Een Drie-dimensionale Tissue Culture Model om te studeren Primary humaan beenmerg en zijn Malignancies

Het algemene doel van deze procedure is om een kweeksysteem op te zetten dat het cellulaire en intracellulaire micro-omgeving van menselijk beenmerg nauw benadert. Eerst wordt het oppervlak van een wel voor weefselkweek bedekt met de industriële matrix. Vervolgens worden beenmerg mononucleaire cellen, of andere cellen van belang gemengd met de beenmergmatrix.

Later wordt de industriële matrix verwijderd en wordt het cellulaire matrixmengsel aan de wel toegevoegd. Zodra de matrix is gevormd, wordt deze bedekt met groeimedium. Uiteindelijk kunnen cellen direct in de matrix worden gevisualiseerd of geïsoleerd worden voor verdere analyses. Vergeleken met bestaande methoden voor het kweken van cellen.

Bijvoorbeeld, standaard weefselkweekmethoden of de co-cultuur modellen waar cellen op plastic worden gekweekt. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van een 3D-kweekmethode is dat cellen worden gekweekt binnen de fysiologische micro-omgeving en daarom kunt u cellen bestuderen binnen de native omstandigheden van het weefsel. Bereid een 48-wel platen waarin de cellen worden geplaatst.

Door eerst 65 microliter industriële coatingoplossing in elke wel toe te voegen, verspreid de oplossing gelijkmatig om het hele oppervlak van de wel te bedekken. Deze methode is ook schaalbaar naar andere oppervlakken. Laat de platen minimaal 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen.

Ondertussen, bereid de celsuspensie van 50.000 cellen per microliter PBS. Bereid genoeg om 10 microliter aan elke wel toe te voegen, dan in een eenor buis, meng de celsuspensie met 100 microliter gereconstrueerd beenmatrix per. Wel meng voorzichtig en vermijd het introduceren van luchtbellen.

Houd de mengsel op ijs zodat de matrix niet stolt wanneer de plaat klaar is. Incuberen, verwijder al het vocht en dote coatingoplossing via aspiratie. Voeg vervolgens 100 microliter van de goed gemengde celsuspensie met matrix toe aan elk.

Kanteel snel de plaat met een pipet om het hele oppervlak van de wel gelijkmatig te bedekken. Blijf de suspensie mengen tussen het vullen van de wel, omdat cellen zullen klonteren wanneer ze volledig zijn geladen. Incubeer de plaat 30 tot 60 minuten zonder roeren tot de matrix stolt.

Vervolgens, voorverwarm het beenmerg groeimedium in een waterbad ingesteld op 37 graden Celsius. Na 30 minuten incubatie, controleer of de matrix goed is gesteld. Een goede matrix vormt een zachte gel-achtige laag die niet beweegt wanneer de plaat wordt gekanteld.

Wanneer de matrix klaar is, bedek deze voorzichtig met een milliliter medium druppelsgewijs met behulp van een serologische pipet. Breng vervolgens de geassembleerde gereconstrueerde beenmatrixcultuur terug naar de incubator voor maximaal 30 dagen zonder mediumverversing. Als een mediumverversing nodig is, ververs slechts de helft van het medium tegelijk.

Verwijder het medium voorzichtig zonder de matrixlaag te verstoren. Kantel de plaat en laat het medium voorzichtig wegvloeien. Gebruik een pipet. Aaspibeer het medium later niet over de matrix.

Bij het kleuren van de cellen. Gebruik deze techniek voor oplossingsveranderingen. Voor het verwijderen van medium uit de wel van een 3D-kweek, is het erg cruciaal dat het vanaf de zijkant van de wel wordt verwijderd.

Anders zal de matrix worden verstoord en kunnen de cellen verloren gaan. Houd vast aan dezelfde techniek. Was de cellen twee keer met steriele eenmaal XPBS. Voeg vervolgens een halve milliliter ijskoude celhersteloplossing toe aan elk.

Verwijder de hele matrixlaag samen met de cellen door krachtig op en neer te pipetten. Voor elk, wel breng de verzameling over naar een micro centrifugeerbuisje en plaats het op ijs. Voeg vervolgens een aanvullende halve milliliter hersteloplossing toe aan dezelfde wel en verzamel al het resterende materiaal.

Vortex alle verzamelingen en incubeer ze een uur op ijs. Tijdens het uur, vortex de buisjes elke 15 minuten om celvrijlating uit de matrix te vergemakkelijken. Na een uur, controleer het mengsel op zichtbare klonten van matrix.

Er mogen geen klonten aanwezig zijn, maar als dat wel het geval is, breng het mengsel over naar een grotere buis en voeg een aanvullende twee tot vijf milliliter celherstel oplossing toe. Incubeer vervolgens de cellen nog eens 30 tot 60 minuten. Vortex regelmatig en controleer opnieuw op afwezigheid van matrixklonten.

Wanneer de matrix niet langer klontert. Centrifugeer het mengsel bij 1000 RPM gedurende vijf tot tien minuten bij vier graden Celsius. Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer het cellenpellet in een milliliter koude eenmaal XPBS.

Herhaal de centrifugatie. Vervang het supernatant met vers PBS en herhaal de wassing. Een derde keer.

Na de derde PBS-was, herstel de cellen in de geschikte oplossing voor de volgende procedure. Beenmergcellen werden gedurende 30 dagen in gereconstrueerd beenmatrix gekweekt en werden periodiek onderzocht door lichtmicroscopie bij 200 keer vergroting. Stroma-elementen werden voor het eerst gedetecteerd op dag vijf, maar ze waren duidelijk zichtbaar tegen dag 14.

Gedurende de kweekperiode migreerden cellen door de matrix en groepeerden ze zich in verschillende clusters. Massa's van kwaadaardige cellen groeiden in de loop van de tijd uit om de samenstelling van de stromacomponenten te evalueren die in RBM uitgroeien. De morfologie van cellen bij de overgang tussen RBM en de industriële coating werd geëvalueerd.

De cellen werden gekleurd voor fibronectine, actine en kernen. Visualisatiecellen met stromale morfologie bleken pre-osteoblasten te zijn met hoge niveaus van alkalische fosfatase-activiteit. Ze waren in staat calcium te mineraliseren, zoals bepaald door zarin roodkleuring. Cellen met een zichtbare aanwezigheid van lipidedruppels werden geïdentificeerd als adipocyten op basis van positieve kleuring met olie.

Rode cellen met incidentele meerdere kernen werden herkend als pre-osteoclasten en waren positief voor tartraatresistente zure fosfatase. Na is