V3 Vlekvrije workflow voor een praktische, handige en betrouwbare totale eiwitbelastingscontrole in Western Blotting
30 december 2013
V3 workflow is een westerse vlek procedure met behulp van vlekvrije gels. De vlekvrije technologie stelt onderzoekers in staat om de kwaliteit van eiwitscheiding te visualiseren, de overdrachtsefficiëntie te verifiëren en vooral om de verandering in het eiwit van belang te valideren met behulp van totale eiwitkwantificering als een betrouwbare belastingscontrole.
BioRad V three Workflow biedt onderzoekers een betrouwbaardere kwantificering en meer vertrouwen in het Western blotting proces. Dit wordt bereikt door eerst TGX stain-free gels te gebruiken om eiwitmonsters te scheiden en te visualiseren. Na scheiding worden de eiwitten overgebracht naar een membraan met behulp van het blot turbo rapid transfer systeem, dat verificatie van de overdrachtkwaliteit en -efficiëntie mogelijk maakt.
Na verificatie van de overdracht wordt het membraan geblokkeerd en geprobeerd met primaire en secundaire antilichamen voor de doeleiwitten. Ten slotte worden doeleiwitniveaus genormaliseerd met behulp van de stain-free totale eiwitmeting als ladingscontrole. De V three workflow brengt gemak en transparantie in het western blotting proces en biedt onderzoekers vertrouwen in elke stap, van scheiding tot overdracht en kwantificering.
Het belangrijkste voordeel van de V three Western workflow ten opzichte van traditioneel Western blotting is dat stain-free technologie een praktische, gemakkelijke en betrouwbare totale eiwitladingscontrole biedt voor het normaliseren van je doeleiwitsignalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot de betrouwbaarheid van ladingscontrolemethodologieën voor de Western blotting techniek die betrekking hebben op de verzadiging van housekeeping-eiwitsignalen en de differentiële expressieniveaus van housekeeping-eiwitten onder verschillende experimentele omstandigheden. We ontdekten dat eiwitten die in stain-free gels worden geactiveerd, ook op blos kunnen worden gevisualiseerd zonder verdere kleuring, waardoor ze kunnen worden gebruikt als alternatief voor conventionele totale eiwitkleuringen, evenals housekeeping-eiwitladingscontroles.
In de komende paar minuten zullen we de volledige V three workflow demonstreren met behulp van multiplex fluorescentie. Dezelfde procedure kan ook worden gebruikt voor chemiluminescentie na het voorbereiden van eiwitmonsters volgens het tekstprotocol. Gebruik een criterium TGX stain-free any KD voorgevormd gel, verwijder de kam en het plakband van de onderkant van de cassette.
Plaats de cassette in het gelapparaat en vul beide reservoirs met lopende buffers. Laad de eiwitstandaarden en monsters. Laat de gel vervolgens 20 minuten bij 300 volt lopen.
Nadat de elektroforese voltooid is, gebruikt u de cassetteopeningstool op het Criterion Cell-deksel om de cassette te openen. Breng vervolgens een paar milliliter water aan op de UV-transluminator van de Chemi Dock MP imager. Til voorzichtig de gel uit de cassette en plaats deze op de UV Trans Illuminator Launch Image Lab software en stel een nieuw enkelkanaalsprotocol in voor stain-free gels met behulp van de standaard één minuut gelactiveringstijd, selecteer het juiste geltype en standaard automatische optimalisatie voor intense bands.
Klik vervolgens op protocol uitvoeren. Zodra de beeldopname voltooid is, visualiseert u de scheiding en monsterskwaliteit. Ga dan onmiddellijk verder met de overdrachtstap.
Om eiwitoverdracht uit te voeren, opent u een transblock turbo MIDI PVDF-overdrachtspack. Plaats de onderste stapel in het midden van de cassettebasis. Verwijder het gel van de imager.
Lign het gel bovenop het membraan. Gebruik voorzichtig de blot-roller om luchtbellen tussen het gel en het membraan te verwijderen. Lijn vervolgens de bovenste stapel bovenop het gel uit.
Na het verwijderen van eventuele luchtbellen, plaatst u het cassettedeksel op de basis. Druk het deksel stevig naar beneden, draai de knop met de klok mee om te vergrendelen en plaats de cassette in een van de twee blotter bays. Selecteer vanaf het startscherm het turboprotocol.
Kies de twee mini of één mini gel en druk op de startknop voor de juiste bay. De overdracht is binnen zeven minuten voltooid. Verwijder de cassette uit de bay.
Ontgrendel de cassette en demonteer de blottingsandwich. Plaats het post-transfer gel op de UV-transluminator van de Chemi dock MP imager en plaats het membraan onmiddellijk in gedeïoniseerd water. Stel een nieuw enkelkanaalsprotocol in voor stain-free gels zonder activeringstijd.
