Kwantitatieve analyse en karakterisering van atherosclerotische laesies in de muis aortasinus

Het algemene doel van deze procedure is om atherosclerotische laesies in de aorta sinus van MI te karakteriseren en te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst een geëxtraheerd hart te disseceren om het apicale gedeelte te scheiden en de aorta sinus te lokaliseren. Vervolgens worden paraffineblokken bereid met het verwerkte apicale gedeelte van het hart.

Daarna wordt de aorta sinus gesneden en op dia's gemonteerd. Ten slotte worden de weefselsecties gekleurd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die verschillende grootten en samenstellingen van atherosclerotische laesies laten zien door middel van histochemische en immunohistochemische analyse.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Daniel Venga penal, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium. De McMaster University Animal Research Ethics Board heeft alle hierin beschreven procedures vooraf goedgekeurd na het anestheseren van een LDLR dubbel negatieve muis en het extraheren van het bloed, het euthanaseren en fixeren ervan voordat het hart wordt geïsoleerd volgens het tekstprotocol, gebruik een scalpel om een transversale snede in het hart te maken loodrecht op de opgaande aorta. Plaats de apicale of bovenste portie van het hart in een inbeddingscassette en dompel het onder in Formin.

Plaats vervolgens de cassette in een weefselprocessor en laat het overnacht doorlopen. Gebruik het programma dat in het tekstprotocol voor de histologievormen is geschetst om paraffinewas gedurende de nacht te smelten bij 62 graden Celsius. Plaats elk bewerkt weefsel in een diepe histologievorm en zorg ervoor dat het oppervlak van het hart de basis van de mal raakt, en giet vervolgens gesmolten paraffinewas om de mal volledig te vullen.

Gebruik een gelabelde plastic cassette om de mal te bedekken. Nadat de mallen zijn afgekoeld op ijs of een koude oppervlakte, scheidt u de blok van de mal om de aorta te sectioneren. Plaats de blok in de monsterhouder van de microtoom zodat deze van binnenuit naar de bovenkant van het hart kan worden gesneden.

Stel de microtoom in op 10 microns en sectioneer het hart. Verzamel secties op een glasplaatje en onderzoek ze onder een lichtmicroscoop om positie en oriëntatie te bepalen. De sinus moet eruit zien als drie tweeledige klepbases met aangehechte blaadjes.

Wanneer een of twee kleppen van de aorta sinus zichtbaar worden, pas dan de hoek van de blok aan zoals nodig is. Wanneer de kleppen zijn bereikt, stelt u de microtoom in om het vier tot vijf micron te snijden. Monteer de eerste 10 secties elk aan de bovenkant van afzonderlijke glasplaatjes, en monteer vervolgens elke volgende groep van 10 secties op de volgende positie.

Op de dia's. Blijf secties verzamelen totdat er geen atherosclerotische laesie wordt waargenomen. Om secties met hematine en eoine te kleuren om laesies te visualiseren, plaatst u de dia's gedurende acht minuten in een luchtdroger.

Ontparizeer vervolgens de secties door ze vier keer met xyleen te wassen gedurende drie minuten per keer. Was de dia's drie keer gedurende drie minuten in 100% ethanol. Vervolgens 70% ethanol en 50% ethanol.

Drie keer gedurende drie minuten per keer. Gebruik gedistilleerd water om de dia's te spoelen en dompel ze vervolgens in MA's hematine gedurende 15 minuten.

Was en loop. Tapwater gedurende vijf minuten. Was vervolgens en gedistilleerd water gedurende vijf minuten na het onderdompelen in eoin Y gedurende één tot vijf minuten.

Was en gedistilleerd water drie keer gedurende vijf minuten elke. 50% ethanol twee keer gedurende twee minuten elke. Vervolgens 70% ethanol drie keer gedurende twee minuten elke was, en 100% ethanol.

Drie keer gedurende twee minuten per keer. Was en xyleen vier keer gedurende twee minuten per keer. Gebruik een op xyleen gebaseerd montagemedium om de secties te monteren en afbeeldingen te maken onder een lichtmicroscoop.

Gebruik beeldverwerkingssoftware om laesies te identificeren en te kwantificeren, die kunnen worden bepaald op specifieke afstanden van de aorta sinus met tussenpozen van 40 tot 50 micron, afhankelijk van de dikte van de secties, raadpleeg het tekstprotocol voor immunohistochemische en immunofluorescentiekleuring. Vijf weken oude LDLR. Positieve muizen kregen gedurende 10 weken een standaard dieet of een hoogvet dieet voordat hun harten werden gefixeerd, geïsoleerd en gesneden zoals hier getoond.

Wanneer muizen een standaard voerdieet krijgen, is de ontwikkeling van atherosclerose zeer beperkt en is deze mogelijk niet detecteerbaar na 15 weken van acht. Een hoogvet dieet versnelt de atherogenese aanzienlijk in dit model en induceert de vorming van grote geavanceerde laesies die chronische acellulaire kernen en fibreuze kappen bevatten. Atherosclerotische laesies kunnen verder worden gekenmerkt door kleuring voor de aanwezigheid van specifieke celtypen en factoren die stadia van laesieontwikkeling definiëren.

Monocyteninfiltratie in de intima vertegenwoordigt een van de vroegste gebeurtenissen van atherogenese intima. Monocyten differentiëren in macrofagen die cellulaire resten en lipiden opsluiten. Lipidenverzadigde macrofagen, bekend als schuimcellen, creëren een vetstrepen in de slagaderwand die hier wordt gezien.

Macrofaagschuimcellen kunnen in alle stadia van laesieontwikkeling worden gedetecteerd door te kleuren met antilichamen tegen specifieke macrofaagmarkers zoals F vier 80 en MAC drie. Vasculaire gladde spiercellen of v SMC's zijn beperkt tot de mediale laag van een gezonde slagader. VSC's worden geïnduceerd om te migreren en te prolifereren in de intima tijdens de ontwikkeling van een geavanceerde laesie.

Zoals te zien is in dit paneel, kunnen V SMC's worden geïdentificeerd door te kleuren met een antilichaam tegen alfa-actine na de ontwikkeling. Deze techniek heeft de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van hart- en vaatziekten om de ontwikkeling en progressie van atherosclerotische laesies in staven te onderzoeken.