Name: V3 Vlekvrije workflow voor een praktische, handige en betrouwbare totale eiwitbelastingscontrole in Western Blotting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-30T20:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Leer de V3-workflow voor Western blotting met TGX stain-free gels voor betrouwbare eiwitkwantificering. Deze methode biedt een praktisch en transparant alternatief voor traditionele laadcontroles.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken Dr. Wolf-Dieter Stalz, Dr. Arnaud Remy, Dr. Anton Posch, Dr. Patricia Piatti, Tom Davies, Kris Simonyi en Jeff Durban voor hun kritische beoordeling en bewerking van dit manuscript. De auteurs bedanken allison Schwartz ook voor de technische ondersteuning.

1. Eiwit monster prep
(Een typische procedure om eiwitten uit celkweek te extraheren wordt beschreven)
<ol><li>Plaats de HeLa celkweekschaal in ijs en was de cellen met ijskoude Tris-gebufferde Zoutoplossing (TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl).</li>
	<li>Aspireer de TBS en voeg vervolgens 1 ml per 100 mm schaal ijskoude RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS) aangevuld met fosfatase- en proteaseremmers toe.</li>
	<li>Schraap aanhechtingscellen van de schaal met behulp van een koude plastic celschraper; breng de celsuspensie voorzichtig over in een voorgekoelde microcentrifugebuis.</li>
	<li>Houd de constante agitatie gedurende 30 minuten bij 4 °C op een rotator.</li>
	<li>Draai bij 16.000 x g gedurende 20 min in een voorgekoelde centrifuge van 4 °C.</li>
	<li>Haal de buis voorzichtig uit de centrifuge en leg deze op ijs. Breng het supernatant over in een verse buis die op ijs wordt bewaard en gooi de pellet weg.</li>
	<li>Verwijder een klein volume (10-20 μl) lysaat om een eiwittest uit te voeren. Bepaal de eiwitconcentratie voor elk monster met behulp van de RC DC-testkit.</li>
	<li>Indien nodig, aliquot de eiwitmonsters voor langdurige opslag bij -20 °C. Herhaal bevriezings- en dooicycli veroorzaken eiwitafbraak en moeten worden vermeden.</li>
	<li>Neem ongeveer 20 μg van elk monster, voeg een gelijk volume van 2x Laemmli Sample Buffer toe (4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0,004% bromofenolblauw, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8).</li>
	<li>Verwarm elke cellysaat in de monsterbuffer bij 95 °C gedurende 5 min.</li>
	<li>Centrifugeer 16.000 x g in een microcentrifuge gedurende 1 min.</li>
</ol>2. Gel elektroforese met vlekvrije gels (~ 30 min)
<ol><li>Neem een Criterion TGX Elke KD-vlekvrije prefabgel (een gel in midi-formaat), verwijder de kam en de tape van de onderkant van de cassette.</li>
	<li>Plaats de cassette in de Criterion-cel en vul de geïntegreerde bovenste bufferkamer met een loopbuffer van 60 ml (25 mM Tris, 190 mM glycine, 0,1% SDS, pH 8,3). Spoel de putten af met een loopbuffer.</li>
	<li>Vul elke helft van de onderste buffertank met 400 ml lopende buffer tot de gemarkeerde vullijn.</li>
	<li>Laad de eiwitmonsters en de juiste eiwitmarkers.</li>
	<li>Plaats het deksel op de tank en lijn de kleurgecodeerde banaanstekkers uit met bijbehorende vijzels op het deksel.</li>
	<li>Laat de gel ~30 min op 200 V of 20 min op 300 V.</li>
</ol>3. Vlekvrije gelbeeldvorming met behulp van het Chemidoc MP-systeem om de eiwitscheidingskwaliteit te controleren (~ 5 min)
<ol><li>Verwijder de gelcassette uit de cel. Gebruik het gereedschap voor het openen van de gelcassette in het deksel van de criterioncel om de cassette open te breken en de gel los te laten.</li>
	<li>Breng een paar milliliter water aan op het midden van de UV-monsterlade van de ChemiDoc MP-imager. Til de gel voorzichtig uit de cassette en leg deze op de lade.</li>
	<li>Start Image Lab-software en leg de vlekvrije gelafbeelding (figuur 1A) vast met de volgende instellingen: Toepassing: vlekvrije gel Gel activeringstijd: 1 min Beeldvormingsgebied: criteriumgel Belichtingstijd van het beeld: automatisch geoptimaliseerd voor de meest intense banden</li>
	<li>Haal de gel uit de monsterlade en ga onmiddellijk verder met het overbrengen van de stap.</li>
</ol>4. Eiwitoverdracht met het Trans-Blot Turbo-systeem (~ 10 min)
<ol><li>Open een Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Pack; plaats de onderste stapel (inclusief het membraan) op de basis van de transfercassette.</li>
	<li>Plaats de gel op het membraan, plaats de bovenste stapel op de gel en rol bubbels uit.</li>
	<li>Plaats het deksel op de cassettevoet en draai aan de draaiknop om deze te vergrendelen.</li>
	<li>Plaats de cassette in de blotter bay.</li>
	<li>Start de overdracht door een vooraf ingesteld Turbo-programma te selecteren en de criterion-gelgrootte (midi) te kiezen en druk vervolgens op RUN. Een typische run duurt slechts 7 minuten.</li>
	<li>Wanneer de overdracht voorbij is, demonteer de vloeiende sandwich en plaats zowel de vlek als de gel in een container met gedeioneerd water.</li>
</ol>5. Vlekvrije gel- en vlekbeeldvorming met behulp van het Chemidoc MP-systeem om de efficiëntie en kwaliteit van eiwitoverdracht te controleren (~ 5 min)
<ol><li>Plaats de gel na de overdracht op de monsterlade van de ChemiDoc MP-imager.</li>
	<li>Start Image Lab-software en leg de vlekvrije afbeelding van de gel na overdracht (figuur 1B) vast met de volgende instellingen: Toepassing: vlekvrije gel Gel activeringstijd: geen Beeldvormingsgebied: criteriumgel Belichtingstijd van het beeld: hetzelfde als de belichtingstijd voor het pretransfergelbeeld</li>
	<li>Verwijder de gel uit de monsterlade en geef vervolgens de vlek (afbeelding 1C) met de volgende instellingen. Houd de vlek nat met een paar druppels water of TBST bij beeldvorming. Toepassing: vlekvrije vlek Beeldvormingsgebied: criteriumgel Belichtingstijd van het beeld: automatisch geoptimaliseerd voor de meest intense banden</li>
	<li>Verwijder het vloeimembraan uit de monsterlade en plaats het in een container met TBST (0,1% Tween 20 in TBS).</li>
</ol>6. Antilichaam incubatie
<ol><li>Blokkeer door de vlek in een oplossing van 3% runderserumalbumine (BSA) in TBST te plaatsen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.</li>
	<li>Incubeer de vlek 's nachts bij 4 °C in de oplossing die primair muisantilichaam bevat dat wordt verhoogd tegen het eerste doeleiwit en het primaire antilichaam van het konijn dat tegen het tweede doeleiwit wordt verhoogd.</li>
	<li>Giet de oplossing uit die het primaire antilichaam bevat. Was vervolgens de vlek door 5 minuten in 20 ml TBST te roeren. Herhaal 4x voor in totaal 5 wasbeurten.</li>
	<li>Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in de secundaire antilichaamoplossing met een Dylight 650 geconjugeerd Goat-antimuisantilichaam en een Dylight 549 geconjugeerd Goat-anti-rabbit antilichaam.</li>
	<li>Giet de oplossing uit die het primaire antilichaam bevat. Was vervolgens de vlek door 5 minuten in 20 ml TBST te roeren. Herhaal 4x voor in totaal 5 wasbeurten.</li>
</ol>7. Beeldvorming en Data-analyse door Image Lab Software- Totale eiwitnormalisatie (~ 5 min)
<ol><li>Verkrijg een multiplexing fluorescerende afbeelding van de vlek (Figuur 1E) door een nieuw meerkanaalsprotocol te openen, drie fluorescerende kanalen te configureren en het protocol uit te voeren. Kanaal 1: Toepassing: blot Dylight 650 Beeldvormingsgebied: criteriumgel Belichtingstijd van het beeld: automatisch geoptimaliseerd voor de meest intense banden Kanaal 2: Toepassing: blot Dylight 549 Beeldvormingsgebied: criteriumgel Belichtingstijd van het beeld: automatisch geoptimaliseerd voor de meest intense banden Kanaal 3: Toepassing: vlekvrije vlek Beeldgebied: criteriumgel Belichtingstijd beeld: automatisch geoptimaliseerd voor de meest intense banden</li>
	<li>Klik op het normalisatiepictogram in het vak Analysetool en klik op Ja om rijstroken en banden te detecteren.</li>
	<li>Selecteer en gebruik "Lanes and Bands tools" om indien nodig aanpassingen aan de rijstroken en banden aan te passen.</li>
	<li>Selecteer vlekvrije afbeelding als normalisatiekanaal.</li>
	<li>Selecteer MW Analysis Tools en wijs de MW-standaardbanen toe door de vakjes eronder aan te vinken.</li>
	<li>Als u de genormaliseerde volumes wilt weergeven, klikt u op de analysetabel op de werkbalk. Alle berekeningen worden automatisch uitgevoerd door de software, inclusief de normalisatiefactor en genormaliseerde volumes. De intensiteitswaarden van de doeleiwitband worden nu aangepast voor variatie in de eiwitbelasting. Dit maakt nauwkeurige vergelijkingen van doeleiwitten tussen de monsters mogelijk.</li>
</ol>