Selecteer het juiste geltype en stel handmatig de belichtingstijd in op die van het vooraf overgedragen gel en klik op protocol uitvoeren. Zodra de beeldopname voltooid is. Verifieer de overdrachtsefficiëntie door de monsterbandintensiteiten te vergelijken tussen de voor- en na-overdracht gels.
Verwijder het gel uit de monsterschaal omdat het niet langer nodig is en gooi het weg. Om te verifiëren, overdracht naar de blot. Plaats het membraan op de monsterschaal en stel een nieuw enkelkanaalsprotocol in.
Voor stain-free blot. Selecteer het juiste geltype en standaard automatische optimalisatie voor intense bands. Klik vervolgens op protocol uitvoeren.
Zodra de beeldopname voltooid is, verifieer de overdracht naar het membraan. Verwijder de blot-membraan van de UV-trans illuminator en plaats deze in blokkeringsbuffer voor western blotting. Nadat het membraan een uur bij kamertemperatuur is geïncubeerd, incubeer het de volgende dag met muis en konijn primaire antilichamen gedurende één nacht bij vier graden Celsius.
Giet de antilichaamoplossing uit en gebruik 50 milliliter TBST om de blot vijf minuten te wassen. Incubeer de blot met fluorescerende geconjugeerde, anti-muse en anti-konijn secundaire antilichamen gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens de blot vijf keer vijf minuten met TBST.
Om de blot af te beelden, plaats deze op de UV-trans illuminator van de Chemi doc MP imager in Image Lab software. Stel een nieuw multikanaalsprotocol in. Configureer kanaal een door dite zes 50 te selecteren onder blot-toepassingen en gebruik de standaard automatische optimalisatie voor intense bands.
Herhaal deze stappen om kanalen twee en drie te configureren voor DITE 5 49 en stain-free blot respectievelijk. Selecteer het juiste geltype en klik op protocol uitvoeren. Om rijen te definiëren, selecteer de stain-free blot-afbeeldingsrij en -banden.
Vervolgens automatische rijenvinder voor nauwkeurige kwantificering. Zorg ervoor dat de achtergrondprofielen in elke monsterstrook vergelijkbaar zijn door de rolschijfgrootte aan te passen naar 70. Bevestig de uniformiteit van de achtergrond door alle strookprofielen te scannen om banden in zowel de dite zes 50- als 5 49-kanalen te definiëren.
Gebruik de bandvindertool om banden te detecteren met behulp van de standaard gevoeligheidsinstellingen. Om het normalisatiekanaal aan te wijzen, keer terug naar
Overzicht
De V3-workflow is een western blot-procedure die gebruikmaakt van stain-free gels, waardoor de visualisatie en kwantificering van eiwitten worden verbeterd. Deze methode maakt een betrouwbare loading-controle en verificatie van de efficiëntie van de eiwitoverdracht mogelijk.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Proteïneanalyse
Achtergrond
- Western blotting is een veelgebruikte techniek voor proteïneanalyse.
- Stain-free technologie verbetert de betrouwbaarheid van loading controls.
- Traditionele methoden kunnen last hebben van oververzadiging van housekeeping-proteïnen.
- De V3-workflow biedt een praktisch alternatief voor het kwantificeren van doeleiwitten.
Doel van de studie
- Om de V3-workflow voor western blotting te demonstreren.
- Om het gebruik van stain-free gels als ladingscontrole te valideren.
- Om het vertrouwen in methoden voor eiwitquantificatie te vergroten.
Gebruikte methoden
- Gebruik van TGX stain-free gels voor eiwitscheiding.
- Snelle overdracht van eiwitten naar membranen met behulp van het blot turbo-systeem.
- Blokkeren en incuberen van membranen met antilichamen voor doeleneiwitten.
- Normalisatie van doeleneiwitniveaus met behulp van stain-free totale eiwitmeting.
Belangrijkste resultaten
- Stain-free technologie maakt visualisatie mogelijk zonder aanvullende kleuring.
- De overdrachtsefficiëntie kan worden geverifieerd door gels vóór en na de overdracht te vergelijken.
- Normalisatie met stain-free gels verbetert de nauwkeurigheid van de kwantificering.
- De workflow vergroot de transparantie en het gemak bij western blotting.
Conclusies
- De V3-workflow biedt een betrouwbare methode voor eiwitanalyse.
- Stain-free gels dienen als effectieve laadcontroles.
- Deze methode pakt de beperkingen van traditionele western blotting-technieken aan.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
De V3 stain-free workflow pakt een kritieke flessenhals bij Western blotting aan door een praktische, kwantitatieve controle voor de totale eiwitbelading te bieden, waardoor validatie van housekeeping-eiwitten overbodig wordt. Dit verhoogt de betrouwbaarheid van de gegevens en versnelt de besluitvorming in workflows voor targetvalidatie en leadoptimalisatie, waarbij veranderingen in eiwitexpressie nauwkeurig gekwantificeerd moeten worden. Door real-time visualisatie van de gelkwaliteit, de transfer-efficiëntie en genormaliseerde targetsignalen mogelijk te maken, vermindert de workflow de experimentele onzekerheid en ondersteunt deze reproduceerbare preklinische target de-risking.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door nauwkeurige normalisatie van target-proteïneniveaus, zonder afhankelijkheid van potentieel variabele housekeeping-proteïnen.
