Name: Kwantitatieve analyse en karakterisering van atherosclerotische laesies in de muis aortasinus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-07T22:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Leer hoe u atherosclerotische laesies in muizen kwantitatief analyseert met histochemische en immunohistochemische technieken. Deze methode ondersteunt cardiovasculair onderzoek naar ziekteontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door een exploitatiesubsidie van de Canadian Institutes of Health Sciences en de Canadian Diabetes Association. DEV wordt ondersteund door een beurs van de Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT, Chili).

De Animal Research Ethics Board van McMaster University heeft alle hierin beschreven procedures vooraf goedgekeurd.
1. Hart en aorta verzamelen
<ol>
	<li>Verdoofd de muis en open voorzichtig de borstholte om het hart en de proximale aorta zichtbaar te maken.
	<ol>
		<li>Extracteer het bloed uit de muis door directe punctie van de rechter ventrikel van het hart. 
		Opmerking: Het bloed kan worden opgeslagen en gebruikt voor de analyse van plasmalipiden en andere bloedfactoren.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dode de muis door cervicale dislocatie.</li>
	<li>Spoel de vaatbundel met 5 ml zoutoplossing. 
	Opmerking: Dit wordt bereikt door zwaartekrachtperfusie door een naaldpunctie in de linker ventrikel. Om drainage mogelijk te maken, wordt een kleine insnijding gemaakt in het rechter atrium. Na het spoelen van de vaatbundel, kunnen weefselmonsters van lever, spier en vetweefsel worden verzameld, snel bevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ºC voor toekomstige analyse.</li>
	<li>De vaatbundel wordt gefixeerd door zwaartekrachtperfusie in de linker ventrikel met 10% neutraal gebufferde formaline. 
	Opmerking: Zodra de perfusie is gestart, wordt de stroom van 10% neutraal gebufferde formaline aangepast tot een langzame druppel zodat het proces 1-2 minuten duurt. Organen en weefsels die zijn geperfundeerd, kunnen worden gebruikt voor de studie van eiwitexpressie door immunofluorescentie of histochemie, maar ze kunnen over het algemeen niet worden gebruikt als monsters voor western blotting of voor de studie van genexpressie.</li>
	<li>Extracteer voorzichtig het hart en ongeveer 2 mm van de proximale aorta uit het karkas. Andere weefsels, inclusief de aflopende aorta, kunnen worden verzameld en opgeslagen voor latere analyse. 
	Opmerking: De aflopende aorta (tot de iliacale bifurcatie) kan ook worden gebruikt om atherosclerose te onderzoeken.</li>
	<li>Maak een transversale snede met een scalpel op het verwijderde hart op een manier die loodrecht staat op de opgaande aorta. 
	Opmerking: Dit wordt vergemakkelijkt door het gebruik van een dissectiemicroscoop en kan effectief worden gedaan door te snijden langs een rechte lijn die de onderste uiteinden van de rechter en linker atria verbindt (Figuur 1).</li>
	<li>Bewaar het apicale (bovenste) deel van het hart in een inbeddingscassette en dompel het onder in neutraal gebufferde formaline voor verwerking.</li>
</ol>
2. Voorbereiding van de aorta
<ol>
	<li>Plaats de cassette met het gedissekteerde weefsel in de weefselprocessor.</li>
	<li>Verwerk weefselmonsters. 
	Opmerking: Over het algemeen zijn weefselprocessoren geprogrammeerd om 's nachts te werken vanwege de lengte van de operatie en de oplossingen die bij dit proces betrokken zijn. De monsters worden verwerkt volgens een vast protocol:
	<ol>
		<li>10% neutraal gebufferde formaline gedurende 1 uur bij 42 ºC.</li>
		<li>10% neutraal gebufferde formaline gedurende 1 uur bij 42 ºC.</li>
		<li>70% ethanol gedurende 30 minuten bij 40 ºC.</li>
		<li>85% ethanol gedurende 30 minuten bij 40 ºC.</li>
		<li>100% ethanol gedurende 45 minuten bij 40 ºC.</li>
		<li>100% ethanol gedurende 45 minuten bij 40 ºC.</li>
		<li>100% ethanol gedurende 45 minuten bij 40 ºC.</li>
		<li>Xyleen gedurende 1 uur bij 40 ºC.</li>
		<li>Xyleen gedurende 1 uur bij 40 ºC.</li>
		<li>Xyleen gedurende 1 uur bij 40 ºC.</li>
		<li>Paraffinewas gedurende 45 minuten bij 63 ºC.</li>
		<li>Paraffinewas gedurende 45 minuten bij 63 ºC.</li>
		<li>Paraffinewas gedurende 45 minuten bij 63 ºC.</li>
		<li>Paraffinewas gedurende 45 minuten bij 63 ºC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Smelt de paraffinewas 's nachts bij 62 ºC (Figuur 1D-E). Schat de totale hoeveelheid paraffinewas die moet worden gebruikt op basis van de gram paraffinewas die nodig is om een histologievorm te vullen en het aantal blokken dat moet worden bereid. 
	Opmerking: Een diepe histologievorm heeft de voorkeur boven een ondiepe vorm omdat deze een breder potentieel rotatiehoek biedt bij het snijden. Een enkele diepe histologievorm vereist 11 g paraffinewas.</li>
	<li>Plaats elk verwerkt weefsel in een diepe histologievorm en giet vervolgens gesmolten paraffinewas om de vorm volledig te vullen (Figuur 1F). Bedek de vorm met een gelabelde plastic cassette (Figuur 1G).</li>
	<li>Koel de gevulde vorm op ijs of op een koude oppervlakte (Figuur 1H) om de vaste blok te creëren en de blok van de vorm te scheiden (Figuur 1I-J). 
	Opmerking: Wanneer het gedissekteerde hart in de vorm wordt geplaatst, zorg ervoor dat het binnenoppervlak van het hart de basis van de vorm raakt en ga dan verder met het vullen van de blok met gesmolten paraffine. Een gelabelde plastic cassette bedekt de vorm voordat deze stolt om een basis te bieden om de blok te hanteren. Eenmaal afgekoeld, wordt de vorm verwijderd en kunnen de paraffineblokjes voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur worden bewaard.</li>
</ol>
3. Het snijden van de aorta
<ol>
	<li>Plaats de blok met het hart in de monstershouder van de microtoom zodat het van binnen naar de bovenkant van het hart kan worden gesneden (Figuur 2)</li>
	<li>Stel de microtoom in om een sectie dikte van 10 µm te snijden en ga door met het snijden van het hart.</li>
	<li>Verzamel secties op een glazen plaat en onderzoek onder een lichtmicroscoop om de positie

