruik de vierkantswortel van de intensiteiten om de grafische visualisatie van de spectra te verbeteren.Corrigeer vervolgens de achtergrond met behulp van een statistisch gevoelig niet-lineair peak-clipping-algoritme. Pas voor de basislijnmeting een signaal-ruisverhouding van zes toe om pieken te detecteren. Ga ervan uit dat de gedetecteerde pieken over spectra heen vergelijkbaar zijn wanneer de massa-ladingswaarden binnen een venster van 2000 PM vallen.In dit experiment werden gestimuleerde macrofagen geprepareerd uit bloedmonsters. Monocyten worden geselecteerd op basis van de expressie van CD 14, maar niet CD 68. Omgekeerd werden monocyt-afgeleide macrofagen geïdentificeerd aan de hand van de expressie van CD 68, maar niet CD 14.Deze gegevens illustreren de rol van monstervoorbereidingen bij de interpretatie van MALDI-TOF MS-resultaten. Een spectrum van goede kwaliteit bevat gewoonlijk een prominente piek rond de vijf kilodalton. Er is een minimale celconcentratie nodig om goede monsters te verkrijgen, zoals blijkt uit dit spectrum van slechte kwaliteit dat is verkregen met een lage celconcentratie.Vergelijkbare slechte resultaten worden verkregen wanneer het monster met de matrix wordt gemengd vóór depositie op de targetplaat. Hier zijn spectra van diverse monsters weergegeven als een heat map. De relatieve abundantie is kleurgecodeerd door intensiteiten van blauw.Deze weergave van de virtuele gel illustreert de reproduceerbaarheid van de monsters binnen elke klasse. Een unsupervised analyse via hiërarchische clustering is samengevat als een diagram. Alle monsters zijn geclusterd in drie verschillende groepen.Ongestimuleerde MDM's, met IFN-gamma gestimuleerde MDM's of met IL-4 gestimuleerde MDM's. Belangrijk is dat de MALDI-TOF-analyse het mogelijk maakt om M1-macrofagen te onderscheiden van M2-macrofagen en ongestimuleerde MDM's. De piekweergave van een referentiespectrum voor IFN-gamma, IL-4 of ongestimuleerde MDM's vertoont specifieke pieken voor elke klasse.Specifieke fingerprints kunnen worden geïnduceerd door verschillende agonisten om de nauwkeurigheid van whole cell maloff te illustreren. Spectra van alle gestimuleerde monsters waren duidelijk gescheiden van die van ongestimuleerde macrofagen. MDM's vertoonden daarnaast specifieke fingerprints geïnduceerd door hitte-gedode bacteriën.Deze resultaten ondersteunen de hypothese dat MALDI-TOF gebruikt kan worden om circulerende cellen te analyseren om de gastheerrespons op infecties of inflammatoire ziekten in een klinische setting te beoordelen wanneer het monster gereed is. Deze techniek kan in één uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe activatietoestanden van chaotische cellen kunnen worden beoordeeld via massaspectrometrie van hele cellen.

whole-cell-maldi-tof-mass-spectrometry-is-an-accurate-rapid-method-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Macrofagen zijn de belangrijkste cellen die betrokken zijn bij de pathogeniteit van de gastheer. Macrofagen vertonen fenotypische en functionele diversiteit die kan worden geanalyseerd en gedetecteerd door middel van proteomische analyse. Dit artikel beschrijft hoe je 2D-elektroforese uitvoert van primaire culturen van humane macrofagen die zijn gedifferentieerd in M1- of M2-fenotype.

Proteomics Profilering van macrofagen door 2D-elektroforese

Metabolische herprogrammering is een kenmerkend en vereist kenmerk voor M1 en M2 macrofaagpolarisatie. Dit manuscript beschrijft een test voor de meting van fundamentele parameters van glycolyse en mitochondriale functie in muis-beenmerg-afgeleide macrofagen. Deze tool kan worden toegepast om te onderzoeken hoe bepaalde factoren het metabolisme en fenotype van macrofagen beïnvloeden.

