Verbeterde werkwijze voor de bereiding van een Human-Cell gebaseerde, Contact Model van de bloed-hersenbarrière

Deze procedure beoogt een in vitro simulatie van de bloed-hersenbarrière door middel van co-cultivering van astrocyten en endotheelcellen aan weerszijden van een poreus membraan. Coat eerst het luminale oppervlak van het poreuze membraan met een extracellulaire matrix. Proteïnen zoals collageen passen de omgekeerde insert met een externe siliconen slang en een interne siliconen plug om een verwijderbare put boven het abluminale oppervlak van het membraan te creëren.

Zaai nu de astrocytcellen op de omgekeerde insert, zodat ze hechten aan het abluminale oppervlak. Verwijder vervolgens de slang en plaats de insert in de normale oriëntatie in een met medium gevulde well. Zaai daarna de endotheelcellen in het luminale compartiment van de insert en kweek deze samen met de tegenoverliggende astrocyten.

Uiteindelijk wordt de passage van fluorescente tracers of de registratie van de trans-endotheliale elektrische weerstand gebruikt om permeabiliteitsveranderingen in de in vitro BBB te meten als reactie op verschillende stimulerende agentia. Deze procedure wordt gedemonstreerd door Mr. Barry Nigo, een postdoc in mijn laboratorium, die tijdens zijn PhD dit aangepaste zaaiprotocol heeft ontwikkeld dat wij hebben gebruikt om de bloed-hersenbarrière te simuleren. We kregen het idee voor deze procedure nadat we minder verfijnde zaaimethoden hadden getest en veel frustratie hadden ervaren door lekkage van medium via de poriën, evenals door kleine mediumvolumes.

Dit leidde tot korte en onvoldoende perioden voor de aanhechting van astrocyten, wat we in onze procedure proberen aan te pakken. Plaats de weefkweekinserts in de wells van een 24-wellplaat. Voeg vervolgens 50 µL rattencollageen I met een concentratie van 132 µg/mL toe om het luminale oppervlak van de inserts te coaten, incubeer dit gedurende de nacht in een bevochtigde incubator bij 37 °C om eventueel resterend zuur te verwijderen, en was zowel de abluminale als de luminale zijden van de inserts met dubbel gedestilleerd water.

Keer de inserts vervolgens om en plaats voorzichtig een kort stuk elastische siliconen slang rond de rand van het poreuze membraan. Hiermee wordt in feite een nieuwe well boven het abluminale oppervlak gecreëerd om de onderzijde af te dichten.

Bereid een plug voor van siliconen slang die aan één uiteinde is afgesloten met de afgesneden tip van een 0,2 milliliter PCR-buisje. Plaats nu met een steriele pincet de siliconen plug in de luminale holte en schuif deze door tot deze zich op ongeveer één tot twee millimeter van het membraan bevindt. Zaai vervolgens 40.000 astrocyten in 200 microliters van hun onderhoudsmedium direct in de siliconen put boven het abluminale membraanoppervlak.

Om de adhesiestatus van de astrocyten te monitoren, wordt een standaard 96-wells plaat gebruikt, aangezien deze hetzelfde oppervlak heeft als de 6,5 millimeter insert en een eenvoudigere visualisatie van de cellen via fasecontrastmicroscopie mogelijk maakt. Zaai een identiek volume van de astrocyten-celсусpensie in de 96-wells plaat. Dit wordt in de loop van de tijd gemonitord om te bepalen wanneer de astrocyten in de 96-wells plaat, en bij uitbreiding in het insertmembraan, voldoende zijn gehecht om de steriliteit te waarborgen.

Transporteer de geassembleerde inserts tussen twee zeswellsplaten om blootstelling aan ongefilterde lucht te minimaliseren. Plaats de cellen in de incubator om de astrocyten te laten hechten. Plaats op dit moment ook de controle 96-wellsplaat in de incubator.

Controleer na ongeveer vier uur de controle-96-well om te zien of de astrocyten zijn gehecht. Zo ja, breng dan de insert-assemblage terug naar de weefselkweekkap. Verwijder voorzichtig de externe siliconen slang en de dopjes.

Plaats de inserts vervolgens in de normale rechtopstaande positie terug in wells die elk 800 µL endotheliaal celonderhoudsmedium bevatten. Zaai 20.000 hersenendotheelcellen in 200 µL op het collageen-gecoate luminale oppervlak en co-cultiveer deze gedurende drie dagen in BEC-medium zonder mediumverversing vóór de experimenten.

Was de siliconen buisjes en doppen in ethanol voordat ze worden geautoclaveerd voor later gebruik. Om de in vitro bloed-hersenbarrière te stimuleren, vervangt u eerst de abluminale en luminale media respectievelijk door 600 µL en 100 µL serumvrij BECS-medium. Aspireer de luminale spoeling en vervang deze door 100 µL serumvrij medium dat stimulerende middelen bevat.

Indien de in vitro BBB wordt geïnduceerd vanuit het astrocytaire compartiment, aspireer dan het abluminale medium en vervang dit door 600 µL serumvrij medium dat stimulerende agentia bevat. Ga verder met de standaard paracellulaire of transcellulaire permeabiliteitsassays van de labeltracers om een humaan contact bloed-hersenbarrière-model te vestigen. Geïmmortaliseerde humane astrocyten en hersenendotheelcellen worden gekweekt op poreuze membranen van drie micron die de passage van astrocytenvoetjes mogelijk maken voor contact met endotheelcellen.

De methode maakte een optimale, ononderbroken zaaiperiode van astrocyten en bec's mogelijk, die op hun beurt sterk hechten aan het poreuze oppervlak met minimaal celverlies en binnen drie dagen na het zaaien co-confluentie bereiken. Beide celtypen behouden hun celspecifieke markers op poreuze membranen, zoals aangegeven door de expressiepatronen van glial fibrillary acidic protein GFAP in SVGs en von Willebrand factor VWF in NECs.

In overeenstemming met het meest fundamentele kenmerk van een contact-BBB-model kan de astrocytaire NFE door de poriën van drie micron naar het luminale compartiment passeren. Contact kan dus potentieel bestaan tussen SVG's en BES die op poriën van deze afmeting zijn geplaatst. Bovendien geeft de SEM-beeldvorming aan dat SVG's en BBC's in staat waren om direct over de membraanporiën te groeien, een fenomeen dat op kunstmatige wijze bijdraagt aan de fysieke barrièrefunctie van in vitro BBB-contactmodellen.

In deze studie wordt het menselijke contact-BBB-model gebruikt om het effect van het fibrinolytische middel TPA op de BBB te onderzoeken. Deze in vitro studies bevestigen dat TPA inderdaad de permeabiliteit van de intacte BBB verhoogde op een concentratie- en tijdsafhankelijke wijze, beide binnen een farmacologisch relevant bereik. Drastische morfologische veranderingen van SVG-astrocyten zijn zichtbaar op de poreuze membranen na blootstelling aan TPA, wat suggereert dat de astrocytaire respons op TPA ten grondslag ligt aan de TPA-geïnduceerde opening van de BBB.

Deze methode speelde een sleutelrol in ons onderzoek, dat tot doel had te onderzoeken hoe de bloed-hersenbarrière reageert op het trombolytische middel TPAA, dat bij berotepatiënten wordt gebruikt om bloedstolsels op te lossen. Dit is de eerste demonstratie van deze methode in de literatuur, en we hopen dat andere onderzoekers deze voor hun eigen doeleinden kunnen adopteren.