Name: Subretinale transplantatie van MACS gezuiverde fotoreceptor precursor cellen in de volwassen muis retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Leer subretinale transplantatie van MACS-gezuiverde fotoreceptor precursorcellen in de volwassen muisretina. Deze methode ondersteunt onderzoek naar retinale regeneratie en het herstel van visie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Anand Swaroop bedanken voor het leveren van Nrl-GFP muizen, Jochen Haas voor technische ondersteuning en Sindy Böhme en Emely Lessmann voor de veeteelt.	
	Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Center of Regenerative Therapies Dresden, het CRTD Seed Grant Program, de SFB 655 en de ProRetina e.V. stichting, het DIGS-BB Graduate Program Dresden en het Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)

Verklaring ethisch gebruik en verzorging van dieren:
Alle dierproeven werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de wetgeving van de Europese Unie en duitsland (Tierschutzgesetz) en hielden zich aan de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en vision-onderzoek. Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de dierenethiekcommissie van de TU Dresden en de Landesdirektion Dresden (erkenningsnummer: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Voordat u begint met celdissociatie en celsortering
<ol><li>Etiket drie reactiebuizen van 15 ml met: Was (W), Positieve fractie (+) en Negatieve fractie (-).</li>
</ol>2. Retina dissociatie
<ol><li>Onthoofd de PN 4 pups met een schaar.</li>
	<li>Spoel het hoofd van de pups kort af in 70% ethanol gevolgd door wassen in PBS.</li>
	<li>Breng het hoofd over op koude HBSS en maak het oog enucleate (herhaal deze stap voor alle hoofden). Om te enucleeren, open de oogleden en fixeer het oog met gebogen tang op het oogzenuwgebied. Trek vervolgens het oog voorzichtig uit de baan.</li>
	<li>Na het verleiden van alle ogen, isoleer het netvlies: introduceer een gesloten schaar in de oogzenuw en open de messen. Peal de RPE/chorid uit. Verwijder de lenzen en bloedvaten met behulp van een gebogen tang.</li>
	<li>Breng het geïsoleerde netvlies over in een reactiebuis van 1,5 ml met de papaïneoplossing (geleverd door de papaïnedissociatiekit).</li>
	<li>Incubeer het netvlies in de papaïneoplossing gedurende 30-60 minuten in een waterbad of shaker (400 tpm) bij 37 °C.<ol>
<li>Terwijl het netvlies incubeert in de papaïneoplossing, pipeteert u 1 ml eiceloplossing tot een reactiebuis van 15 ml (label "1").</li>
			<li>Voeg 60 μl DNase I (10 mg/ml) + 60 μl eiceloplossing (meegeleverd door de kit) + 520 μl EBSS toe aan een reactiebuis van 15 ml (label "2").</li>
		</ol>
</li>
	<li>Breng na de incubatie van papaïne de papaïneoplossing met het gedeeltelijk verteerde netvlies over naar reactiebuis "2".</li>
	<li>Voer met behulp van een vuur gepolijste pipet mechanische dissociatie uit (10x op en neer).</li>
	<li>Pipetteer de eencellige suspensie naar reactiebuis "1". Probeer 2 lagen te genereren door de celsuspensie voorzichtig bovenop de eiceloplossing te legen.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g (ongeveer 1.300 tpm).</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en resuspend de cellen in 500 μl MACS-buffer.</li>
</ol>3. Celsorteren met behulp van magnetische gekoppelde celsortering (MACS)
<ol><li>Voeg X μl rat anti-CD73 antilichaam toe aan de 500 μl om een eindconcentratie van 10 μg/ml te bereiken.</li>
	<li>Incubeer 5 minuten op ijs.</li>
	<li>Vul de reactiebuis van 15 ml tot 10 ml met MACS-buffer en centrifugeer deze gedurende 5 minuten met een snelheid van 300 x g.</li>
	<li>Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspend de pellet in 480 μl MACS buffer en voeg 120 μl geiten anti-rat IgG microbeads toe.</li>
	<li>Incubeer 15 min op ijs; niet roeren, schudden of mengen.</li>
	<li>Vul de reactiebuis van 15 ml tot 5 ml met macs-buffer en centrifugeer deze gedurende 5 minuten bij 300 x g.</li>