Metabole karakterisering van gepolariseerde M1 en M2 Bone Marrow-afgeleide macrofagen met behulp van real-time extracellulaire Flux Analysis

We beschrijven de detectie van NLRP3 inflammasome activering op cellulaire basis met behulp van fluorescentie microscopie en kleuring voor actieve caspase-1 en de adapter, ASC. Een lactaat dehydrogenase release assay wordt gepresenteerd voor het detecteren van lysis van de pyroptotic op basis van de bevolking. Deze technieken kunnen worden aangepast om te bestuderen van vele aspecten van inflammasome biologie.

Detectie van Inflammasome-activering en Pyroptotic celdood in lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen

Een nieuwe methode voor de bereiding van de monsters werd ontwikkeld zodat de cel- en weefseltransplantaties coculture op te sporen klein molecuul uitwisseling met behulp van spectrometrie van de massa van de beeldvorming.

Vastleggen van klein molecuul communicatie tussen de weefsels en cellen met behulp van Imaging massaspectrometrie

Dit rapport beschrijft een geautomatiseerd protocol voor multiplex immunofluorescentie (mIF)-assays op een geautomatiseerde objectglaaskleuring. Het demonstreert de hoge reproduceerbaarheid van ruimtelijke proteomics op standaard high-throughput weefselautostainers en fluorescentiebeeldvormers met hele objectglaasjes, wat ideaal is voor aangepaste mIF-assays op een groot aantal weefselglaasjes in translationeel onderzoek.

High-throughput geautomatiseerde multiplex immunofluorescentietesten voor translationeel onderzoek

Hier beschrijven we in detail methoden voor het extraheren van macrofagen uit het beenmerg, de milt en het hartinfarct, en vervolgens het beoordelen van de metabole flux in levende cellen.

Analyse van ex vivo metabole flux in milt- en cardiale macrofagen en beenmergmonocyten

Dit protocol schetst het gebruik van microMS voor fluorescentiegeleide, eencellige MALDI-2-massaspectrometrie, waardoor verbeterde moleculaire profilering van primaire neuronale cellen van ratten mogelijk is.

Fluorescentiegeleide matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie met lasergeïnduceerde postionisatiemassaspectrometrie van individuele neurale cellen van ratten

Dit protocol beschrijft een eenvoudige zelfklevende tape-gebaseerde aanpak voor de bemonstering van de tomaten en andere verse producten oppervlakken, gevolgd door een snelle volledige cel detectie...

Combinatie van Adhesive-tape-gebaseerde Sampling en fluorescentie In situ Hybridisatie voor snelle detectie van Salmonella Op Fresh Produce

Monocyt-afgeleide macrofagen belangrijke cellen van het aangeboren immuunsysteem. Hier beschrijven we een eenvoudig te...

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Model te Heterogeniteit van Human Macrophage Differentiatie en Polarisatie Studie

Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in het bloed. Neutrofielen bezitten transcriptioneel gereguleerd functies zoals de productie van pro-inflammatoire cytokines en remming van apoptose. Deze functies kunnen worden bestudeerd met de methode die hier gepresenteerd, die detectie en kwantificering van nucleaire factoren maakt het mogelijk door middel van flowcytometrie in geïsoleerde...

Een eenvoudige en efficiënte methode om de Nucleaire Factor Activering Detect in menselijke neutrofielen door flowcytometrie

Ontdek whole-cell MALDI-TOF massaspectrometrie om activeringstoestanden van macrofagen snel en nauwkeurig te analyseren. Deze techniek biedt een reproduceerbare methode voor celbiologisch onderzoek.

Whole-cell MALDI-TOF massaspectrometrie is een nauwkeurige en snelle methode om verschillende vormen van macrofaagactivering Analyseer (Video) | JoVE Journal

Whole-cell MALDI-TOF massaspectrometrie is een nauwkeurige en snelle methode om verschillende vormen van macrofaagactivering Analyseer

Meer video's verkennen