<ol><li>Zadelaar, S., Kleemann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+atherosclerosis+and+pharmaceutical+modifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for atherosclerosis and pharmaceutical modifiers.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27 (8), 1706-1721 (2007).</li>
<li>Daugherty, A., Rateri, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+experimental+designs+for+atherosclerosis+studies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Development of experimental designs for atherosclerosis studies in mice.</a> Methods. 36, 129-138 (2005).</li>
<li>Getz, G. S., Reardon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+and+murine+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Diet and murine atherosclerosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 26 (2), 242-249 (2006).</li>
<li>Zhang, S. H., Reddick, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+hypercholesterolemia+and+arterial+lesions+in+mice+lacking+apolipoprotein+E%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E.</a> Science. 258 (5081), 468-471 (1992).</li>
<li>Ishibashi, S., Goldstein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+xanthomatosis+and+atherosclerosis+in+cholesterol-fed+low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice.</a> J. Clin. Invest. 93 (5), 1885-1893 (1994).</li>
<li>Kunjathoor, V. V., Wilson, D. L., LeBoeuf, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+atherosclerosis+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Increased atherosclerosis in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> J. Clin. Invest. 97 (7), 1767-1773 (1996).</li>
<li>Hartvigsen, K., Binder, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+diet-induced+hypercholesterolemic+murine+model+to+study+atherogenesis+without+obesity+and+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">A diet-induced hypercholesterolemic murine model to study atherogenesis without obesity and metabolic syndrome.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27 (4), 878-885 (2007).</li>
<li>King, V. L., Hatch, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+obesity+with+accelerated+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity%22%5BJournal%5D)">A murine model of obesity with accelerated atherosclerosis.</a> Obesity. 18 (1), 35-41 (2004).</li>
<li>Taylor Weiss, D. &, R, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxycorticosterone+acetate+salt+hypertension+in+apolipoprotein+E-%2F-+mice+results+in+accelerated+atherosclerosis%3A+the+role+of+angiotensin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Deoxycorticosterone acetate salt hypertension in apolipoprotein E-/- mice results in accelerated atherosclerosis: the role of angiotensin II.</a> Hypertension. 51 (2), 218-224 (2008).</li>
<li>Gairola, C. G., Drawdy, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sidestream+cigarette+smoke+accelerates+atherogenesis+in+apolipoprotein+E-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Sidestream cigarette smoke accelerates atherogenesis in apolipoprotein E-/- mice.</a> Atherosclerosis. 156 (1), 49-55 (2001).</li>
<li>Pynn, M., Schäfer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+training+reduces+neointimal+growth+and+stabilizes+vascular+lesions+developing+after+injury+in+apolipoprotein+e-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Exercise training reduces neointimal growth and stabilizes vascular lesions developing after injury in apolipoprotein e-deficient mice.</a> Circulation. 109 (3), 386-392 (2004).</li>
<li>Nakashima, Y., Plump, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ApoE-deficient+mice+develop+lesions+of+all+phases+of+atherosclerosis+throughout+the+arterial+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb%22%5BJournal%5D)">ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree.</a> Arterioscler. Thromb. 14 (1), 133-140 (1994).</li>
<li>Reddick, R. L., Zhang, S. H., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+in+mice+lacking+apo+E.+Evaluation+of+lesional+development+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis in mice lacking apo E. Evaluation of lesional development and progression.</a> Arterioscler. Thromb. 14 (1), 141-147 (1994).</li>
<li>Tangirala, R. K., Rubin, E. M., Palinski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+atherosclerosis+in+murine+models%3A+correlation+between+lesions+in+the+aortic+origin+and+in+the+entire+aorta%2C+and+differences+in+the+extent+of+lesions+between+sexes+in+LDL+receptor-deficient+and+apolipoprotein+E-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitation of atherosclerosis in murine models: correlation between lesions in the aortic origin and in the entire aorta, and differences in the extent of lesions between sexes in LDL receptor-deficient and apolipoprotein E-deficient mice.</a> J. Lipid Res. 36 (11), 2320-2328 (1995).</li>
<li>Paigen, B., Morrow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+atherosclerotic+lesions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice.</a> Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).</li>