	<li>Wanneer de reactiebuis wordt gecentrifugeerd:<ol>
<li>Stel een LS-kolom in de magnetische standaard in.</li>
			<li>Plaats het voorscheidingsfilter boven op de LS-kolom.</li>
			<li>Hydrateer het voorscheidingsfilter en de LS-kolom met 3 ml MACS-buffer en verzamel de MACS-buffer in de wasbuis (W).</li>
		</ol>
</li>
	<li>Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Resuspend de pellet in 500 μl MACS buffer.</li>
	<li>Plaats de celsuspensie van 500 μl in het filter, voeg vervolgens 1 ml MACS-buffer toe aan het filter en verzamel de negatieve fractie in de negatieve fractie (-) reactiebuis.</li>
	<li>Voeg vervolgens 3 x 3 ml MACS-buffer toe aan de kolom om de cellen af te wassen die niet aan de kolom zijn gebonden</li>
	<li>Zodra deze 9 ml door de LS-kolom zijn, verwijdert u de kolom van de magnetische standaard en installeert u deze bovenop de reactiebuis met positieve fractie (+).</li>
	<li>Plaats snel 5 ml MACS-buffer in de LS-kolom en plaats de zuiger in de LS-kolom en druk deze naar beneden totdat de hele buffer door de kolom is.</li>
	<li>Centrifugeer de reactiebuis met de positieve fractie gedurende 5 min bij 300 x g.</li>
	<li>Verwijder het supernatant, resuspend in 500 μl MACS buffer en houd bij 4 °C.</li>
	<li>Tel het totale aantal cellen met behulp van een gemeenschappelijk celtellingsapparaat.</li>
	<li>Bereid een celsuspensie voor uit de positief gesorteerde fractie die 2 x 105 cellen/μl in macs-buffer bevat en houd deze bij 4 °C</li>
</ol>4. Transplantatie van MAC-gesorteerde fotoreceptorprecursorcellen in het netvlies van de muis
<ol><li>Zorg ervoor dat u alle volgende oplossingen bij de hand hebt: 1 ml steriel PBS of HBSS, 10 μl DNAse I, 1-2 ml steriel gedeï gedeïdiseerd H2O, aliquots van de celsuspensiefracties bij 4 °C.</li>
	<li>Verdoof de volwassen muis(d.w.z. 2-4 maanden oud) met een intraperitoneale injectie van medetomidinehydrochloride (0,01 mg/10 g lichaamsgewicht), ketamine (0,75 mg/10 g lichaamsgewicht). Doe vervolgens een subcutane injectie met Buprenorfine (0,05 mg/kg lichaamsgewicht) voor pijnverlichting.</li>
	<li>Verwijd pupillen met een daling van Phenylephrin 2,5%-Tropicamid 0,5%.</li>
	<li>Bevestig de muis in de muiskophouder en plaats deze onder de stereomicroscoop.</li>
	<li>Breng een druppel Visidic gel aan om uitdroging van het oog te voorkomen.</li>
	<li>Maak een klein gaatje op de rand tussen sclera en hoornvlies (respectievelijk ora serrata)met een steriele naald van 30 G 1/2.</li>
	<li>Snijd een gemeenschappelijke hoes in kleine (ongeveer 5 mm x 5 mm) stukken met behulp van een diamantpen, plaats een van deze stukken bovenop het hoornvlies, zodat het netvlies direct kan worden gevisualisatied.</li>
	<li>Spoel de voorgesteriliseerde microliterspuit meerdere keren door met gedeioneerd water.</li>
	<li>Laad de microliterspuit met 1 μl celsuspensie, steek de naald tangentially door het bindvlies en de sclera en plaats deze onder visuele controle in de neushelft van het netvlies.</li>
	<li>Sla voorzichtig een gat in het netvlies totdat u de subretinale ruimte bereikt, injecteer de celsuspensie in de subretinale ruimte.</li>
	<li>Let op de bulleuze ontkoppeling van het netvlies, die uniform moet zijn en ongeveer 1/4 van de netvliesruimte bedekt zonder bloedingen.</li>
	<li>Trek de spuit voorzichtig terug, het netvliesgat sluit automatisch af.</li>
	<li>Spoel de microliterspuit meerdere keren met gedeioneerd water.</li>
	<li>Laat de muis los van de hoofdhouder.</li>
	<li>Maak de muis wakker door atipamozole hydrochloride te injecteren voor omkering van het medetomidine hydrochloride-effect.</li>
	<li>Plaats de muis voor de wektijd in een warme donkere kamer (ongeveer 25 °C).</li>
	<li>De volgende 2 dagen na transplantatie moet Buprenorfine (0,05 mg/kg lichaamsgewicht) 's ochtends en 's middags worden toegediend via subcutane injectie voor pijnverlichting.</li>
</ol>