<ol><li>Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., Weiler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+total+protein+stains+as+loading+controls%3A+an+alternative+to+high-abundance+single-protein+controls+in+semi-quantitative+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting.</a> J. Neurosci. Methods. 172 (2), 250-254 (2008).</li>
<li>Bauer, D. E., Haroutunian, V., McCullumsmith, R. E., Meador-Woodruff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+four+housekeeping+proteins+in+elderly+patients+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Transm%22%5BJournal%5D)">Expression of four housekeeping proteins in elderly patients with schizophrenia.</a> J. Neural. Transm. 116 (4), 487-491 (2009).</li>
<li>Castaño, Z., Kypta, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Housekeeping+Proteins%3A+Limitations+as+References+During+Neuronal+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Neurosci.+J%22%5BJournal%5D)">Housekeeping Proteins: Limitations as References During Neuronal Differentiation.</a> Open Neurosci. J. 2, 36-40 (2008).</li>
<li>Colella, A. D., Chegenii, N., Tea, M. N., Gibbins, I. L., Williams, K. A., Chataway, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal. Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li>
<li>Cully, T. R., Edwards, J. N., Friedrich, O., Stephenson, D. G., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+plasma+membrane+Ca-ATPase+and+stromal+interacting+molecule+1+expression+levels+for+Ca2%2B+signaling+in+dystrophic+mdx+mouse+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Changes in plasma membrane Ca-ATPase and stromal interacting molecule 1 expression levels for Ca2+ signaling in dystrophic mdx mouse muscle.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 303 (5), (2012).</li>
<li>Dittmer, A., Dittmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-actin+is+not+a+reliable+loading+control+in+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Beta-actin is not a reliable loading control in Western blot analysis.</a> Electrophoresis. 27 (14), 2844-2845 (2006).</li>
<li>Dutka, T. L., Lamboley, C. R., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+carnosine+on+contractile+apparatus+Ca2%2B+sensitivity+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+release+in+human+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of carnosine on contractile apparatus Ca2+ sensitivity and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in human skeletal muscle fibers.</a> J. Appl. Physiol. 112 (5), 728-736 (2012).</li>
<li>Elliott, S., Busse, L., Swift, S., McCaffery, I., Rossi, J., Kassner, P., Begley, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+expression+and+function+of+erythropoietin+receptors+in+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol.+Dial.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Lack of expression and function of erythropoietin receptors in the kidney.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 27 (7), 2733-2745 (2012).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J., Western, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li>
<li>Ferguson, R. E., Carroll, H. P., Harris, A., Maher, E. R., Selby, P. J., Banks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Housekeeping+proteins%3A+a+preliminary+study+illustrating+some+limitations+as+useful+references+in+protein+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies.</a> Proteomics. 5 (2), 566-571 (2005).</li>
<li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Housekeeping+genes%3B+expression+levels+may+change+with+density+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells.</a> J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 76-79 (2010).</li>
<li>Gürtler, A., Kunz, A., Gomolka, M., Hornhardt, S., Friedl, A. A., McDonald, K., Kohn, J. E., Posch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stain-Free+Technology+as+Normalization+Tool+in+Western+Blot+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stain-Free Technology as Normalization Tool in Western Blot Analysis.</a> Anal. Biochem. 433 (2), 105-111 (2013).</li>
<li>Hagiwara, M., Kobayashi, K., Tadokoro, T., Yamamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+SYPRO+Ruby-+and+Flamingo-stained+polyacrylamide+gels+to+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Application of SYPRO Ruby- and Flamingo-stained polyacrylamide gels to Western blot analysis.</a> Anal. Biochem. 397 (2), 262-264 (2010).</li>
<li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S. E., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> J. Immunol. Methods. 345 (1-2), 40-48 (2009).</li>
<li>Jensen, R. B., Ozes, A., Kim, T., Estep, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kowalczykowski+SC+BRCA2+is+epistatic+to+the+RAD51+paralogs+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Kowalczykowski SC BRCA2 is epistatic to the RAD51 paralogs in response to DNA damage.</a> DNA Repair. , (2013).</li>
<li>Lanoix, D., St-Pierre, J., Lacasse, A. A., Viau, M., Lafond, J., Vaillancourt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+reference+proteins+in+human+placenta%3A+general+protein+stains+are+the+benchmark%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Stability of reference proteins in human placenta: general protein stains are the benchmark.</a> Placenta. 33 (3), 151-156 (2012).</li>
<li>Larkins, N. T., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+of+temperature%2C+oxidative+stress%2C+and+phosphorylation+on+binding+of+heat+shock+proteins+in+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 3 (6), (2012).</li>
<li>Laurie, K. J., Dave, A., Straga, T., Souzeau, E., Chataway, T., Sykes, M. J., Casey, T., Teo, T., Pater, J., Craig, J. E., Sharma, S., Burdon, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Novel+Oligomerization+Disrupting+Mutation+in+CRY%CE%91A+Associated+with+Congenital+Cataract+in+a+South+Australian%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Identification of a Novel Oligomerization Disrupting Mutation in CRYΑA Associated with Congenital Cataract in a South Australian.</a> , (2012).</li>
<li>Li, X., Bai, H., Wang, X., Li, L., Cao, Y., Wei, J., Liu, Y., Liu, L., Gong, X., Wu, L., Liu, S., Liu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+rice+reference+proteins+for+western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of rice reference proteins for western blotting.</a> J. Exp. Bot. 62 (14), 4763-4772 (2011).</li>
<li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> J. Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li>
<li>Lowe, D. A., Degens, H., Chen, K. D., Alway, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+varies+with+age+in+glycolytic+muscles+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol.+A+Biol.+Sci.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase varies with age in glycolytic muscles of rats.</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55 (3), 160-164 (2000).</li>
<li>Mollica, J. P., Dutka, T. L., Merry, T. L., Lamboley, C. R., McConell, G. K., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-glutathionylation+of+troponin+I+%28fast%29+increases+contractile+apparatus+Ca2%2B+sensitivity+in+fast-twitch+muscle+fibres+of+rats+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">S-glutathionylation of troponin I (fast) increases contractile apparatus Ca2+ sensitivity in fast-twitch muscle fibres of rats and humans.</a> J. Physiol. 590, 1443-1463 (2012).</li>
<li>Murphy, R. M., Dutka, T. L., Horvath, D., Bell, J. R., Delbridge, L. M., Lamb, G. D. Ca2+-dependent Proteolysis of Junctophilin 1 and Junctophilin 2 in Skeletal and Cardiac. 591, 719-729 (2012).</li>
<li>Neill, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+Data+are+not+created+Equal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">All Data are not created Equal.</a> J. Clin. Invest. 119, 224 (2009).</li>
<li>Pérez-Pérez, R., López, J. A., García-Santos, E., Camafeita, E., Gómez-Serrano, M., Ortega-Delgado, F. J., Ricart, W., Fernández-Real, J. M., Peral, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+suitable+reference+proteins+for+expression+studies+in+human+adipose+tissue+with+relevance+to+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Uncovering suitable reference proteins for expression studies in human adipose tissue with relevance to obesity.</a> PLoS One. 7 (1), (2012).</li>
<li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+Pitfalls+of+Internal+Controls%3A+Validation+of+Reference+Genes+for+Analysis+by+qRT-PCR+and+Western+Blot+throughout+Rat+Retinal+Development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Avoiding Pitfalls of Internal Controls: Validation of Reference Genes for Analysis by qRT-PCR and Western Blot throughout Rat Retinal Development.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li>
<li>Romero-Calvo, I., Ocón, B., Martínez-Moya, P., Suárez, M. D., Zarzuelo, A., Martínez-Augustin, O., de Medina, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+Ponceau+staining+as+a+loading+control+alternative+to+actin+in+Western+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots.</a> Anal. Biochem. 401 (2), 318-320 (2010).</li>
<li>Said, H. M., Polat, B., Hagemann, C., Anacker, J., Flentje, M., Vordermark, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+GAPDH+regulation+in+tumor-cells+of+different+origin+under+hypoxic+conditions+in-vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">Absence of GAPDH regulation in tumor-cells of different origin under hypoxic conditions in-vitro.</a> BMC Res. Notes. 13 (2), 8 (2009).</li>
<li>Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+sample+mixtures+for+standard+curve+creation+in+quantitative+western+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Anim%22%5BJournal%5D)">Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative western blots.</a> Exp. Anim. 60 (2), 193-196 (2011).</li>
<li>Welinder, C., Ekblad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+staining+as+loading+control+in+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Coomassie staining as loading control in Western blot analysis.</a> J. Proteome Res. 10 (3), 1416-1419 (2011).</li>
<li>You, J., Hodge, C., Wen, L., McAvoy, J. W., Madigan, M. C., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+soybean+trypsin+inhibitor+as+an+external+loading+control+for+Western+blot+analysis+of+tear+proteins%3A+application+to+corneal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Using soybean trypsin inhibitor as an external loading control for Western blot analysis of tear proteins: application to corneal disease.</a> Exp. Eye Res. 99, 55-62 (2012).</li>
</ol>

