Vorming van Bestelde Biomoleculaire structuren door de zelf-assemblage van korte peptiden
November 21st, 2013
Dit document beschrijft de vorming van sterk geordende peptide-gebaseerde structuren door het spontane proces van zelfassemblage. De werkwijze maakt gebruik van commercieel verkrijgbare peptiden en gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur. Deze techniek kan worden toegepast op een grote verscheidenheid aan peptiden en kan leiden tot de ontdekking van nieuwe peptiden gebaseerde samenstellingen.
Het algemene doel van deze procedure is om op peptide gebaseerde assemblages te genereren in de vorm van biomoleculaire kettingen. Dit wordt bereikt door eerst voorraadoplossingen te bereiden door het oplossen van Difenyl alanine en zijn Bach-beschermde analoog afzonderlijk in de juiste hoeveelheid HFP tot een uiteindelijke concentratie van 100 milligram per milliliter. De tweede stap is om de peptidoplossingen in een vijf tot drie verhouding te mengen door 10 microliters van de Difenyl alanine peptidoplossing te mengen met zes microliters van de Bach-beschermde Difenyl alanine peptidoplossing.
Vervolgens wordt de gemengde peptidoplossing toegevoegd aan vers bereid 50% ethanol om een uiteindelijke concentratie van vijf milligram per milliliter difenyl alanine en drie milligram per milliliter voor Bach-beschermde difenyl alanine te geven. Uiteindelijk wordt scanning elektronenmicroscopie gebruikt om de door de twee peptiden samengestelde biomoleculaire kettingen te tonen. Het grote voordeel van het gebruik van zelfassemblageprocessen zoals de hier gedemonstreerde, is dat door spontane progressie het mogelijk is om complexe structuren te genereren.
In vitro vertegenwoordigt hier de zelfassemblage van peptide, specifiek de co-assemblage van Dipeptiden. Deze procedure zal worden uitgevoerd door Nuran, een afgestudeerde student uit het vorige laboratorium. Om te beginnen met de procedure voor de zelfassemblage van Difenyl alanine in buisvormige structuren, bereid 100 milligram per milliliter peptidoplossing voor door Difenyl alanine peptide op te lossen in HFP. Om de homogeniteit van de oplossing te garanderen, meng het een paar seconden met een vortexmixer en zet het een paar minuten op de werktafel totdat het peptide volledig is opgelost en de oplossing helder is.
Verdun de peptidoplossing tot een uiteindelijke concentratie van twee milligram per milliliter in driemaal gedistilleerd water. Bewaar de oplossing gedurende 24 uur op kamertemperatuur. Voor de co-assemblageprocedure, los afzonderlijk twee milligram difenyl alanine peptide en één milligram Bach-beschermd difenyl alanine peptide op in HFP tot een concentratie van 100 milligram per milliliter.
Meng vervolgens de oplossingen een paar seconden met een vortexmixer en zet ze een paar minuten op de werktafel totdat de peptiden volledig zijn opgelost en de oplossingen helder zijn. Meng de peptidoplossingen in een vijf tot drie verhouding door 10 microliters van de Difenyl alanine peptidoplossing te mengen met zes microliters van de Bach-beschermde difenyl alanine peptidoplossing. Meng vervolgens de oplossing met een vortexmixer.
Voeg vervolgens acht microliters van de gemengde peptidoplossing toe aan 92 microliters vers bereid 50% ethanol om een uiteindelijke concentratie van vijf milligram per milliliter voor difenyl alanine te krijgen, en drie milligram per milliliter. Voor Bach-beschermde difenyl alanine. Gebruik een pipette om de oplossing voorzichtig te mengen.
Na 24 uur incubatie op kamertemperatuur, breng een druppel van 10 microliter van de peptidoplossing aan op een glazen deksel en laat deze op kamertemperatuur drogen. Bedek het monster op het glazen deksel met een dunne laag goud met behulp van een sputter coter gedurende 90 seconden. Wanneer u klaar bent, beeldt u de assemblages af met SEM die werkt op 10 tot 20 kilovolts.