<ol><li>Bartsch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+cells+integrate+into+the+outer+nuclear+layer+and+differentiate+into+mature+photoreceptors+after+subretinal+transplantation+into+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice.</a> Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).</li>
<li>MacLaren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+repair+by+transplantation+of+photoreceptor+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors.</a> Nature. 444, 203-207 (2006).</li>
<li>Eberle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+segment+formation+of+transplanted+photoreceptor+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Lakowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+and+rod+photoreceptor+transplantation+in+models+of+the+childhood+retinopathy+Leber+congenital+amaurosis+using+flow-sorted+Crx-positive+donor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).</li>
<li>Barber, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+degenerate+retina+by+photoreceptor+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).</li>
<li>Pearson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+vision+after+transplantation+of+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoration of vision after transplantation of photoreceptors.</a> Nature. , (2012).</li>
<li>Singh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+end-stage+retinal+degeneration+and+restoration+of+visual+function+by+photoreceptor+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).</li>
<li>Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+integration+of+transplanted+CD73-positive+photoreceptor+precursors+into+adult+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).</li>
<li>Koso, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD73%2C+a+novel+cell+surface+antigen+that+characterizes+retinal+photoreceptor+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).</li>
<li>Lakowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+transplantation+of+photoreceptor+precursor+cells+selected+via+cell+surface+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression.</a> Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).</li>
<li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+GFP+to+newborn+rods+by+Nrl+promoter+and+temporal+expression+profiling+of+flow-sorted+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).</li>
<li>Lee, M. Y., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+%26%2334%3BThree-step+MACS%26%2334%3B%3A+a+novel+strategy+for+isolating+rare+cell+populations+in+the+absence+of+known+cell+surface+markers+from+complex+animal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Development of the &#34;Three-step MACS&#34;: a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue.</a> J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Subretinale transplantatie van fotoreceptorprecursorencellen is een betrouwbaar hulpmiddel om deze lichtgevoelige cellen in significante aantallen in het netvlies van de gastheer te integreren1,2. Dit zou de oprichting van een celtherapie voor de behandeling van retinale degeneratieve ziekten in de toekomst mogelijk kunnen maken6. De donorpopulatie van cellen, momenteel geïsoleerd van PN 4 retinas, is een mengsel van verschillende celtypen, waaruit alleen de fotoreceptorprecursorcellen integreren na subretinale injectie...