- Operationele waarde: Vermindert de tijd die wordt besteed aan het strippen en opnieuw pollen van blots voor loading-controles, waardoor de doorvoersnelheid in target-validatie-assays wordt verhoogd.
- Predictieve waarde: Ondersteunt betrouwbare go/no-go-beslissingen door fout-positieven/negatieven als gevolg van inadequate normalisatie in pathway-analyse te minimaliseren.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarstaan van de assay: Biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar platform voor het bereiden van lysaten en het valideren van de monsterkwaliteit vóór de screening van verbindingen.
- Kwantitatieve output: Genereert kleurvrije metingen van het totale eiwitgehalte die dienen als universele laadcontrole, compatibel met multiplex fluorescentie- en chemiluminescentiedetectie.
- Schaalbaarheid: Compatibel met precast gels en snelle transfersystemen, waardoor integratie in geautomatiseerde of semi-geautomatiseerde Western blotting-workflows voor hit-bevestiging mogelijk is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Garandeert een consistente eiwitkwantificering van de ontdekkingsfase tot de preklinische validatie door variabiliteit te elimineren die wordt veroorzaakt door verschuivingen in de expressie van housekeeping-eiwitten onder stress- of behandelingscondities.
- Afstemming van biomarkers: Ondersteunt de betrouwbare detectie van translationele biomarkers waarbij normalisatie op basis van het totale eiwitgehalte verdient de voorkeur boven housekeeping-eiwitten die in ziektemodellen gemoduleerd kunnen worden.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Verhoogt het vertrouwen in preklinische werkzaamheidsgegevens door een gevalideerde normalisatiemethode te bieden die geen aparte validatie per experimentele conditie vereist.
Integratie van Pipeline & Workflow
De V3-workflow past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege target-engagement assays tot lead-optimalisatie, waarbij een nauwkeurige proteïnekwantificering essentieel is voor de bevestiging van het mechanisme en structurele activiteitsrelatie-studies (SAR).
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-toetsing door nauwkeurige meting van de modulatie van het doeleiwit mogelijk te maken als reactie op genetische of farmacologische verstoringen.
- Screening: Verhoogt de betrouwbaarheid van assays door de gelintegriteit en transfer-efficiëntie te verifiëren, waardoor wordt gegarandeerd dat door verbindingen geïnduceerde signalen werkelijke biologische veranderingen weerspiegelen.
- Analytiek: Levert genormaliseerde intensiteiten van eiwitbanden via Image Lab-software, wat directe vergelijking tussen behandelingsgroepen en tijdspunten mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert continuïteit naar preklinische studies door een methode voor ladingscontrole te bieden die robuust is voor variaties in experimentele condities die housekeeping-eiwitten beïnvloeden.
- Enterprise Reuse: Vertegenwoordigt een gestandaardiseerde, platformonafhankelijke capaciteit voor eiwitkwantificering die gedeeld kan worden tussen afdelingen en projecten zonder hervalidatie.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door een betrouwbare normalisatiemethode te bieden die niet wordt beïnvloed door experimentele modulatie van housekeeping-eiwitten.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en vermindert de tijd van directe handelingen door snelle stappen voor gelkleuring, transfer en imaging.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door het aantal mislukte experimenten als gevolg van gebrekkige normalisatie te verminderen en snellere iteraties in SAR-campagnes mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risicogewogen prioritering van targets door de datakwaliteit in vroege studies naar effectiviteit en werkingsmechanismen te verbeteren.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist ervaring met het hanteren van stain-free gels en UV-geactiveerde imaging-systemen, zoals de Chemi Doc MP imager.
- Afhankelijk van toegang tot Bio-Rad TGX stain-free gels en Blot Turbo transfer-systemen voor optimale prestaties.
- Maakt standaardisatie van Image Lab software-instellingen voor baan-detectie, achtergrondcorrectie en normalisatie tussen gebruikers noodzakelijk.
- Kan aanpassing vereisen bij het gebruik van niet-standaard gelpercentages of membraantypes, hoewel de flexibiliteit van het protocol is aangetoond voor zowel fluorescentie als chemiluminescentie.
- Beperkt door de noodzaak van UV-compatibele imagers; niet compatibel met standaard systemen die uitsluitend voor chemiluminescentie zijn bedoeld zonder image-capture functionaliteit.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:55
Gel Electrophoresis with Stain-free Gels and Ge Imaging
3:29
Protein Transfer with Trans-blot Turbo System and Antibody Incubation
6:32
Imaging and Calculating the Total Protein Normalization: Image Lab
8:53
Total Protein Normalization Results for MCM-7 in Irradiated Lymphoblastoid Cells
10:43
Conclusion