De auteurs Anton Posch, Jonathan Kohn, Kenneth Oh, Matt Hammond en Ning Liu zijn medewerkers van Bio-Rad Laboratories, Inc.

Het hierboven beschreven V3-vlekvrije protocol is voor multiplexing fluorescerende westernblotting. Het kan ook worden toegepast in westerse blotting met behulp van chemiluminescente detectie. In het multiplex fluorescerende western blot protocol worden de vlekvrije vlekbeelden op twee tijdstippen verkregen: 1) direct na eiwitoverdracht; 2) bij de multiplex fluorescente beeldvorming stap na antilichaam incubatie. De eerste vlekvrije afbeelding wordt gebruikt om de overdrachtsefficiëntie te berekenen en de tweede vlekvrije afbeelding wordt gebruikt als beladingscontrole. Wanneer de chemiluminescente methode wordt toegepast, is het niet mogelijk om een multiplexbeeld te maken voor de vlekvrije en doeleiwitsignalen, omdat het chemiluminescente signaal ook in het vlekvrije kanaal zal verschijnen. In dit geval raden we aan om de vlekvrije afbeelding direct na de eiwitoverdrachtstap te gebruiken voor belastingscontrole en normalisatieanalyse.
De V3 western workflow biedt de volgende unieke voordelen ten opzichte van de traditionele western blot workflow die huishoudelijke eiwitten gebruikt als laadregelaars:
Ten eerste biedt de V3-workflow een praktische, handige en betrouwbaardere beladingsregeling om de veranderingen in het niveau van het eiwit van belang te valideren. Het V3-protocol maakt gebruik van een totale eiwitbelastingsregeling om het niveau van het interesseeiwit, gemeten in elk monster, te normaliseren. Het vermijdt twee valkuilen van het gebruik van de huishoudelijke eiwitten als belastingscontroles: verzadigde immunodetection en inconsistente expressieniveaus van huishoudelijke eiwitten onder de monsters onder bepaalde experimentele omstandigheden. Strippen en reprobing stappen met antilichamen gericht tegen het huishouden zijn niet langer nodig. Met behulp van vlekvrije technologie is het niet nodig om een vlek te beitsen en te de-beitsen met vlekken zoals Coomassie of Sypro Ruby voor totale eiwitmeting. Het duurt slechts een paar seconden om een vlekafbeelding te verkrijgen en ongeveer 5 minuten om totale eiwitnormalisatie uit te doen met behulp van Image Lab-software.
Ten tweede stelt de V3-workflow wetenschappers in staat om de westerse procedure beter te controleren, omdat het de procedure transparanter maakt en verschillende controlepunten voor kwaliteitscontrole introduceert. Met behulp van vlekvrije technologie kunnen onderzoekers hun eiwitmonsters visualiseren op zowel de gel als de vlek. Wetenschappers kunnen de integriteit van eiwitmonsters (gedegradeerd of niet), scheidingskwaliteit (al dan niet neergeslagen), overdrachtsefficiëntie en overdrachtskwaliteit (zelfs overdracht of niet) beoordelen. Deze controlepunten helpen onderzoeken het experiment te beëindigen bij het zien van grote gebreken in het proces en voorkomen dat ze tijd verspillen aan slechte monsters en vlekken. Deze technologie helpt wetenschappers ook te beoordelen of er een aanzienlijke hoeveelheid eiwitverlies is na het strippen van het membraan en of de vlek geschikt is voor het weerleggen van een ander doel 4.
Hier zijn een paar tips om een goede ervaring en kwaliteitsgegevens te garanderen met behulp van V3 western workflow.
<ol><li>Afbeelding van de gel onmiddellijk na gel run. Week de gel niet in een buffer vóór de eerste beeldvorming in de procedure, omdat deze de vlekverbinding kan wegspoelen.</li>
	<li>Gebruik hetzelfde beeldgebied om alle afbeeldingen in het protocol te verkrijgen. Hierdoor kan de software afbeeldingen overlappen voor gegevensanalyse, zoals totale eiwitnormalisatie.</li>
	<li>Houd de belichtingstijd consistent bij het in beeld brengen van de pretransfer- en posttransfergels. Hierdoor kan de software de overdrachtsefficiëntie kwantitatief meten.</li>
	<li>Houd het membraan nat met een paar druppels water of TBST bij het verkrijgen van het vlekbeeld. Dit voorkomt mogelijke vuile achtergrondproblemen voor doeleiwitdetectie.</li>
	<li>Gebruik een laag fluorescerend PVDF-membraan voor multiplexing fluorescerende westelijke blotting.</li>
</ol>Het is belangrijk op te merken dat het vlekvrije molecuul na UV-activering onomkeerbaar gebonden is aan tryptofaanresten. Deze onomkeerbare modificatie kan mogelijk van invloed zijn op de herkenning van antigeen bij het gebruik van monoklonale antilichamen als de epitoop tryptofaan bevat. Polyklonale antilichamen zullen waarschijnlijk niet worden aangetast omdat ze meerdere epitopen op het antigeen herkennen. Ongebonden vlekvrije moleculen kunnen gemakkelijk van de gel en het membraan worden gewassen en zullen daarom de antilichaam-antigeeninteracties niet verstoren.
Kortom, de V3 western workflow maakt het western vlek proces sneller, transparanter, kwantitatiever en betrouwbaarder. Onderzoekers kunnen nu eenvoudig totale eiwitbelastingscontrole toepassen in een westers vlekexperiment om hun gegevens betrouwbaarder te maken. De V3-vlekvrije workflow is overgenomen door een aantal laboratoria en hun publicaties hebben aangetoond dat tijdschriften vlekvrije gegevens accepteren als beladingscontrole in western blot22,17,7,8,5,23,18,15.