Visie is een van de belangrijkste zintuigen van de mens. Aantasting van deze zin en blindheid zijn een van de belangrijkste redenen voor invaliditeit in geïndustrialiseerde landen. De belangrijkste oorzaak voor slechtziendheid of blindheid is retinale degeneratie, gekenmerkt door fotoreceptorcelverlies, zoals kan worden waargenomen bij maculadegeneratie, retinitis pigmentosa, cone-rod dystrofie en andere aandoeningen. Tot op heden is een effectieve therapie om verloren gezichtsvermogen te herstellen niet beschikbaar. In 2006 en 2008 meldden twee verschillende laboratoria, onafhankelijk van elkaar, een succesvolle transplantatie van staaffotoreceptorprecursorencellen in volwassen wilde muizen retinas1,2. Aldus, het voordoen van de mogelijkheid van fotoreceptor precursor celtransplantatie ook in een ontaard netvlies, om ontaarde fotoreceptoren te vervangen en het gezichtsvermogen te herstellen. Onlangs is namelijk aangetoond dat dergelijke getransplanteerde fotoreceptorprecursorcellen morfologische criteria van volwassen fotoreceptoren van het wilde type oproepen, zoals goed ontwikkelde buitenste segmenten3, synaptische terminals in de nabijheid van endogene bipolaire cellen en een rond cellichaam in de buitenste nucleaire laag2-4, evenals het vermogen om functioneel te integreren in het neurale circuit van de gastheer5-7. Een van de belangrijkste principes van deze strategie is het gebruik van postnatale dag 4 (PN 4, PN0 wordt gedefinieerd als dag van geboorte) jonge muizen netvlies, wat resulteert in een mengsel van verschillende celtypen voor transplantatie. Op de achtergrond van een toekomstige therapeutische toepassing moet dit mengsel worden gezuiverd voor fotoreceptorprecursorcellen. CD73 is beschreven als de eerste celoppervlakmarker specifiek voor jonge fotoreceptoren in het netvlies8-10. Hier demonstreren we een fotoreceptor precursor celzuiveringsmethode op basis van deze celoppervlakmarker en met behulp van de magnetische celsorteertechniek (MACS). MACS kan voordelen hebben in vergelijking met fluorescerende geactiveerde celsorteertechnieken, vanwege snelle sorteertijden en de eenvoudigere aanpassing aan GMP-omstandigheden. We kunnen een verrijking van ~ 90% en een tot 3-voudig hogere integratiesnelheid aantonen bij het transplanteren van de verrijkte populatie naar de subretinale ruimte in volwassen wild-type netvlies. Macs-gebaseerde fotoreceptor precursor celverrijking en subretinale transplantatie zijn dus betrouwbare en veelbelovende technieken voor de ontwikkeling van een regeneratieve therapeutische strategie voor de behandeling van retinale degeneratie.

<table><tbody><tr><td>Papain Dissociation System</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>geleverde DNase I wordt niet gebruikt in de methode</td></tr><tr><td>Gereinigd rat anti-muis CD73, clone TY/23</td><td>BD Pharmingen</td><td>550738</td><td>Voorraadconcentratie 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rat IgG MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-501</td><td>Totaal volume van 2 ml</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td>Gebruikt om het totale aantal cellen te tellen</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025050</td><td>Gebruikt voor dissociatie van de retina's</td></tr><tr><td>Trypan blauw</td><td>Sigma</td><td>Fluka93595</td><td>Gebruikt om het totale aantal cellen te tellen</td></tr><tr><td>Vidisic</td><td>Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Domitor</td><td>Pfizer</td><td>76579</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine 10%</td><td>Ratiopharm</td><td>7538843</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan</td><td>Pfizer</td><td>76590</td><td></td></tr><tr><td>Phenylephrin 2,5%-Tropicamid 0,5%</td><td>University Clinics Dresden Pharmacy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Preseparation Filters</td><td>Miltenyi</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Fire polish glass Pasteur pipette</td><td>Brand</td><td>74777 20</td><td>De punten van de pipet moeten vuur-gepolijst en geautoclaveerd worden.</td></tr><tr><td>MACS 15 ml buisjesstandaard</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-052</td><td></td></tr><tr><td>Celtellingskamer</td><td>Carl Roth</td><td>T728.1</td><td></td></tr><tr><td>Steriele 15 ml buisjes</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Leica M651 MSD</td><td>Leica</td><td>M651 MSD</td><td>kan worden gebruikt in plaats van Olympus SZX10</td></tr><tr><td>Olympus SZX10</td><td>Olympus</td><td>SZX10</td><td>kan worden gebruikt in plaats van Leica M651 MSD</td></tr><tr><td>Olympus omgekeerde stereomicroscoop CKX41</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur kap Thermo Scientific MSC-Advance</td><td>Thermo Scientific</td><td>51025411</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml reactiebuisje</td><td>Sarstedt</td><td>727706400</td><td></td></tr><tr><td>2 ml reactiebuisje</td><td>Sarstedt</td><td>72695</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5702</td><td>VWR (Eppendorf)</td><td>521-0733</td><td></td></tr><tr><td>Muiskophouder</td><td>myNeurolab</td><td>471030</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 3 30 G 1/2 in</td><td>BD Pharmingen</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton microliter spuit 5 &micro;l, 75RN</td><td>Hamilton</td><td>065-7634-01</td><td>wordt geleverd zonder naalden</td></tr><tr><td>Hamilton RN speciale naald 34 G</td><td>Hamilton</td><td>065-207434</td><td>Blunt, 12 mm lengte</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml;bingen Veerscharen - 5 mm Bladen Recht</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>Diamantstift</td><td>Tools-tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mm x 15 mm Deksels</td><td>Sparks</td><td>MIC3366</td><td></td></tr></tbody></table>

