Verbeterde werkwijze voor de bereiding van een Human-Cell gebaseerde, Contact Model van de bloed-hersenbarrière

Deze procedure streeft naar een in vitro simulatie van de bloed-hersenbarrière door het co-cultiveren van astrocyten en endotheelcellen aan weerszijden van een poreuze membraan. Bekleed eerst het luminale oppervlak van het poreuze membraan met een extracellulaire matrix. Bevestig het omgekeerde insert met een externe siliconen slang en een interne siliconen plug om een verwijderbaar wel boven het abluminale oppervlak van het membraan te creëren.

Zaai vervolgens de astrocytcellen op het omgekeerde insert zodat ze zich hechten aan het abluminale oppervlak. Verwijder vervolgens de slang en plaats het insert in zijn normale oriëntatie in een met medium gevuld wel. Zaai vervolgens de endotheelcellen in het luminale compartiment van het insert en co-cultiveer met de tegenoverliggende astrocyten.

Uiteindelijk wordt de doorgang van fluorescente tracers of de registratie van trans-endotheliële elektrische weerstand gebruikt om permeabiliteitsveranderingen in de in vitro BBB te meten in reactie op verschillende stimulerende agentia. Het demonstreren van deze procedure zal worden gedaan door Mr. Barry Nigo, een postdoc in mijn laboratorium, die tijdens zijn promotie deze gemodificeerde zaaiprotocolen ontwikkelde die we hebben gebruikt om de bloed-hersenbarrière te simuleren. We hadden eerst een idee van deze procedure na het testen van meer grove zitmethoden en met veel frustratie met lekkage van medium door de pauze, evenals kleine mediumvolumes.

Dit dicteerde een korte en onvoldoende zitperiode voor astrocyten, die we proberen aan te pakken in onze procedure. Plaats de weefselkweekinserts in de putjes van een 24-welplate. Voeg vervolgens 50 microliter van 132 microgram per milliliter rattencollageen toe, één om het luminale oppervlak van de inserts te bekleden, en incubeer een nacht in een bevochtigde 37 graden Celsius incubator om eventuele restzuur te verwijderen, was zowel de abluminale als luminale zijden van de inserts met tweemaal gedistilleerd water.

Keer vervolgens de inserts om en plaats voorzichtig een kort stuk elastisch siliconenslang rond de rand van het poreuze membraan. Dit creëert in wezen een nieuw wel boven het abluminale oppervlak. Om de onderkant te verzegelen.

Maak een plug van siliconenslang aan één kant verzegeld met de afgesneden punt van een 0,2 milliliter PCR-buis. Plaats nu met een steriele pincet de siliconenplug in de luminale holte en breng deze vooruit tot hij zich ongeveer een tot twee millimeter van het membraan bevindt. Zaai vervolgens 40.000 astrocyten in 200 microliter van hun onderhoudsmedium direct in het siliconenwel boven het abluminale membraanoppervlak.

Gebruik een standaard 96-welplate om de hechtingstoestand van de astrocyten te controleren, aangezien deze dezelfde oppervlakte heeft als de 6,5 millimeter insert en gemakkelijker visualisatie van cellen mogelijk maakt door fasecontrastmicroscopie. Zaai een identiek volume van de astrocytcelsuspensie in de 96-welplate acht. Dit zal worden gemonitord om te bepalen wanneer de astrocyten in de 96-wel en door verlenging in de insertmembraan voldoende hechten om de steriliteit te behouden.

Vervoer de geassembleerde inserts tussen twee zes-welplaten om de blootstelling aan ongefilterde lucht te minimaliseren. Plaats de cellen in de incubator om de astrocyten te laten hechten. Plaats ook de controle 96 Well plate op dit moment in de incubator.

Controleer na ongeveer vier uur de controle 96-wel om te zien of de astrocyten zich hebben gehecht. Als dat zo is, breng dan de insertsamenstelling terug naar de weefselkweekkap. Verwijder voorzichtig de externe siliconenslang en pluggen.

Breng vervolgens de inserts terug in de normale rechtopstaande oriëntatie in wel bevattend 800 microliter per wel van endotheelcel onderhoudsmedium. Zie 20.000 hersenendotheelcellen in 200 microliter op het met collageen beklede luminale oppervlak co-cultiveer gedurende drie dagen in BEC-medium zonder enige mediumverandering. Voor experimenten.

Was de siliconenbuizen en pluggen in ethanol voor het autoclaven voor later gebruik. Om de in vitro bloed-hersenbarrière te stimuleren, vervangt u eerst het abluminale en luminale medium met respectievelijk 600 microliter en 100 microliter serumvrij becs-medium. Aspibeer het luminale was en vervang het met 100 microliter serumvrij medium bevattend stimulerende agentia.

Als u de in vitro BBB induceert vanuit het astrocytische compartiment, aspibeer dan het abluminale medium en vervang het met 600 microliter serumvrij medium. Medium bevattend stimulerende agentia gaat verder met de standaard paracellulaire of transcellulaire permeabiliteitstests van de labeltracers om een menselijk contact bloed-hersenbarrièremodel te vestigen. Menselijk geïmmortaliseerde astrocyten en herseneendotheelcellen worden gekweekt op drie micron poreuze membranen die doorgang van astrocyten en voeten mogelijk maken voor contact met endotheelcellen.

Consistent met het meest fundamentele kenmerk van een contact BBB-model, kunnen de astrocytische NFE's door de drie micron poriën in het luminale compartiment passeren. Dus contact kan potentieel bestaan tussen SVG's en BES gezeten op poriën van deze dimensie. Bovendien geeft de SEM-beelden aan dat SVG's en BBC's in staat waren om direct over de membraanporiën te groeien, een fenomeen dat kunstmatig bijdraagt aan de fysieke barrièrefunctie van in vitro BBB-contactmodellen.

In deze studie wordt het menselijke contact BBB-model gebruikt om het effect van TPAA-fibrinolytisch middel op de BBB te onderzoeken. Deze in vitro-studies bevestigen dat TPA inderdaad de permeabiliteit van de intacte BBB verhoogde op een concentratie- en tijdsafhankelijke manier, die beide binnen een farmacologisch relevant bereik waren. Dramatische morfologische veranderingen van SVG-astrocyten zijn duidelijk zichtbaar op de poreuze membranen na blootstelling aan TPA, wat suggereert dat astrocytreactie op TPA ten grondslag ligt aan TPA-geïnduceerde BBB-opening.

Deze methode speelde een sleutelrol in ons onderzoek, dat zich richtte op het onderzoeken hoe de bloed-hersenbarrière reageert op TPAA-trombolytisch middel dat wordt gebruikt bij beroertepatiënten om bloedstolsels op te lossen. Het is de eerste demonstratie van deze methode in de literatuur, en we hopen dat andere onderzoekers het voor hun