<li>Baglione, J., Smith, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Assay+for+Mouse+Atherosclerosis+in+the+Aortic+Root%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative Assay for Mouse Atherosclerosis in the Aortic Root.</a> Methods in Molecular Medicine. 129, (2006).</li>
<li>Lee, T. Y., Muschal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiostatin+regulates+the+expression+of+antiangiogenic+and+proapoptotic+pathways+via+targeted+inhibition+of+mitochondrial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins.</a> Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).</li>
<li>Ballon, G., Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi+sarcoma+herpesvirus+%28KSHV%29+vFLIP+oncoprotein+induces+B+cell+transdifferentiation+and+tumorigenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Kaposi sarcoma herpesvirus (KSHV) vFLIP oncoprotein induces B cell transdifferentiation and tumorigenesis in mice.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1141-1153 (2011).</li>
<li>Khallou-Laschet, J., Varthaman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+in+experimental+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity in experimental atherosclerosis.</a> PLoS One. 5 (1), e8852(2010).</li>
<li>Rotzius, P., Thams, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+infiltration+of+neutrophils+in+lesion+shoulders+in+ApoE-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Distinct infiltration of neutrophils in lesion shoulders in ApoE-/- mice.</a> Am. J. Pathol. 177 (1), 493-500 (2010).</li>
<li>Kanellakis, P., Agrotis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-mobility+group+box+protein+1+neutralization+reduces+development+of+diet-induced+atherosclerosis+in+apolipoprotein+e-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-mobility group box protein 1 neutralization reduces development of diet-induced atherosclerosis in apolipoprotein e-deficient mice.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (2), 313-319 (2011).</li>
<li>Schwartz, C. J., Mitchell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+localization+of+arterial+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Observations on localization of arterial plaques.</a> Circ. Res. 11, 63-73 (1962).</li>
<li>Won, D., Zhu, S. N., Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+reduction+of+endothelial+nitric-oxide+synthase+expression+and+transcription+in+atherosclerosis-prone+regions+of+the+mouse+aorta+and+in+an+in+vitro+model+of+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow.</a> Am. J. Pathol. 171 (5), 1691-1704 (2007).</li>
<li>Rosenfeld, M. E., Polinsky, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+atherosclerotic+lesions+in+the+innominate+artery+of+the+ApoE+knockout+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Advanced atherosclerotic lesions in the innominate artery of the ApoE knockout mouse.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20 (12), 2587-2592 (2000).</li>
<li>McAteer, M. A., Schneider, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+3Dreconstruction+of+atherosclerotic+plaque+components+in+apolipoprotein+E+knockout+mice+using+ex+vivo+high-resolution+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantification and 3Dreconstruction of atherosclerotic plaque components in apolipoprotein E knockout mice using ex vivo high-resolution MRI.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (12), 2384-2390 (2004).</li>
<li>Martinez, H. G., Prajapati, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+in+cardiovascular+medicine%3A+Microscopiccomputedtomography-based+virtual+histology+for+visualization+and+morphometry+of+atherosclerosis+in+diabetic+apolipoprotein+e+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Images in cardiovascular medicine: Microscopiccomputedtomography-based virtual histology for visualization and morphometry of atherosclerosis in diabetic apolipoprotein e mutant mice.</a> Circulation. 120 (9), 821-822 (2009).</li>
<li>Kirkby, N. S., Low, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3-dimensional+imaging+of+murine+neointimal+and+atherosclerotic+lesions+by+optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3-dimensional imaging of murine neointimal and atherosclerotic lesions by optical projection tomography.</a> PLoS One. 6 (2), e16906(2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Atherosclerose is een complexe chronische ziekte van de grote spierarteries die een belangrijke onderliggende oorzaak is van myocardinfarct en beroerte. De progressie van de ziekte omvat de interactie van vele verschillende celtypen binnen de arteriële wand, met circulerende bloedcellen, lipoproteïne deeltjes en andere bloed-dragende factoren die we pas beginnen te begrijpen. Veel van onze huidige kennis over de ontwikkeling en progressie van atherosclerose is afkomstig uit studies die zijn uitgevoerd in speciaal ontworp...