subretinale transplantatie van macs gezuiverde fotoreceptor precursor cellen in de volwassen muis retina

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Slechtziendheid en blindheid als gevolg van het verlies van de lichtgevoelige cellen van het netvlies, d.w.z. fotoreceptoren, vormen de belangrijkste reden voor invaliditeit in geïndustrialiseerde landen. Vervanging van ontaarde fotoreceptoren door celtransplantatie is een mogelijke behandelingsoptie in toekomstige klinische toepassingen. Recente preklinische studies toonden inderdaad aan dat onrijpe fotoreceptoren, geïsoleerd van het neonatale netvlies van de muis op postnatale dag 4, het potentieel hebben om te integreren in het volwassen netvlies van de muis na subretinale transplantatie. Donorcellen genereerden een volwassen fotoreceptormorfologie inclusief binnen- en buitensegmenten, een rond cellichaam in de buitenste nucleaire laag en synaptische terminals in de nabijheid van endogene bipolaire cellen. Recente rapporten toonden inderdaad aan dat donorfotoreceptoren functioneel integreren in het neurale circuit van gastheermuizen. Voor een toekomstige klinische toepassing van een dergelijke celvervangingsbenadering moeten gezuiverde suspensussingen van de cellen van keuze worden gegenereerd en op de juiste positie worden geplaatst voor een goede integratie in het oog. Voor de verrijking van voorlopers van fotoreceptoren moet de sortering gebaseerd zijn op specifieke celoppervlakantigenen om genetische manipulatie van donorcellen te voorkomen. Hier tonen we magnetische-geassocieerde celsortering (MACS) - verrijking van transplanteerbare staaffotoreceptorprecursoren geïsoleerd van het neonatale netvlies van fotoreceptorspecifieke reportermuizen op basis van de celoppervlakmarker CD73. Incubatie met anti-CD73-antilichamen gevolgd door microparel geconjugeerde secundaire antilichamen maakte de verrijking van staaffotoreceptorprecursoren door MACS tot ongeveer 90% mogelijk. In vergelijking met flowcytometrie heeft MACS het voordeel dat het gemakkelijker kan worden toegepast op GMP-normen en dat grote hoeveelheden cellen in relatief korte tijdsperioden kunnen worden gesorteerd. Injectie van verrijkte celsuspensingen in de subretinale ruimte van volwassen wilde muizen resulteerde in een 3-voudig hogere integratiesnelheid in vergelijking met ongesorteerde celsuspensingen.

Om het vermogen van staaffotoreceptoren te beoordelen om in het netvlies van de muis te integreren, werd een muisreporterlijn gebruikt, waarbij GFP wordt aangedreven door de neurale retina leucine rits (Nrl, Nrl-GFP) promotor11. Nrl is de vroegste marker van staaffotoreceptoren die zijn expressie op E12.5 gedurende de volwassenheid begint, waardoor een specifieke etikettering van donorstaaffotoreceptorcellen mogelijk is.
PN 4 Nrl-GFP pups werden onthoofd en ogen werden ingekapseld. ...

Celtransplantatie vertegenwoordigt een strategie voor de behandeling van netvliesdegeneratie die wordt gekenmerkt door fotoreceptorverlies. Hier beschrijven we een methode voor verrijking van transplanteerbare fotoreceptoren en hun subretinale enting in volwassen muizen.