Voor TEM-analyse, plaats een druppel van 10 microliter peptidoplossing op een 200 mesh koperrooster bedekt met koolstof en gestabiliseerd door een polymeerfilmondersteuning. Verwijder na een minuut het overtollige vocht met behulp van filterpapier. Vervolgens brengt u een 2% urinal azijnzuuroplossing over in een spuit en filtert u deze met behulp van een nulpunt 22 micrometer filtereenheid.
Om in het monster te blijven, plaats u een druppel van 10 microliter urinal azijnzuuroplossing op het rooster. Verwijder na 30 seconden overtollig vocht met behulp van filterpapier en beeld het monster op het raster af met TEM die werkt op 120 kilovolts. Voor FTIR-analyse, breng een druppel van 30 microliter van de peptidoplossing aan op een calciumfluoride venster.
Laat de oplossing drogen op kamertemperatuur om het watersignaal in het FTIR-spectrum te onderdrukken. Plaats een druppel deuteriumoxide op het droge peptidemonster. Na het drogen van het monster in een drooggekoelde onder vacuüm, herhaalt u de vorige stappen twee keer om een maximale waterstof-deuterium uitwisseling te garanderen.
Ten slotte, neemt u de FTIR-spectra op met behulp van een gedeutereerd triglycinesulfaatdetector. Bepaal de minimale transmissiewaarden met behulp van de software die bij het instrument wordt geleverd om de vorming van geordende structuren door zelfassemblage van peptiden aan te tonen. De co-assemblage van twee eenvoudige aromatische peptiden werd bereid en gekarakteriseerd met behulp van SEM en TEM-analyse.
De gemengde peptiden vormden een architectuur van sferische assemblages met een diameter van enkele micrometers verbonden door langwerpige structuren met een diameter van enkele honderden nanometers vanwege de grote gelijkenis in morfologie met zijn snaren. Deze structuren worden moleculaire kettingen genoemd. Een FM-analyse van deze structuren toont duidelijk hun driedimensionale rangschikking.
Bovendien geeft SEM-analyse van verschillende regio's van verschillende monsters aan dat dit proces met hoge opbrengst plaatsvond. FTIR-analyse geeft informatie over de secundaire structuur van de peptidassemblages. Het absorberende spectrum van de amide.
Eén band van de sferische assemblages gevormd door het Bach-beschermde difenyl alanine peptide in ethanol vertoonde een enkele amidepiek bij 1.657 reciproke centimeters, wat wijst op een alfa-helix bevestiging. De buisvormige structuren gevormd door het difenyl alanine peptide in ethanol vertoonden twee duidelijke pieken bij 1.613 reciproke centimeters en 1.682 reciproke centimeters, die correleren met een bèta-veer secundaire structuur. Het FTIR-spectrum van de biomoleculaire kettingen gevormd door de co-assemblage van de twee peptiden verschilde van de piektoewijzing voor elk individueel peptide.
De eerste piek bij 1.653 reciproke centimeters komt overeen met een alfa-helix structuur en de tweede piek bij 1.684 reciproke centimeters heeft betrekking op een bèta-bocht bevestiging. Het
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie richt zich op de zelfassemblage van op peptiden gebaseerde structuren, specifiek biomoleculaire kettingen, met behulp van commercieel verkrijgbare peptiden. De methode is eenvoudig en kan leiden tot de ontdekking van nieuwe peptide-assemblages.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Structurele biologie
- Peptidechemie
Achtergrond
- Zelfassemblage is een spontaan proces dat complexe structuren kan creëren.
- Peptiden kunnen onder specifieke omstandigheden geordende structuren vormen.
- Het gebruik van gangbare laboratoriumapparatuur maakt deze methode toegankelijk.