In de afgelopen twee decennia hebben de ontwikkeling en het gebruik van atherosclerose-gevoelige muismodellen door middel van voedings- en/of genetische manipulatie onze kennis van de moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van atherosclerotische laesies aanzienlijk verbeterd1-3. Een groot deel van onze kennis en begrip van atherogenese komt uit studies die zijn uitgevoerd bij apolipoproteïne (Apo)-E-deficiënte4 muizen, waarbij atherosclerotische laesies spontaan ontwikkelen en bij lagedichtheids-lipoproteïne-receptor (LDLR)-deficiënte5 muizen, waarbij atherosclerose door voeding wordt veroorzaakt. Een belangrijk voordeel van deze modellen is dat ze de studie van relatief grote aantallen genetisch gedefinieerde dieren onder gecontroleerde voedings- en omgevingsomstandigheden mogelijk maken. Bovendien lijken de gevorderde atherosclerotische laesies die zich in sommige van deze muisstammen ontwikkelen sterk op die welke bij mensen worden waargenomen, met lipidengevulde necrotische kernen en fibreuze kapsels. Atherosclerose ontwikkelt zich snel in deze muismodellen, waardoor het zeer haalbaar is om de laesieontwikkeling, van vetstrepen tot gevorderde plaque, in kwestie van weken te bestuderen. Bovendien is aangetoond dat bekende risicofactoren voor hart- en vaatziekten bij mensen, waaronder diabetes6, dyslipidemie7, obesitas8, hypertensie9, sigarettenrook10 en een sedentaire omgeving11, de laesieontwikkeling verder versnellen.
In de meeste, zo niet alle atherosclerose-gevoelige muismodellen, kan laesieontwikkeling voor het eerst worden gedetecteerd in de aortasinus. Het tijdstip van begin hangt af van de muisstam en het dieet. Naarmate de laesies groter worden, hebben ze de neiging om omhoog te groeien in de opgaande aorta. Bij ApoE-/- en LDLR-/- muizen kan de verdere ontwikkeling van laesies worden gedetecteerd bij aortabifurcaties in de aortaboog, in de afdalende aorta en in andere grotere slagaders12-14. Dr. Beverly Paigen en collega's hebben, naast het ontwikkelen van enkele van de vroegste modellen van door voeding veroorzaakte atherosclerose, ook een assay ontwikkeld voor de kwantificering van atherosclerotische laesies in de aortasinus, die de standaard is geworden voor laesiemeting in muismodellen15. In de loop der jaren is deze techniek verfijnd en in detail beschreven16. Hier presenteren we een aangepaste versie van de "Paigen-methode" voor de kwantificering en karakterisering van atherosclerotische laesies bij een muis. De analyse van seriële aorta-dwarsdoorsneden uit een specifiek vaatgebied en in een gedefinieerde en vaste oriëntatie, vergemakkelijkt nauwkeurige gegevensverzameling en maakt nauwkeurige detectie van variaties in laesieontwikkeling in verschillende behandelingsgroepen mogelijk. De hier gepresenteerde methoden zijn gebaseerd op de vorige technieken. Specifiek beschrijven we hoe de karakterisering van laesies in termen van oppervlakte, volume, necrotisch en cellulair materiaal mogelijk is door de onderzoek van seriële secties met behulp van een combinatie van histochemie en immunohistochemie.