Western vlek is een zeer nuttige techniek9, maar er zijn twee grote uitdagingen met western blotting: lang en arbeidsintensief proces en kwaliteit van gegevens. Een traditioneel protocol vereist ongeveer 2 dagen. Het omvat vele stappen, waaronder monstervoorbereiding, gelgieten, eiwitelektroforese en overdracht, membraanblokkering gevolgd door antilichaam incubatie, beeldvorming en heel vaak strippen, reprobing en ten slotte gegevensanalyse. Gedurende dit hele proces zijn er geen betrouwbare en flexibele tools voor procesbesturing. Als zodanig kunnen fouten bij elke stap worden geïntroduceerd en deze fouten kunnen gegevensartefacten genereren; daarom zijn beladingscontroles essentieel bij western blotting om de fouten te identificeren en te corrigeren. De beladingscontrole wordt meestal uitgevoerd door het eiwitniveau van een referentie-eiwit in elk monster te controleren om te zien of het gelijk wordt gepresenteerd. Mensen gebruiken vaak huishoudelijke eiwitten, zoals β-actine, β-tubuline, GAPDH, als beladingscontrole.
De kwaliteit van westerse vlekgegevens is afhankelijk van betrouwbare beladingscontrole. Maar er zijn twee legitieme zorgen bij het gebruik van huishoudelijke eiwitten voor belastingscontroles: 1) de op antilichamen gebaseerde immunodetection van de huishoudelijke eiwitbanden is vaak verzadigd en daarom kan men de belastingsverschillen tussen de monsters niet onderscheiden30; 2) het niveau van de huishoudingeiwitexpressie kan in de steekproeven onder bepaalde experimentele voorwaarden variëren, bijvoorbeeld siRNA behandeling, celdood, celdifferentiatie, enz.11,28,3,6,10,21. Vanwege deze zorgen eisen wetenschappelijke tijdschriften nu dat "voor kwantitatieve vergelijkingen geschikte reagentia, controles en beeldvormingsmethoden met lineaire signaalbereiken moeten worden gebruikt" (Natuurrichtlijn). Evenzo vragen redacteuren van het Journal of Clinical Investigation om betrouwbaardere beladingscontroles24. Om deze redenen moet een huishoudelijk eiwit worden gevalideerd om te kunnen worden gebruikt als beladingscontrole. Ten eerste moet men ervoor zorgen dat het wordt gemeten in het lineaire dynamische bereik van de immunodetectionmethode14,29. Ten tweede moet men ervoor zorgen dat het consistent wordt uitgedrukt in alle monsters26,31,25,19,20.
Een alternatieve oplossing voor een betrouwbare beladingsregeling is het gebruik van totale eiwitmeting van de vlek. Sommige onderzoekers hebben de vlekken gekleurd met totale eiwitvlekken, zoals Coomassie, Flamingo Pink, Sypro Ruby, Amido Black, Ponceau S en vlekvrije technologie, om het totale eiwitsignaal in elke rijstrook te meten als beladingscontrole16,20,13,27,1,4,12. De totale eiwitbelastingscontrole vermijdt de valkuilen die gepaard gaan met huishoudelijke eiwitten. Ten eerste is het een echte weerspiegeling van de hoeveelheid eiwit die voor elk monster wordt geladen. Ten tweede vertoont de totale eiwitvlek een uitstekend lineair dynamisch bereik in het gemeenschappelijke laadbereik voor westerse vlekanalyse (10-50 μg eiwit van een complex cellysaat) en onderscheidt nauwkeurig het belastingsverschil tussen de monsters12.
Vlekvrije technologie is een nieuwe totale eiwitkleuringsmethode waarbij een unieke verbinding wordt gemengd in acrylamidegeloplossing en gelijkmatig wordt verdeeld in de gegoten gel. Nadat elektroforese is voltooid, wordt de gel minimaal 1 minuut blootgesteld aan UV-licht, zodat de vlekverbinding reageert met de tryptofaanresten in het eiwit. De eiwitten worden prikkelbaar onder UV-licht om een sterk fluorescerend signaal te geven dat kan worden gevisualiseerd en gekwantificeerd in een vlekvrije beeldschrijver zoals het ChemiDoc MP-systeem. De vlekvrije verbinding zelf absorbeert echter geen UV-licht, wat resulteert in een lage achtergrond van het gelbeeld. De modificatie van de tryptofaanresten is onomkeerbaar en eiwitten kunnen niet alleen in de gel worden gevisualiseerd, maar ook op de vlek op elk moment na eiwitoverdracht.
De vlekvrije technologie wordt toegepast in de V3 Western Workflow (figuur 1) om de belangrijkste klachten over de traditionele workflow aan te pakken, met name de zorgen over het gebruik van huishoudelijke eiwitten als beladingscontrole. Met behulp van deze workflow kan men: 1) een gel uitvoeren in ongeveer 20-30 minuten, 2) de integriteit van het monster en de kwaliteit van de eiwitscheiding controleren in 5 minuten na het lopen van de gel; 3) breng eiwitten over in 3-10 min; 4) controleer de overdrachtsefficiëntie kwantitatief; en 5) het belangrijkste, valideer veranderingen in het niveau van het eiwit van belang met behulp van totale eiwitbelastingscontrole.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>567-8093</td><td>Kies een gelmaat en percentage die voldoen aan de specifieke behoefte in een experiment</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4157</td><td>Kies PVDF of nitrocellulose en match de membraangrootte met de gelmaat</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate, 500 ml </td><td>Bio-Rad</td><td>170-5061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">APPARATUUR</td></tr><tr><td>Criterion Cell </td><td>Bio-Rad</td><td>165-6100</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer Starter System </td><td>Bio-Rad</td><td>170-4155</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP System </td><td>Bio-Rad</td><td>170-8280</td><td></td></tr></tbody></table>

v3 vlekvrije workflow voor een praktische, handige en betrouwbare totale eiwitbelastingscontrole in western blotting

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

De westerse vlek is een zeer nuttige en wijdverbreide laboratoriumtechniek, maar de uitvoering ervan is uitdagend. De workflow wordt vaak gekenmerkt als een "black box" omdat een experimentalist niet weet of het met succes is uitgevoerd tot de laatste van verschillende stappen. Bovendien wordt de kwaliteit van westerse vlekgegevens soms uitgedaagd vanwege een gebrek aan effectieve kwaliteitscontroletools in het hele westerse blotting-proces. Hier beschrijven we de V3-westerse workflow, die vlekvrije technologie toepast om de belangrijkste problemen in verband met het traditionele westerse vlekprotocol aan te pakken. Deze workflow stelt onderzoekers in staat: 1) om een gel in ongeveer 20-30 minuten uit te voeren; 2) om steekproefscheidingskwaliteit binnen 5 min na de gelloop te visualiseren; 3) om eiwitten over te brengen in 3-10 min; 4) om de overdrachtsefficiëntie kwantitatief te verifiëren; en vooral 5) om veranderingen in het niveau van het eiwit van belang te valideren met behulp van totale eiwitbelastingscontrole. Deze nieuwe aanpak elimineert de noodzaak van het strippen en opnieuw berispen van de vlek voor huishoudelijke eiwitten zoals β-actine, β-tubuline, GAPDH, enz. De V3-vlekvrije workflow maakt het westerse vlekproces sneller, transparanter, kwantitatiever en betrouwbaarder.

