Kwantitatieve analyse en karakterisering van atherosclerotische laesies in de muis aortasinus

Het algemene doel van deze procedure is om atherosclerotische laesies in de aortasinus van het myocardinfarct (MI) te karakteriseren en te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst een uitgenomen hart te dissekeren om het apicale gedeelte te scheiden en de aortasinus te lokaliseren. Vervolgens worden er paraffineblokken gemaakt met het bewerkte apicale gedeelte van het hart.

Vervolgens wordt de aortasinus doorsneden en op objectglazen gemonteerd. Ten slotte worden de weefselcoupes gekleurd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die door middel van histochemische en immunohistochemische analyse verschillende groottes en samenstellingen van atherosclerotische laesies aantonen.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Daniel Venga penal, een promovendus uit mijn laboratorium. De Animal Research Ethics Board van McMaster University heeft alle hierin beschreven procedures vooraf goedgekeurd. Na het anesthetiseren van een LDLR double negative muis en het afnemen van bloed, wordt het dier geëuthanaseerd en gefixeerd voordat het hart wordt geïsoleerd volgens het tekstprotocol. Gebruik een scalpel om een transversale snede in het hart te maken, loodrecht op de aorta ascendens. Plaats het apicale of bovenste gedeelte van het hart in een inbedcassette en dompel het onder in Formin.

Plaats de cassette vervolgens in een weefselprocessor en proces deze gedurende de nacht. Smelt volgens het programma dat is beschreven in het tekstprotocol voor histologiemallen de paraffine gedurende de nacht bij 62 °C. Plaats elk geprocesseerd weefsel in een diepe histologiemal, waarbij u ervoor zorgt dat de interface van het hart de bodem van de mal raakt, en giet vervolgens gesmolten paraffine om de mal volledig te vullen.

Gebruik een gelabelde plastic cassette om de mal af te dekken. Nadat de mallen op ijs of een koud oppervlak zijn afgekoeld, wordt het blok uit de mal gehaald om de aorta in coupes te snijden. Plaats het blok in de monsterhouder van de microtoom, zodat het van binnenuit naar de bovenkant van het hart kan worden gesneden.

Stel de microtoom in op 10 microns en maak coupes van het hart. Verzamel de coupes op een glazen objectglas en bestudeer deze onder een lichtmicroscoop om de positie en oriëntatie te bepalen. De sinus moet zichtbaar zijn als drie bipartiete klepbasissen met daaraan bevestigde klepbladen.

Wanneer één of twee kleppen van de aortasinus zichtbaar worden, pas dan de hoek van het blok naar behoefte aan. Zodra de kleppen zijn bereikt, stel de microtoom zo in dat er coupes van vier tot vijf micron worden gesneden. Monteer de eerste 10 coupes elk aan de bovenzijde van afzonderlijke glazen objectglazen, en monteer vervolgens elke volgende groep van 10 coupes op de volgende positie.

Op de objectglazen. Ga door met het verzamelen van coupes totdat er geen atherosclerotische laesies meer worden waargenomen. Om de coupes met hematoxyline en eosine te kleuren om de laesies te visualiseren, plaatst u de objectglazen gedurende acht minuten in een luchtdroger.

Deparaffinise vervolgens de secties door ze vier keer drie minuten lang te wassen met xyleen. Was de coupes drie keer drie minuten lang in 100% ethanol. Was daarna in 70% ethanol en 50% ethanol.

Drie keer gedurende drie minuten per keer. Gebruik gedestilleerd water om de objectglaasjes te spoelen en dompel ze vervolgens gedurende 15 minuten onder in hematine van MA.

Was en spoel met kraanwater gedurende vijf minuten. Was vervolgens met gedestilleerd water gedurende vijf minuten na het onderdompelen in eosine Y voor één tot vijf minuten.

Was drie keer gedurende vijf minuten met gedestilleerd water. Was twee keer gedurende twee minuten met 50% ethanol. Was vervolgens drie keer gedurende twee minuten met 70% ethanol, gevolgd door 100% ethanol.

Drie keer gedurende twee minuten elk. Was daarna vier keer gedurende twee minuten elk met xyleen. Gebruik een op xyleen gebaseerd montagemedium om de coupes te monteren en leg beelden vast met een lichtmicroscoop.

Gebruik beeldbewerkingssoftware om laesies te identificeren en te kwantificeren, wat bepaald kan worden op specifieke afstanden vanaf de aortasinus met intervallen van 40 tot 50 micron, afhankelijk van de dikte van de coupes; raadpleeg het tekstprotocol voor immunohistochemische en immunofluorescentiekleuring. Vijf weken oude LDLR. Positive muizen kregen een standaarddieet of een vetrijk dieet gedurende 10 weken voordat hun harten werden gefixeerd, geïsoleerd en gesneden zoals hier wordt getoond.

Wanneer muizen een standaardchowdieet krijgen, is de ontwikkeling van atherosclerose zeer beperkt en mogelijk niet detecteerbaar op 15-weekse leeftijd. Een vetrijk dieet versnelt de atherogenese in dit model aanzienlijk en induceert de vorming van grote, gevorderde laesies met chronische acellulaire kernen en fibreuze kappen. Atherosclerotische laesies kunnen verder worden gekarakteriseerd door kleuringen voor de aanwezigheid van specifieke celtypen en factoren die stadia van laesieontwikkeling definiëren.

Monocyteninfiltratie in de intima vormt een van de vroegste gebeurtenissen bij atherogenese van de intima. Monocyten differentiëren tot macrofagen die cellulair debris en lipiden opnemen. Lipiderijke macrofagen, bekend als schuimcellen, vormen een vette streep in de arteriewand, zoals hier te zien is.

Macrofaag-schuimcellen kunnen in alle stadia van laesieontwikkeling worden aangetroffen door kleuring met antilichamen tegen specifieke macrofaagmarkers zoals F4/80 en MAC3. Vasculaire gladde spiercellen of vSMC's zijn beperkt tot de mediale laag van een gezonde slagader. vSMC's worden gestimuleerd om te migreren en te prolifereren in de intima tijdens de ontwikkeling van een gevorderde laesie.

Zoals in dit paneel te zien is, kunnen V SMC's worden geïdentificeerd door kleuring met een antilichaam tegen alpha actin na de ontwikkeling. Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van cardiovasculaire ziekten om de ontwikkeling en progressie van atherosclerotische laesies in knaagdieren te bestuderen.