Subretinale transplantatie van MACS gezuiverde fotoreceptor precursor cellen in de volwassen muis retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het transplanteren van verrijkte fotoreceptor-precursorcellen in de retina van een recipientmuis. Dit wordt bereikt door eerst de retina van jonge donordieren te isoleren. In de tweede stap worden de postnatale fotoreceptor-precursorcellen uit de retinale celpopulatie geïsoleerd middels CD 73-gebaseerde magnetische cel-sortering.Vervolgens worden de fotoreceptorprecursoren getransplanteerd in de subretinale ruimte van recipientdieren om hun integratie in het retina van de recipient te faciliteren. Uiteindelijk kunnen het integratiepotentieel en het gedrag van de getransplanteerde fotoreceptorprecursorcellen worden geanalyseerd middels immunofluorescentiemicroscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van retina-regeneratie, zoals wat de capaciteit is van getransplanteerde fotoreceptoren om te integreren in het neurale circuit van de gastheer voor het herstel van het gezichtsvermogen.De implicaties van deze techniek reiken verder dan de behandeling van degeneratieve retinale ziekten. Zodra de installatie en verrijking van fotoreceptorprecursors door max eenvoudig kan worden aangepast aan GMP-condities, is een visuele demonstratie van deze methode essentieel. Omdat de transplantatiestappen moeilijk aan te leren zijn, zijn de subtiele hantering en de plaatsing van de naald in de subretinale ruimte cruciaal om maximaal succes en reproduceerbaarheid te garanderen. Om de retina's te dissociëren, begint men met het kort spoelen van de koppen van pups van postnatal dag vier in 70%ethanol, gevolgd door een PBS-wasbeurt.Breng de koppen vervolgens over naar koud HBSS om de ogen te nucleëren. Open eerst het ooglid. Gebruik daarna een gebogen pincet.Pak het orgaan vast bij de regio van de oogzenuw en trek het oog voorzichtig uit de oogkas. Om vervolgens het netvlies te isoleren, brengt u de punt van een gesloten schaar in de oogzenuw en opent u de bladen. Pel het retinaal pigmentepitheel en het vaatvlies los, en gebruik gebogen pincetten om de lens en de bloedvaten te verwijderen.Incubeer de geïsoleerde retinae gedurende 30 tot 60 minuten in een reactiebuis van 1,5 milliliter met papaïne-oplossing in een shaker bij 400 RPM en 37 °C. Terwijl de retinae incuberen, brengt u één milliliter OVO moid-oplossing over in een reactiebuis van 15 milliliter, gelabeld als één, en vervolgens naar een reactiebuis van 2 milliliter, gelabeld als twee, met 60 µL DNAs één, 60 µL OVO MOID-oplossing en 520 µL EBSS. Draag na de incubatie de papaïne-oplossing met de gedeeltelijk verteerde retinae over naar reactiebuis twee en tritureer de retinae vervolgens 10 keer met een vuurgepolijste pipet.Breng de enkelcel-suspensie voorzichtig in lagen aan bovenop de OVO MOID-oplossing in reactiebuis één en centrifugeer de cel-oplossing gedurende vijf minuten bij 300 Gs en kamertemperatuur. Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer de cellen in 500 µL max-buffer. Om via max te sorteren, worden de cellen eerst op ijs geïncubeerd in 10 µg/mL rat anti-CD73-antilichaam.Was de cellen na vijf minuten met 10 milliliters max buffer. Resuspendeer het pellet vervolgens in 480 microliters max buffer en incubeer de cellen in 120 microliters go anti RET IgG microbeads op ijs zonder agitatie, schudden of mengen. Was de cellen na 15 minuten met vijf milliliters max buffer; plaats tijdens het wassen een LS-kolom op een max magneet en zet een pres separatiefilter bovenop de kolom.Hydrate vervolgens het filter en de kolom met drie milliliters max buffer. Verzamel de buffer in een 15 milliliter buis met het label W voor wassing. Wanneer de cellen volledig zijn gecentrifugeerd, resuspendeer het pellet in 500 microliters max buffer en breng de cellen over naar het filter.Voeg één milliliter max-buffer toe bovenop de cellen en verzamel vervolgens de