1. Beoordeling van de integriteit van het monster, de kwaliteit van de eiwitscheiding en de overdrachtsefficiëntie met vlekvrije gelafbeeldingen.
Eiwitextract uit HeLa-cellen werd gedurende 20 minuten bij 300 V gescheiden op een 18-well Criterion AnyKD TGX vlekvrije gel. De eiwitmonsters werden 3x geladen bij vier verschillende hoeveelheden (Lanes 1-3, 40 μg; Rijstroken 4-6, 30 μg; Rijstroken 7-9, 20 μg; Rijstroken 10-12, 10 μg). De gel werd gedurende 1 min geactiveerd onder UV-licht. Figuur 2A toont het gelbeeld dat direct na de eiwitscheiding is verkregen. De integriteit van eiwitmonsters(bijv. afbraak) en de scheidingskwaliteit(bijv. eiwitprecipitatie) kunnen visueel worden beoordeeld met dit gelbeeld. Eiwitten werden vervolgens gedurende 7 minuten overgebracht naar een nitrocellulosemembraan met trans-Blot Turbo. Figuur 2B toont de vlekvrije afbeelding van de post-transfer gel. Beide beelden werden verworven met dezelfde belichtingstijd (6,8 sec). Rijstrook 3 en 12 werden geselecteerd om de overdrachtsefficiëntie te meten. Met behulp van het volumegereedschap in de Image Lab-software werd een rechthoekig vak (blauw) getekend om baan 3 en 12 op beide gelafbeeldingen te bedekken. Uit de berekening op basis van de volumewaarden uit deze vakken bleek dat de overdrachtsefficiëntie van beide rijstroken 80% bedroeg (figuur 2C). In dit experiment werd de AnyKD TGX-gel geselecteerd om kleine tot middelgrote doeleiwitten te bestuderen en werd deze niet geoptimaliseerd voor de overdracht van grote eiwitten. Het optimaliseren van de overdrachtsefficiëntie vereist het gebruik van gel met een lager percentage(bijv. 4-20%) en/of een aanpassing van de overdrachtstijd om de overdracht van grote eiwitten te vergemakkelijken. 2. Vlekvrije totale eiwitbelastingscontrole is een betrouwbaar alternatief voor huishoudelijke beladingscontrole in westerse blotting om een kleine verandering in het niveau van eiwit van belang te kwantificeren.
MCM-7 is een DNA-licentiereplicatiefactor waarvan het niveau met 20-50% afneemt in lymfoblastoïde cellijnen (LCL) na bestralingsbehandeling. In dit experiment werden lysaten (elk 30 μg) van vier met controle en bestraling behandelde lymfoblastoïde cellijn (LCL) culturen gescheiden op een 12-well Criterion AnyKD TGX vlekvrije gel. De gel werd 1 min geactiveerd onder UV-licht en door Trans-Blot Turbo overgebracht naar een PVDF-membraan voor immunoblotting. Het huishoudelijke eiwit GAPDH (groen) werd onderzocht met een konijnantilichaam (Cell Signaling Technology, VS, 1:2.500) en een Dylight 549 geconjugeerd Goat-anti-rabbit anti-rabbit antilichaam (Rockland, USA, 1:20.000). Het eiwit van belang MCM-7 (rood) werd onderzocht met behulp van een muisantilichaam (Abcam, VS, 1:1.000) en een Dylight 649 geconjugeerd Goat-antimuisantilichaam (Rockland, 1:10.000).
Figuur 3A toont een multiplex fluorescerend beeld van de totale eiwitten (blauw), MCM-7 (rood) en GAPDH (groen) gedetecteerd in vier met controle en bestraling behandelde LCL-monsters. Figuur 3B is een vlekvrije afbeelding van dezelfde vlek die de totale eiwitpatronen in elk monster weergeeft (30 μg). Image lab-software selecteerde de monsterbanen (blauwe vakken) om MCM-7, GAPDH en het totale eiwitvolume in elke rijstrook te meten. De MCM-7-niveaus werden genormaliseerd tegen de vlekvrije totale eiwitmeting of tegen GAPDH. De genormaliseerde MCM-7 eiwitniveaus werden statistisch geanalyseerd en het gemiddelde MCM-7 eiwitbandvolume en de standaarddeviatie (n=4) worden weergegeven in de grafiek (Figuur 3C). Beide normalisatiemethoden lieten een kleine afname zien (ongeveer 25%) in MCM-7 eiwitniveaus na bestralingsbehandeling. De gegevens met de totale eiwitnormalisatie vertoonden een kleinere standaardafwijking dan die met GAPDH als beladingscontrole.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1.jpg"> Figuur 1. V3 Westerse workflow. De V3-workflow wordt in 4 stappen in de linkerkolom weergegeven. De belangrijkste instrumenten en reagentia die in de werkstroom worden gebruikt, worden bij elke stap weergegeven. De geschatte tijd voor elke stap is ook inbegrepen. De rechterkolom laat zien dat er minimaal 4 afbeeldingen kunnen worden gegenereerd in de V3-workflow. Het gebruik van elk stukje gegevens wordt beschreven. De vlekvrije afbeeldingen van de pretransfergel, posttransfergel en de vlek (A, B, C) kunnen niet gemakkelijk worden gegenereerd met traditionele westerse blaastechnieken; Deze afbeeldingen en gegevens bieden belangrijke informatie en controlepunten langs de procedure om de controle en reproduceerbaarheid van de westerse vlekworkflow van de wetenschapper te verbeteren. De doeleiwitsignalen kunnen worden vastgelegd op een chemiluminescente vlekafbeelding (D) als een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam werd toegepast bij detectie of op een fluorescerend vlekbeeld (E) als multiplexing fluorescerende westelijke blotting werd uitgevoerd om meer dan één doeleiwit tegelijkertijd op dezelfde vlek te detecteren. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2.jpg"> Figuur 2. Vlekvrije afbeeldingen van pretransfer- en posttransfergels in de V3-westernworkflow om de integriteit, scheidingskwaliteit en overdrachtsefficiëntie van het monster te beoordelen. (A) Pretransfer gel vlekvrije afbeelding. (B) Post-transfer gel vlekvrije afbeelding. (C) Eiwitoverdrachtsefficiëntiemeting.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3.jpg"> Figuur 3. Vergelijking van vlekvrije totale eiwitmeting met GAPDH-immunodetection als belastingscontroles om het niveau van interessant eiwit te normaliseren. (A) Fluorescerend westers vlekbeeld. (B) Vlekvrije vlek afbeelding. (C) Genormaliseerde MCM-7 eiwitniveaus. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>

V3 workflow is een westerse vlek procedure met behulp van vlekvrije gels. De vlekvrije technologie stelt onderzoekers in staat om de kwaliteit van eiwitscheiding te visualiseren, de overdrachtsefficiëntie te verifiëren en vooral om de verandering in het eiwit van belang te valideren met behulp van totale eiwitkwantificering als een betrouwbare belastingscontrole.

V3 Vlekvrije workflow voor een praktische, handige en betrouwbare totale eiwitbelastingscontrole in Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