<table><tbody><tr><td>LDLR-deficient mice&nbsp;(D2.129S7(B6)-Ldlrtm1Her/J)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>stock #002207</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>Histology Molds</td><td>Ted Pella Inc</td><td>27195</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Paramat</td><td>19286-10</td><td></td></tr><tr><td>Coated slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Solvent containers</td><td>Tissue Tek II</td><td>4457</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM22S5</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>VWR</td><td>80086-982</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX41TF</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>www.rsbweb.nih.gov/ij/</td><td></td></tr><tr><td>Processor</td><td>Sakura Finetek</td><td>VIP6-A1</td><td></td></tr><tr><td>Processing cassettes</td><td>VWR</td><td>18000-134</td><td></td></tr><tr><td>Preassure Cooker</td><td>Nordic Ware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Microtome blade</td><td>Thermo Scientific</td><td>30-518-35</td><td></td></tr><tr><td>Antifade mounting medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-4680</td><td></td></tr><tr><td>Xylene mounting medium&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>Aquous mounting medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1161</td><td></td></tr><tr><td>Mac-3 anbody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553322</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab6640</td><td></td></tr><tr><td>Alpha actin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-32251</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&rsquo;s Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4382</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>DAB (3,3'-Diaminobenzidine)</td><td>Dako</td><td>K3468</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantitatieve analyse en karakterisering van atherosclerotische laesies in de muis aortasinus