negatieve fractie in een reactiebuis van 15 milliliter met het label 'minus' voor negatief. Voeg daarna drie keer drie milliliter max-buffer toe aan de kolom om deze te wassen. Verwijder nu de kolom van het magnetische rek.Plaats deze bovenop een reactiebuis van 15 milliliter met het label 'plus' voor positief. Laat vervolgens snel vijf milliliter max buffer in de kolom lopen. Centrifugeer de volledige hoeveelheid buffer door de kolom en resuspendeer, na het centrifugeren van de positieve fractie, de pellet in 500 microliters max buffer.Plaats de cellen bij vier graden Celsius en tel ze. Pas vervolgens de concentratie aan naar twee keer 10 tot de vijfde cellen per microliter in max buffer, waarbij de cellen bij vier graden Celsius worden gehouden. Voor de transplantatie van de geïsoleerde fotoreceptor-voorlopercellen worden de pupillen van een gesedeerde volwassen muis gedilateerd met een druppel phenyl-ethylnoradrenaline; terwijl de pupillen dilateren, wordt een diamantpen gebruikt om een dekglas in stukjes van ongeveer vijf bij vijf millimeter te snijden.Plaats de muis onder een stereomicroscoop, fixeer het dier in een muizenkophouder en breng vervolgens een druppel ICIC-gel aan in elk oog om uitdroging te voorkomen. Gebruik nu een naald van 30 gauge en een halve inch om een klein gaatje te maken op de grens tussen de sclera en het hoornvlies. Plaats daarna een van de dekglasstukjes van vijf bij vijf millimeter bovenop het hoornvlies, zodat de retina direct zichtbaar is.Spoel vervolgens een vooraf gesteriliseerde microliterspuit meerdere keren met steriel gedeïoniseerd water en vul de spuit daarna met een van de gesorteerde cel-suspensies. Steek de naald diagonaal door het conjunctiva en de sclera en plaats deze in de nasale helft van het netvlies. Maak vervolgens voorzichtig een gaatje door het netvlies naar de subretinale ruimte en injecteer de cellen.Bevestig de bulleuze, uniforme loslating van het netvlies, die ongeveer een kwart van de ruimte van het netvlies moet beslaan zonder enige bloeding. Trek vervolgens de spuit voorzichtig terug en spoel deze nog enkele keren met het geïoniseerde water. Laat de muis tot slot uit de fixatiehouder vrij.Injecteer het dier met aamaz-olie hydrochloride om de effecten van de anesthesie ongedaan te maken en laat het herstellen in een donkere kamer van 25 degrees Celsius om het vermogen van staafjesfotoreceptoren om te integreren in het netvlies van de muis te beoordelen. Er werd gebruikgemaakt van een reporterlijn van muizen waarin GFP wordt aangestuurd door de neural retina losing zipper of NRL-promotor, zoals aangetoond in deze histogrammen. De initiële retinale celsuspensie bevatte 30.4% GFP-positieve staafjesfotoreceptoren.Na max sorting op basis van CD 73 werd een verrijking van maximaal 86,9% van de GFP-positieve fotoreceptor-precursorcellen waargenomen in de CD 73-positieve fractie. In de CD 73-negatieve fractie was slechts 9,9% van de cellen positief voor GFP. De verrijking van N-R-L-G-F-P-positieve cellen na max sorting op basis van CD 73 is eveneens waargenomen.Na in vitro uitplating blijven de donorcellen op de injectieplaats, zoals bepaald door de bulleuze loslating van het gastnetvlies, en integreren ze in de buitenste nucleaire laag van het gastnetvlies, waarbij ze de morfologie van mature fotoreceptoren aannemen. Zodra de master magnetic associated cell sorting correct is uitgevoerd, kan dit binnen twee uur worden voltooid. Deze procedure kan ook worden aangepast voor de verrijking van uit stamcellen afgeleide fotoreceptoren of zelfs andere retinale stamcellen.Gezien de beschikbaarheid van specifieke antilichamen om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking tot herstel of redding door celtransmutatie voor het netvlies. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u fotoreceptor-precursorcellen, verrijkt met Photo max, transplanteert naar de subretinale ruimte van recipientenmuizen.