- De studie onderzoekt het potentieel van verschillende peptiden in de vorming van assemblages.
Doel van de studie
- Om peptide-gebaseerde assemblages in de vorm van biomoleculaire kettingen te genereren.
- Om een methode te demonstreren voor het creëren van complexe structuren door middel van zelfassemblage.
- Om het gebruik van commercieel verkrijgbare peptiden in dit proces te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van stockoplossingen van Difenyl alanine en zijn Bach-beschermde analoog.
- Mengen van peptide stockoplossingen in een specifiek verhouding.
- Toevoegen van de gemengde oplossing aan ethanol om de gewenste concentraties te bereiken.
- Gebruik van rasterelektronenmicroscopie om de geassembleerde structuren te visualiseren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vorming van biomoleculaire kettingen uit de peptidemengsels.
- Demonstratie van het zelfassemblageproces dat leidt tot complexe structuren.
- Visualisatie van de assemblages met behulp van rasterelektronenmicroscopie.
- Mogelijkheid om nieuwe peptide-gebaseerde assemblages te ontdekken via deze methode.
Conclusies
- De zelfassemblagemethode is effectief voor het genereren van op peptiden gebaseerde structuren.
- Deze aanpak kan worden toegepast op een verscheidenheid aan peptiden.
- Verder onderzoek kan leiden tot nieuwe ontdekkingen in peptide-assemblage.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Peptide self-assembly enables the formation of complex biomolecular structures under mild conditions, offering a scalable and accessible route to biomaterials for drug delivery and nanomedicine. This method supports early-stage target validation by providing reproducible, quantifiable assemblies that can be characterized via microscopy and spectroscopy. The approach reduces mechanistic ambiguity in peptide-based system design, accelerating translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of peptide-driven self-assembly mechanisms to validate structural hypotheses.
- Operational Value: Uses commercially available peptides and standard lab equipment for rapid hypothesis testing.
- Predictive Value: Supports de-risking of peptide-based therapeutics by confirming ordered structure formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized peptide assemblies suitable for high-resolution imaging and spectroscopic analysis.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through consistent co-assembly protocols and defined peptide ratios.
- Scalability: Permits adaptation to other peptide classes for multiplexed screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates formation of defined nanostructures (e.g., biomolecular necklaces) with tunable morphology via peptide blending.
- Operational Value: Enables correlation of FTIR peaks with secondary structure (alpha helix, beta sheet, beta turn) for functional prediction.
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical by providing characterized, stable assemblies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead optimization, where peptide assembly behavior informs structure-function relationships and material properties.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on peptide interactions and supramolecular organization.
- Screening: Delivers reproducible, quantifiable outputs (e.g., assembly diameter, morphology) for condition comparison.
- Analytics: Provides FTIR and microscopy readouts that enable structural classification and batch consistency.
- Translational Research: Connects assembly characteristics to potential biomedical applications via structural validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform adaptable to diverse peptides for repeated use across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in peptide assembly behavior and structural outcomes.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and low barrier to entry using commercial reagents.
- Strategic Value: Informed go/no-go decisions based on structural data, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of peptide candidates with validated assembly profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in peptide handling and organic solvent safety (HFP, ethanol).
- Depends on access to SEM, TEM, and FTIR for structural characterization.
- Necessitates cross-team standardization of blending ratios and incubation protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to other peptide sequences or solvent systems.
- Limited by the need for vacuum drying and deuterium exchange in FTIR to suppress water interference.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:33
Self-Assembly of Homoaromatic Dipeptides and Co-assembly of Two Homoaromatic Dipeptides
3:11
Characterization of the Self Assembled Structures Using Scanning Electron Microscopy and Transmission Electron Microscopy
4:18
Characterization of the Secondary Structure by FT-IR
5:00
Results: Characterization of the Highly Ordered Self-assembled Peptides
6:51
Conclusion
