Vorming van Bestelde Biomoleculaire structuren door de zelf-assemblage van korte peptiden

Het algemene doel van deze procedure is om op peptide gebaseerde assemblages te genereren in de vorm van biomoleculaire kettingen. Dit wordt bereikt door eerst voorraadoplossingen te bereiden door het oplossen van Difenyl alanine en zijn Bach-beschermde analoog afzonderlijk in de juiste hoeveelheid HFP tot een uiteindelijke concentratie van 100 milligram per milliliter. De tweede stap is om de peptidoplossingen in een vijf tot drie verhouding te mengen door 10 microliters van de Difenyl alanine peptidoplossing te mengen met zes microliters van de Bach-beschermde Difenyl alanine peptidoplossing.

Vervolgens wordt de gemengde peptidoplossing toegevoegd aan vers bereid 50% ethanol om een uiteindelijke concentratie van vijf milligram per milliliter difenyl alanine en drie milligram per milliliter voor Bach-beschermde difenyl alanine te geven. Uiteindelijk wordt scanning elektronenmicroscopie gebruikt om de door de twee peptiden samengestelde biomoleculaire kettingen te tonen. Het grote voordeel van het gebruik van zelfassemblageprocessen zoals de hier gedemonstreerde, is dat door spontane progressie het mogelijk is om complexe structuren te genereren.

In vitro vertegenwoordigt hier de zelfassemblage van peptide, specifiek de co-assemblage van Dipeptiden. Deze procedure zal worden uitgevoerd door Nuran, een afgestudeerde student uit het vorige laboratorium. Om te beginnen met de procedure voor de zelfassemblage van Difenyl alanine in buisvormige structuren, bereid 100 milligram per milliliter peptidoplossing voor door Difenyl alanine peptide op te lossen in HFP. Om de homogeniteit van de oplossing te garanderen, meng het een paar seconden met een vortexmixer en zet het een paar minuten op de werktafel totdat het peptide volledig is opgelost en de oplossing helder is.

Verdun de peptidoplossing tot een uiteindelijke concentratie van twee milligram per milliliter in driemaal gedistilleerd water. Bewaar de oplossing gedurende 24 uur op kamertemperatuur. Voor de co-assemblageprocedure, los afzonderlijk twee milligram difenyl alanine peptide en één milligram Bach-beschermd difenyl alanine peptide op in HFP tot een concentratie van 100 milligram per milliliter.

Meng vervolgens de oplossingen een paar seconden met een vortexmixer en zet ze een paar minuten op de werktafel totdat de peptiden volledig zijn opgelost en de oplossingen helder zijn. Meng de peptidoplossingen in een vijf tot drie verhouding door 10 microliters van de Difenyl alanine peptidoplossing te mengen met zes microliters van de Bach-beschermde difenyl alanine peptidoplossing. Meng vervolgens de oplossing met een vortexmixer.

Voeg vervolgens acht microliters van de gemengde peptidoplossing toe aan 92 microliters vers bereid 50% ethanol om een uiteindelijke concentratie van vijf milligram per milliliter voor difenyl alanine te krijgen, en drie milligram per milliliter. Voor Bach-beschermde difenyl alanine. Gebruik een pipette om de oplossing voorzichtig te mengen.

Na 24 uur incubatie op kamertemperatuur, breng een druppel van 10 microliter van de peptidoplossing aan op een glazen deksel en laat deze op kamertemperatuur drogen. Bedek het monster op het glazen deksel met een dunne laag goud met behulp van een sputter coter gedurende 90 seconden. Wanneer u klaar bent, beeldt u de assemblages af met SEM die werkt op 10 tot 20 kilovolts.

Voor TEM-analyse, plaats een druppel van 10 microliter peptidoplossing op een 200 mesh koperrooster bedekt met koolstof en gestabiliseerd door een polymeerfilmondersteuning. Verwijder na een minuut het overtollige vocht met behulp van filterpapier. Vervolgens brengt u een 2% urinal azijnzuuroplossing over in een spuit en filtert u deze met behulp van een nulpunt 22 micrometer filtereenheid.

Om in het monster te blijven, plaats u een druppel van 10 microliter urinal azijnzuuroplossing op het rooster. Verwijder na 30 seconden overtollig vocht met behulp van filterpapier en beeld het monster op het raster af met TEM die werkt op 120 kilovolts. Voor FTIR-analyse, breng een druppel van 30 microliter van de peptidoplossing aan op een calciumfluoride venster.

Laat de oplossing drogen op kamertemperatuur om het watersignaal in het FTIR-spectrum te onderdrukken. Plaats een druppel deuteriumoxide op het droge peptidemonster. Na het drogen van het monster in een drooggekoelde onder vacuüm, herhaalt u de vorige stappen twee keer om een maximale waterstof-deuterium uitwisseling te garanderen.

Ten slotte, neemt u de FTIR-spectra op met behulp van een gedeutereerd triglycinesulfaatdetector. Bepaal de minimale transmissiewaarden met behulp van de software die bij het instrument wordt geleverd om de vorming van geordende structuren door zelfassemblage van peptiden aan te tonen. De co-assemblage van twee eenvoudige aromatische peptiden werd bereid en gekarakteriseerd met behulp van SEM en TEM-analyse.

De gemengde peptiden vormden een architectuur van sferische assemblages met een diameter van enkele micrometers verbonden door langwerpige structuren met een diameter van enkele honderden nanometers vanwege de grote gelijkenis in morfologie met zijn snaren. Deze structuren worden moleculaire kettingen genoemd. Een FM-analyse van deze structuren toont duidelijk hun driedimensionale rangschikking.

Bovendien geeft SEM-analyse van verschillende regio's van verschillende monsters aan dat dit proces met hoge opbrengst plaatsvond. FTIR-analyse geeft informatie over de secundaire structuur van de peptidassemblages. Het absorberende spectrum van de amide.

Eén band van de sferische assemblages gevormd door het Bach-beschermde difenyl alanine peptide in ethanol vertoonde een enkele amidepiek bij 1.657 reciproke centimeters, wat wijst op een alfa-helix bevestiging. De buisvormige structuren gevormd door het difenyl alanine peptide in ethanol vertoonden twee duidelijke pieken bij 1.613 reciproke centimeters en 1.682 reciproke centimeters, die correleren met een bèta-veer secundaire structuur. Het FTIR-spectrum van de biomoleculaire kettingen gevormd door de co-assemblage van de twee peptiden verschilde van de piektoewijzing voor elk individueel peptide.

De eerste piek bij 1.653 reciproke centimeters komt overeen met een alfa-helix structuur en de tweede piek bij 1.684 reciproke centimeters heeft betrekking op een bèta-bocht bevestiging. Het