De BioRad V three Workflow biedt onderzoekers een betrouwbaardere kwantificering en meer zekerheid bij het Western blotting-proces. Dit wordt bereikt door eerst TGX stain free gels te gebruiken om eiwitmonsters te scheiden en te visualiseren. Na de scheiding worden de eiwitten overgebracht naar een membraan met behulp van het blot turbo rapid transfer-systeem, waarmee de kwaliteit en efficiëntie van de overdracht kan worden geverifieerd.Na verificatie van de transfer wordt het membraan geblokkeerd en geïncubeerd met primaire en secundaire antilichamen voor de doeleiwitten. Ten slotte worden de niveaus van de doeleiwitten genormaliseerd met behulp van de stain-free totale eiwitmeting als ladingscontrole. De V three-workflow brengt gemak en transparantie in het western blotting-proces, waardoor onderzoekers vertrouwen krijgen bij elke stap, van scheiding tot transfer en kwantificering.Het belangrijkste voordeel van de V three Western-workflow ten opzichte van traditionele Western blotting is dat stain-free technologie een praktische, handige en betrouwbare totale eiwitlaadcontrole biedt voor het normaliseren van uw doeleiwitsignalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen met betrekking tot de betrouwbaarheid van methodieken voor laadcontroles bij de Western blotting-techniek, waarbij sprake is van oververzadiging van signalen van housekeeping-eiwitten en differentiële expressieniveaus van housekeeping-eiwitten onder variërende experimentele omstandigheden. We hebben ontdekt dat eiwitten die zijn geactiveerd in stain-free gels ook op blots gevisualiseerd konden worden zonder verdere kleuring, waardoor ze kunnen worden gebruikt als alternatief voor conventionele totale eiwitkleuringen, cũng als voor laadcontroles met housekeeping-eiwitten.In de volgende minuten zullen we de volledige V three workflow demonstreren met behulp van multiplex fluorescentie. Dezelfde procedure kan ook worden gebruikt voor chemiluminescentie nadat de eiwitmonsters volgens het tekstprotocol zijn voorbereid. Verwijder de kam en de tape van de onderkant van de cassette van een criterion TGX stain free any KD precast gel.Plaats de cassette in het gelelektroforeseapparaat en vul beide reservoirs met runbuffer. Laad de eiwitstandaarden en monsters. Laat de gel vervolgens 20 minuten lopen bij 300 volt.Nadat de elektroforese is voltooid, gebruikt u het gereedschap voor het openen van de gelcassette op het deksel van de Criterion Cell om de cassette te openen. Breng vervolgens enkele milliliters water aan op de UV-transilluminator van de Chemi Dock MP imager. Til de gel voorzichtig uit de cassette en plaats deze op de UV-transilluminator. Start de Image Lab-software en stel een nieuw enkelkanaals protocol in voor stain-free gels met de standaard gelactivatietijd van één minuut, selecteer het juiste geltype en de standaard auto-optimalisatie voor intense banden.Klik vervolgens op 'run protocol'. Zodra de beeldopname is voltooid, visualiseert u de scheiding en de monsterkwaliteit. Ga daarna onmiddellijk over naar de overdrachtsstap.Om de eiwitoverdracht uit te voeren, opent u een trans block turbo MIDI PVDF transfer pack. Plaats de onderste stapel in het midden van de cassettebasis. Verwijder de gel uit de imager.Lijn de gel uit bovenop het membraan. Gebruik voorzichtig de blot-roller om luchtbellen tussen de gel en het membraan te verwijderen. Lijn vervolgens de bovenste stack uit bovenop de gel.Nadat eventuele luchtbellen zijn verwijderd, plaatst u het cassettedeksel op de basis. Druk het deksel stevig aan, draai de knop rechtsom om te vergrendelen en plaats de cassette in een van de twee blottercompartimenten. Selecteer vanuit het startscherm het turboprotocol.Kies de twee mini- of één minigel en druk op de startknop voor de betreffende bay. De transfer is na zeven minuten voltooid. Verwijder de cassette uit de bay.Ontgrendel de cassette en demonteer de blotting-sandwich. Plaats de gel na de overdracht op de UV-transluminator van de Chemi dock MP imager en plaats het membraan onmiddellijk in gedeïoniseerd water. Stel een nieuw enkelkanaalprotocol in voor stain-free gels zonder activatietijd.Selecteer het geschikte geltype, stel de belichtingstijd handmatig in op die van de gel vóór de overdracht en klik op 'run protocol'. Zodra de beeldopname is voltooid, kan de overdrachtsefficiëntie worden geverifieerd door de intensiteit van de monsterbanden tussen de gels vóór en na de overdracht te vergelijken.Verwijder de gel uit het monsterbakje, aangezien deze niet meer nodig is, en gooi deze weg. Om de overdracht te verifiëren, wordt er overgegaan naar de blot. Plaats het membraan op het monsterbakje en stel een nieuw protocol voor één enkel kanaal in.Voor een kleurvrije blot. Selecteer het juiste geltype