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerose is een ziekte van de grote slagaders en een belangrijke onderliggende oorzaak van hartinfarct en beroerte. Er zijn verschillende muismodellen ontwikkeld om het onderzoek naar de moleculaire en cellulaire pathofysiologie van deze ziekte te vergemakkelijken. In dit manuscript beschrijven we specifieke technieken voor de kwantificering en karakterisering van atherosclerotische laesies in de muis aorta sinus en opgaande aorta. Het voordeel van deze procedure is dat het een nauwkeurige meting van de dwarsdoorsnede en het totale volume van de laesie biedt, die kan worden gebruikt om atherosclerotische progressie tussen verschillende behandelingsgroepen te vergelijken. Dit is mogelijk door gebruik te maken van de klepblaadjes als een anatomisch herkenningspunt, samen met een zorgvuldige aanpassing van de snijshoek. We beschrijven ook basiskleuringsmethoden die kunnen worden gebruikt om atherosclerotische progressie te beginnen te karakteriseren. Deze kunnen verder worden aangepast om antigenen van specifiek belang voor de onderzoeker te onderzoeken. De beschreven technieken zijn over het algemeen toepasbaar op een breed scala van bestaande en nieuw gecreëerde voedings- en genetisch-geïnduceerde modellen van atherogenese.

Vijf weken oude LDLR-/- muizen kregen gedurende tien weken een standaarddieet of een vetrijk dieet. De muizen werden geofferd en geperfuseerd met formaline zoals hierboven beschreven. Er werden dwarsdoorsneden van de aortasinus geprepareerd en gekleurd met hematoxyline en eosine om het oppervlak en het volume van de laesies te bepalen (Figuur 4). Wanneer muizen een standaardvoerdieet krijgen, is de atherosclerotische ontwikkeling zeer beperkt en mogelijk niet detecteerbaar op 15-weekse leeftijd. Een vet...

We beschrijven procedures om atherosclerotische laesies in muismodellen te kwantificeren en te karakteriseren door middel van nauwkeurig snijden van de aortasinus en de ascenderende aorta, gecombineerd met histochemische en immunohistochemische analyse.