subretinal-transplantation-macs-purified-photoreceptor-precursor

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Hier presenteren we een door de gemeenschap geaccepteerd protocol in multimedia-formaat voor het subretinaal injecteren van een bolus RPE-cellen bij ratten en muizen. Deze aanpak kan worden gebruikt voor het bepalen van reddingspotentieel, veiligheidsprofielen en overlevingscapaciteiten van getransplanteerde RPE-cellen bij implantatie in diermodellen van retinale degeneratie.

Presterende Subretinal Injecties in Knaagdieren om retinale pigment epitheel cellen leveren in Suspension

Netvliespigmentepitheel (RPE) vervangende strategieën en gen-gebaseerde therapie in aanmerking komen voor een aantal retinale degeneratieve aandoeningen. Voor klinische toepassing worden grote oog dierlijke modellen moeten chirurgische technieken bij patiënten toepassing bestuderen. Hier presenteren we een konijnenmodel voor subretinale chirurgie gericht RPE transplantatie, die veelzijdig en kostenefficiënt.

Een Step by Step Protocol voor Subretinal Surgery in Rabbits

Subretinal injectie is veel toegepast in preklinische studies van stamcel substitutietherapie voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie. In dit gevisualiseerde artikel beschrijven we een minder riskant, reproduceerbaar zijn en juist gewijzigd subretinal injectietechniek via de trans-scleral-benadering te leveren van cellen in de ogen van de rat.

Ontwikkeling van een verfijnde Protocol voor Trans-scleral Subretinal transplantatie van menselijke retinale Pigment epitheliale cellen in de ogen van de Rat

Retinale pigment epitheliale cellen kunnen dienen als een cel-vervangende therapie voor de geavanceerde vorm van droge leeftijdsgebonden Macula degeneratie. Dit protocol beschrijft de generatie van een grote-eyed model van geografische atrofie en subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen cel afkomstige retinale pigment epitheliale cellen in dit model van ziekte.

Subretinal transplantatie van menselijke embryonale stamcellen afgeleid-retinale Pigment epitheliale cellen in een grote-eyed Model van geografische atrofie

Hier wordt een chirurgische techniek gepresenteerd voor het transplanteren van van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) afgeleid netvliesweefsel in de subretinale ruimte van een groot diermodel.

Subretinale transplantatie van menselijk embryonaal stamcel-afgeleid retinaal weefsel in een katachtig groot diermodel

De niet-menselijke primaat (NHP) is een ideaal model voor het bestuderen van menselijke retinale cellulaire therapieën vanwege de anatomische en genetische overeenkomsten. Dit manuscript beschrijft een methode voor submaculaire transplantatie van retinale pigmentepitheelcellen in het NHP-oog en strategieën om intraoperatieve complicaties geassocieerd met maculaire manipulatie te voorkomen.

Retinale pigmentepitheeltransplantatie in een niet-humaan primaatmodel voor degeneratieve retinale ziekten

Dit protocol presenteert een transpupillaire zichtgeleide transsclerale benadering om veilig en nauwkeurig subretinale cellulaire transplantaten af te leveren, met een laag aantal chirurgische complicaties, bij muizenontvangers met of zonder retinale degeneratie.

Transpupilgeleide transsclerale transplantatie van subretinale transplantaten in een muismodel voor retinale degeneratie

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de bereiding van post-gecryopreserveerde hESC-afgeleide fotoreceptor-voorlopercellen en de subretinale afgifte van deze cellen in rd10-muizen .

Subretinale toediening van van menselijke embryonale stamcellen afgeleide fotoreceptorvoorlopercellen bij RD10-muizen

Een muis model van de In Utero Transplantatie

Deze chirurgische techniek illustreert de injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de subretinale ruimte van de muis oog.

Subretinale Injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de Mouse Eye

Leer subretinale transplantatie van MACS-gezuiverde fotoreceptor precursorcellen in de volwassen muisretina. Deze methode ondersteunt onderzoek naar retinale regeneratie en het herstel van visie.

Subretinale transplantatie van MACS gezuiverde fotoreceptor precursor cellen in de volwassen muis retina

Meer video's verkennen