en de standaard automatische optimalisatie voor intense banden. Klik vervolgens op 'protocol uitvoeren'.Zodra de beeldvastlegging is voltooid, wordt de overdracht naar het membraan geverifieerd. Verwijder het blotmembraan uit de UV-transilluminator en plaats het in blokkeringsbuffer voor western blotting. Na incubatie van het membraan gedurende één uur bij kamertemperatuur, wordt het de volgende dag gedurende de nacht geïncubeerd met muis- en konijn primaire antilichamen bij vier graden Celsius.Giet de antilichaamoplossing af en was de blot gedurende vijf minuten met 50 milliliters TBST. Incubeer de blot gedurende één uur bij kamertemperatuur met fluorescent geconjugeerde anti-muis en anti-konijn secundaire antilichamen. Was de blot vervolgens vijf keer gedurende vijf minuten per keer met TBST.Om de blot te beelden, plaatst u deze op de UV-transilluminator van de Chemi doc MP-imager in de image lab-software. Stel een nieuw multichannel-protocol in. Configureer kanaal één door onder blot-applicaties dite six 50 te selecteren en gebruik de standaard auto-optimalisatie voor intense banden.Herhaal deze stappen om kanaal twee en drie respectievelijk te configureren voor DITE 5 49 en stain free blot. Selecteer het juiste geltype en klik op run protocol. Om de lanes te definiëren, selecteert u de lane en de banden van de stain free blot afbeelding.Gebruik vervolgens de automatische lane-finder voor een nauwkeurige kwantificering. Zorg ervoor dat de achtergrondprofielen in elke sample-lane vergelijkbaar zijn door de grootte van de rolling disc aan te passen naar 70. Bevestig de uniformiteit van de achtergrond door alle lane-profielen te scannen om banden te definiëren in zowel de dite six 50- als de 5 49-kanalen.Gebruik de band-zoektool om banden te detecteren met de standaardgevoeligheidsinstellingen. Ga terug naar de analysetoolbox om het normalisatiekanaal aan te wijzen. Klik op normalisatie en kies 'stain free blot', waarbij u ervoor zorgt dat 'total lane protein' is geselecteerd.Om de banen met de moleculaire gewichtsstandaard toe te wijzen, keert u terug naar de analysetoolbox, klikt u op MW-analysetools en vinkt u het vakje onder de betreffende baan aan. Klik ten slotte in de werkbalk op de analysetabel om de genormaliseerde eiwitbandintensiteiten te bekijken. De software genereert automatisch een tabel met volume-intensiteiten, normalisatiefactoren en genormaliseerde volumes.De genormaliseerde volumes moeten worden gebruikt voor data-analyse en rapportage. De tabel kan worden geëxporteerd. Voor verdere analyse hebben we de volledige V three Western blotting-workflow gedemonstreerd.Nu tonen we u representatieve resultaten van een echt experiment. Lysaten van controle- en bestraalde lymfoblastenculturen werden geanalyseerd met de V drie Western blot-workflow. Het stain-free totale eiwitsignaal wordt in het blauw weergegeven.Het doeleiwit M CM seven is in het rood weergegeven, en het gevalideerde huishoudelijk eiwit als ladingscontrole GA DH is in het groen weergegeven. GA DH is gevalideerd als een geschikte ladingscontrole door de lineariteit ervan te beoordelen met behulp van de experimentele condities die in deze video worden beschreven. De stain free totale eiwitsignalen voor elke lane op de blot werden gemeten met image lab-software.MCM seven signaalintensiteiten werden genormaliseerd met gebruik van zowel de totale eiwit- als de GAPDH-signalen. De volumes van de MCM seven eiwitbanden, genormaliseerd met beide methoden, onthulden een 25% lagere expressie in bestraalde monsters ten opzichte van controlemonsters vóór nauwkeurige normalisatie. Het housekeeping-eiwit vereist validatie ter bevestiging van het lineaire bereik en consistente expressieniveaus tussen monsters zonder validatie.Loadingcontrols met housekeeping-eiwitten garanderen geen nauwkeurige normalisatie. In tegenstelling hiermee vereist normalisatie van het totale eiwit geen validatie. Daarom biedt het stain-free totale eiwitsignaal, verkregen via de V three-workflow, een praktische, handige en betrouwbaardere loadingcontrol bij het uitvoeren van deze procedure.Houd er rekening mee dat stain-free technologie fluorescentievisualisatie van eiwitmonsters mogelijk maakt via een UV-geïnduceerde covalente modificatie van beschikbare tryptofaanresidu's. Alleen in zeldzame gevallen zal deze modificatie een significante impact hebben op downstream applicaties zoals immunodetectie of massaspectrometrie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de V3 Western-workflow en stain-free totale eiwitnormalisatie uitvoert.Hoewel we deze workflow hebben gedemonstreerd voor multiplex fluorescentie Western blotting, kan stain-free technologie ook worden gebruikt voor totale eiwitnormalisatie bij luminescente Western blots.