Kwantitatieve analyse en karakterisering van atherosclerotische laesies in de muis aortasinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Het algemene doel van deze procedure is om atherosclerotische laesies in de aortasinus van het myocardinfarct (MI) te karakteriseren en te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst een uitgenomen hart te dissekeren om het apicale gedeelte te scheiden en de aortasinus te lokaliseren. Vervolgens worden er paraffineblokken gemaakt met het bewerkte apicale gedeelte van het hart.Vervolgens wordt de aortasinus doorsneden en op objectglazen gemonteerd. Ten slotte worden de weefselcoupes gekleurd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die door middel van histochemische en immunohistochemische analyse verschillende groottes en samenstellingen van atherosclerotische laesies aantonen.De procedure zal worden gedemonstreerd door Daniel Venga penal, een promovendus uit mijn laboratorium. De Animal Research Ethics Board van McMaster University heeft alle hierin beschreven procedures vooraf goedgekeurd. Na het anesthetiseren van een LDLR double negative muis en het afnemen van bloed, wordt het dier geëuthanaseerd en gefixeerd voordat het hart wordt geïsoleerd volgens het tekstprotocol. Gebruik een scalpel om een transversale snede in het hart te maken, loodrecht op de aorta ascendens. Plaats het apicale of bovenste gedeelte van het hart in een inbedcassette en dompel het onder in Formin.Plaats de cassette vervolgens in een weefselprocessor en proces deze gedurende de nacht. Smelt volgens het programma dat is beschreven in het tekstprotocol voor histologiemallen de paraffine gedurende de nacht bij 62 °C. Plaats elk geprocesseerd weefsel in een diepe histologiemal, waarbij u ervoor zorgt dat de interface van het hart de bodem van de mal raakt, en giet vervolgens gesmolten paraffine om de mal volledig te vullen.Gebruik een gelabelde plastic cassette om de mal af te dekken. Nadat de mallen op ijs of een koud oppervlak zijn afgekoeld, wordt het blok uit de mal gehaald om de aorta in coupes te snijden. Plaats het blok in de monsterhouder van de microtoom, zodat het van binnenuit naar de bovenkant van het hart kan worden gesneden.Stel de microtoom in op 10 microns en maak coupes van het hart. Verzamel de coupes op een glazen objectglas en bestudeer deze onder een lichtmicroscoop om de positie en oriëntatie te bepalen. De sinus moet zichtbaar zijn als drie bipartiete klepbasissen met daaraan bevestigde klepbladen.Wanneer één of twee kleppen van de aortasinus zichtbaar worden, pas dan de hoek van het blok naar behoefte aan. Zodra de kleppen zijn bereikt, stel de microtoom zo in dat er coupes van vier tot vijf micron worden gesneden. Monteer de eerste 10 coupes elk aan de bovenzijde van afzonderlijke glazen objectglazen, en monteer vervolgens elke volgende groep van 10 coupes op de volgende positie.Op de objectglazen. Ga door met het verzamelen van coupes totdat er geen atherosclerotische laesies meer worden waargenomen. Om de coupes met hematoxyline en eosine te kleuren om de laesies te visualiseren, plaatst u de objectglazen gedurende acht minuten in een luchtdroger.Deparaffinise vervolgens de secties door ze vier keer drie minuten lang te wassen met xyleen. Was de coupes drie keer drie minuten lang in 100% ethanol. Was daarna in 70% ethanol en 50% ethanol.Drie keer gedurende drie minuten per keer. Gebruik gedestilleerd water om de objectglaasjes te spoelen en dompel ze vervolgens gedurende 15 minuten onder in hematine van MA.Was en spoel met kraanwater gedurende vijf minuten. Was vervolgens met gedestilleerd water gedurende vijf minuten na het onderdompelen in eosine Y voor één tot vijf minuten.Was drie keer gedurende vijf minuten met gedestilleerd water. Was twee keer gedurende twee minuten met 50% ethanol. Was vervolgens drie keer gedurende twee minuten met 70% ethanol, gevolgd door 100% ethanol.Drie keer gedurende twee minuten elk. Was daarna vier keer gedurende twee minuten elk met xyleen. Gebruik een op xyleen gebaseerd montagemedium om de coupes te monteren en leg beelden vast met een lichtmicroscoop.Gebruik beeldbewerkingssoftware om laesies te identificeren en te kwantificeren, wat bepaald kan worden op specifieke afstanden vanaf de aortasinus met intervallen van 40 tot 50 micron, afhankelijk van de dikte van de coupes; raadpleeg het tekstprotocol voor immunohistochemische en immunofluorescentiekleuring. Vijf weken oude LDLR. Positive muizen kregen een standaarddieet of een vetrijk dieet gedurende 10 weken voordat hun harten werden gefixeerd, geïsoleerd en gesneden zoals hier wordt getoond.Wanneer muizen een standaardchowdieet krijgen, is de ontwikkeling van atherosclerose zeer beperkt en mogelijk niet detecteerbaar op 15-weekse leeftijd. Een vetrijk dieet versnelt de atherogenese in dit model aanzienlijk en induceert de vorming van grote, gevorderde laesies met chronische acellulaire kernen en fibreuze kappen. Atherosclerotische laesies kunnen verder worden gekarakteriseerd door kleuringen voor de aanwezigheid van specifieke celtypen en factoren die stadia van laesieontwikkeling definiëren.Monocyteninfiltratie in de intima vormt een van de vroegste gebeurtenissen bij atherogenese van de intima. Monocyten differentiëren tot macrofagen die cellulair debris en lipiden opnemen. Lipiderijke macrofagen, bekend als schuimcellen, vormen een vette streep in de arteriewand, zoals hier te zien is.Macrofaag-schuimcellen kunnen in alle stadia van laesieontwikkeling worden aangetroffen door kleuring met antilichamen tegen specifieke macrofaagmarkers zoals F4/80 en MAC3. Vasculaire gladde spiercellen of vSMC's zijn beperkt tot de mediale laag van een gezonde slagader. vSMC's worden gestimuleerd om te migreren en te prolifereren in de intima tijdens de ontwikkeling van een gevorderde laesie.Zoals in dit paneel te zien is, kunnen V SMC's worden geïdentificeerd door kleuring met een antilichaam tegen alpha actin na de ontwikkeling. Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van cardiovasculaire ziekten om de ontwikkeling en progressie van atherosclerotische laesies in knaagdieren te bestuderen.

quantitative-analysis-characterization-atherosclerotic-lesions-murine

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Ex vivo analyse van arteriële laesies uit diermodellen van hart- en vaatziekten is klassiek gebaseerd op histologische en immunohistochemische technieken. Deze bieden 2-dimensionale metingen in 3-dimensionale laesies. Dit manuscript beschrijft de generatie van arteriële laesies voor kwantitatieve analyse in 3-dimensies met behulp van optische projectietomografie.