v3-stain-free-workflow-for-practical-convenient-reliable-total

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Western blotting is een analytische techniek die gebruikt wordt om specifieke eiwitten te detecteren in een monster van weefsel homogenaat of het uittreksel.

Western Blotting: Monstervoorbereiding naar Detectie

The video demonstrates a total protein normalization-based western blotting technique for quantifying the target protein expression in a sample. By utilizing the total protein staining of the sample, a ratiometric analysis is performed to determine the relative expression level of the target protein.

Quantitative Western Blotting to Estimate Protein Expression Levels

This video describes the chemiluminescence-based western blotting of immunoprecipitated lysates. The technique helps determine protein processing and activation. The chemiluminescent signal detected is proportional to the level of protein processing during its activation.

Chemiluminescent Western Blot Assay for Protein Processing

Dit protocol verkent de nieuwste ontwikkelingen in het uitvoeren van Western blot analyses. Deze nieuwe modificaties maken gebruik van een Bis-Tris gel systeem met een 35 min elektroforese looptijd, een 7 minuten droge blotting transfersysteem en infrarood fluorescerend eiwit en beeldvorming dat hogere resolutie, kwaliteit, gevoeligheid en verbeterde nauwkeurigheid van Western gegevens genereert.

De snelste West in de stad: Een eigentijdse variant op de klassieke Western Blot analyse

De vooruitgang van westerse blotting met behulp van fluorescentie heeft de detectie van subtiele veranderingen in eiwitexpressie mogelijk gemaakt, waardoor kwantitatieve analyses mogelijk zijn. Hier beschrijven we een robuuste methodologie voor de detectie van een reeks eiwitten in verschillende soorten en weefselsoorten. Er wordt ook een strategie geboden om veelvoorkomende technische problemen te overwinnen.

A Guide to Modern Kwantitatieve TL Western Blotting met Troubleshooting Strategies

Het onderzoeken van meerdere, kunnen endogene posttranslationele modificaties voor een eiwit-doelstelling zeer uitdagend. De hier beschreven technieken gebruiken een geoptimaliseerde lysis buffer en filter systeem ontwikkeld met specifieke PTM-targeting, affiniteit matrices te sporen van de acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 en tyrosine fosforylering wijzigingen voor een doel eiwit met behulp van een enkele, gestroomlijnde systeem.

Met behulp van een uitgebreide Immunoprecipitation verrijking systeem ter identificatie van het profiel van een endogene posttranslationele wijziging voor Target eiwitten

Deze methode beschrijft een robuuste en reproduceerbare aanpak voor het vergelijken van eiwitniveaus in verschillende weefsels en bij verschillende ontwikkelings timepoints met behulp van een kwantitatieve westelijke bevlekkende standaardbenadering.

Robuuste vergelijking van eiwitniveaus over weefsels en in de gehele ontwikkeling met behulp van gestandaardiseerde kwantitatieve westelijke bevlekken

Hier presenteren we een geautomatiseerde plasma-eiwit verteringsmethode voor massaspectrometrie gebaseerde kwantitatieve proteomische analyse. In dit protocol worden de vloeibare overdrachts- en incubatiestappen voor eiwitdenaturatie, reductie, alkylation en trypsine-spijsverteringsreacties gestroomlijnd en geautomatiseerd. Het duurt ongeveer vijf uur om een 96-well plaat met de gewenste precisie voor te bereiden.

Een plasmamonstervoorbereiding voor massaspectrometrie met behulp van een geautomatiseerd werkstation

Eerder werd al een systeem ontwikkeld voor de geautomatiseerde en snelle analyse van glycanen op eiwitten. Dit artikel presenteert het protocol voor "glyco-kwalitatieve analyse", geoptimaliseerd voor een breed spectrum van gebruikers, zoals degenen die zich bezighouden met het analyseren van glycaanstructuren in biofarmaceutica en andere glycoconjugaatmaterialen.

Snelle glyco-kwalitatieve beoordeling van recombinante eiwitten met behulp van een volledig geautomatiseerd systeem

Dit protocol standaardiseert SDS-PAGE-analyse voor gepersonaliseerde eiwitcoronaprofilering op nanodeeltjes, waardoor reproduceerbare, schaalbare en goedkope detectie van kankerspecifieke signaturen mogelijk is. Ontworpen voor vroege diagnose van pancreasductaal adenocarcinoom, biedt het een praktisch, GERUSTGESTELD alternatief voor complexe proteomische methoden in zowel onderzoek als klinische omgevingen.

Gestandaardiseerde SDS-PAGE workflow voor gepersonaliseerde eiwitcoronaprofilering bij vroege kankerdetectie

Leer de V3-workflow voor Western blotting met TGX stain-free gels voor betrouwbare eiwitkwantificering. Deze methode biedt een praktisch en transparant alternatief voor traditionele laadcontroles.

V3 Vlekvrije workflow voor een praktische, handige en betrouwbare totale eiwitbelastingscontrole in Western Blotting

Meer video's verkennen