Generatie en 3-dimensionale kwantificering van arteriële laesies in Muizen met behulp van optische projectie Tomografie

Deze video toont twee modellen van intima plaque ontwikkeling in muizen slagaders en benadrukt de verschillen in myointimal hyperplasie en atherosclerose.

Inducerende Myointimal Hyperplasie Versus atherosclerose in Muizen: Een inleiding van twee geldige Models

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methodologie van het gebruik van een radiopaak loodhoudende silicone rubber te perfuse de lymfkliertest therapieën voor de diameter van de aorta kwantificering in een muismodel van aorta aneurysma en dissectie.

Kwantitatieve analyse van de Micro-CT van Aortopathy in een muismodel van β-aminopropionitrile-geïnduceerde aorta aneurysma en dissectie

We beschrijven een protocol om atherosclerose in de aorta hoofdmap van ApoE- / - muizen gevoed met een atherogene dieet, door middel van een continu release van aldosteron. Methoden voor het karakteriseren van de samenstelling van de plaque worden ook beschreven.

Inductie van atherosclerotische Plaques door activering van Mineralocorticoïden receptoren in apolipoproteïne E-deficiënte muizen

Wij stellen voor een gestandaardiseerde protocol karakteriseren de cellulaire samenstelling van laat-stadium lymfkliertest atherosclerotische laesies met inbegrip van systematische methoden voor dierlijke dissectie, weefsel insluiten, afdelen, kleuring en analyse van brachiocephalic slagaders van atheroprone gladde spieren cel lineage tracering muizen.

Kwantitatieve analyse van cellulaire samenstelling in geavanceerde atherosclerotische laesies van de gladde spieren cel Lineage-Tracing muizen

Murine modellen van atherosclerose zijn nuttige instrumenten om te onderzoeken van pathogene trajecten op moleculair niveau, maar vereisen gestandaardiseerde kwantificering van de ontwikkeling van de laesie. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te bepalen van de laesie grootte in de grote arteriële vaten, met inbegrip van de aorta wortel, aortaboog, en brachiocephalische slagader.

Kwantificering van atherosclerose bij muizen

Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure om atherosclerotische belasting bij muizen te analyseren. Onderzoekers kunnen dit protocol gebruiken om de overvloed, locatie en grootte van atherosclerotische laesies bij verschillende dieren te vergelijken.

Beeldvorming en analyse van olierode O-gekleurde hele aortalaesies in een aneurysma hyperlipidemie muismodel

Hier presenteren we geoptimaliseerde weefselopruimingsprotocollen om de muizenaorta in drie dimensies (3D) in beeld te brengen. We schetsen state-of-the-art procedures voor immunokleuring, optische klaring en beeldvorming met de bedoeling om de anatomische nabijheid van het perifere zenuwstelsel met atherosclerotische plaques en de adventitia bij atherosclerose te definiëren.

Driedimensionale beeldvorming van aortaweefsels bij atherosclerose

Dit protocol biedt een uitgebreide methodologie voor de kwantitatieve analyse van atherosclerotische plaques om meer diepgaand onderzoek naar de mechanismen en progressie van atherosclerose mogelijk te maken.

Isolatie en analyse van aortaboog- en wortellaesies in een atherosclerotisch muismodel

Advances in massaspectrometrie toestemming hebben high throughput analyse van eiwitexpressie en modificatie in een groot aantal weefsels. Gecombineerd met subcellulaire fractionering en ziektemodellen, kwantitatieve massaspectrometrie en bioinformatica nieuwe eigenschappen kunnen onthullen in biologische systemen. De werkwijze hierin beschreven analyseert chromatine-geassocieerde eiwitten in de vaststelling van hart-en vaatziekten en is gemakkelijk toepasbaar op...

Kwantitatieve analyse van chromatine proteomen in de ziekte van

Leer hoe u atherosclerotische laesies in muizen kwantitatief analyseert met histochemische en immunohistochemische technieken. Deze methode ondersteunt cardiovasculair onderzoek naar ziekteontwikkeling.

Kwantitatieve analyse en karakterisering van atherosclerotische laesies in de muis aortasinus

Meer video's verkennen