Bone Marrow-afgeleide macrofagen Productie

Het algemene doel van deze procedure is om macrofagen te genereren uit urine, celculturen afgeleid van beenmerg. Dit wordt eerst bereikt door het beenmerg uit de achterpoten van muizen te extraheren. In de tweede stap worden de in het beenmerg aanwezige macrofagen verwijderd en vervolgens worden de beenmergcellen verder gekweekt onder macrofaag differentiatiecondities.

Wanneer de beenmergcellen zich vervolgens tot macrofagen hebben gedifferentieerd, kunnen ze worden verzameld voor experimentele analyse. Uiteindelijk kan confocale microscopie worden gebruikt om de lokalisatie van bacteriële LPS binnen de van beenmerg afgeleide macrofaag aan te tonen, en end acidische compartimenten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals het kweken van macrofagen, cellijnen, is dat er een groot aantal, dus primaire macrofagen, kan worden verkregen.

Visuele demonstratie van de methode is cruciaal omdat zelfproductiestappen moeilijk te leren zijn en oefening vereisen, en om succes te bereiken, Desinfecteer de huid van een geëuthanaseerd muis met 70%ethanol. Maak een insnijding aan de bovenkant van elke achterpoot en trek de huid naar beneden richting de voet om de spier bloot te leggen. Snijd vervolgens de achterpoten af en gebruik steriele schaar en pincetten.

Om de huid te verwijderen, plaats de poten in een steriele 35 millimeter petrischaal met vijf milliliter steriele ijs-koude PBS. Verwijder alle huid en spier die aan de botten zijn bevestigd en breng de botten vervolgens over in een nieuwe steriele petrischaal met vijf milliliter ijs.

Koude, steriele PBS. Was de botten twee keer met vijf milliliter meer PBS en breng ze vervolgens over in een steriele stamper met vijf milliliter ijs. Koude, steriele PBS.

Snijd nu de tibia van het femur bij de gewricht en gebruik een stamper om de botten voorzichtig te breken. Verzamel het supernatant drie keer in ijskoude 15 milliliter buizen. Filter vervolgens de weefselsuspensie door een 70 micron nylon celzeef.

Om de vaste fragmenten te verwijderen, centrifugeert u het filtraat en gooit u voorzichtig het supernatant weg. Dissocieer de pellet met erytrocytlysebuffer, voeg na 30 seconden 20 milliliter ijskoud compleet DMEM toe om de reactie te stoppen na het centrifugeren van de cellen, we suspenderen de pellet in 20 milliliter van 37 graden Celsius, compleet DMEM, en verdelen vervolgens de celsuspensie tussen twee 100 millimeter petrischalen. Incubeer de schalen vier uur bij 37 graden Celsius en verzamel vervolgens de supernatanten bij kamertemperatuur in 50 milliliter buizen.

Nadat het supernatant is gecentrifugeerd, suspendeert u de pellet opnieuw in 10 milliliter compleet DMEM aangevuld met de eerder bereide L 9 29 celsupernatant en filter vervolgens de cellen door een 40 micron nylon celzeef. Voeg het filtraat toe aan 140 milliliter compleet DMEM en L 9 29 celmedium, en verdeel vervolgens 10 milliliter van de celsuspensie per schaal in 15 100 millimeter petrischalen. Na de cellen drie dagen te hebben geïncubeerd bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide bij 10 milliliter compleet DMEM plus L 9 29 supernatant en incubeer de cellen nog eens vier dagen.

Controleer de celgroei periodiek met een omgekeerde microscoop om de van beenmerg afgeleide macrofagen te verzamelen, aspireer en gooi eerst het supernatant weg. Was vervolgens de petrischalen twee keer met compleet DMEM. Voeg vervolgens vijf milliliter 37 graden Celsius compleet DMEM toe en gebruik een rubberen politieagent om de cellen voorzichtig los te maken, verzamel de van beenmerg afgeleide macrofagen in 50 milliliter buizen en centrifugeer vervolgens de cellen.

Resuspendeer de pellets in 20 milliliter compleet DMEM. Tel tenslotte de cellen door tellen met trypanblauwe exclusie. Met deze methode kunnen grote aantallen macrofagen worden verkregen in slechts een paar dagen na het isoleren en plateren van de ronde niet-aderente beenmergcellen minus de in het beenmerg aanwezige macrofagen zoals zojuist is aangetoond.

Deze representatieve BMDM-precursorcellen werden geïncubeerd met G-M-C-S-F. Na drie dagen begonnen de cellen zich te hechten en differentiëren tot macrofagen. Na zeven dagen werd een confluente monolaag van beenmerg-afgeleide macrofagen waargenomen.

Flowcytometrische analyse voor F vier 80 en H-L-A-D-R toonde aan dat de beenmerg-afgeleide macrofagen beide markers tot expressie brachten, wat de differentiatie van de beenmergcellen tot macrofagen bevestigde. Om de PHA-acidische capaciteiten van de beenmerg-afgeleide macrofagen te beoordelen. De mogelijkheid van de cellen om latexsnelheden te internaliseren werd gemonitord zoals verwacht.

Het aantal kralen per cel werd bepaald om in de loop van de tijd te stijgen om hun endocytische potentieel te evalueren. De beenmerg-afgeleide macrofagen werden ook mede-gecultiveerd met Coxiella. Burnett eye LPS in rood werd waargenomen om gelokaliseerd te zijn in een compartiment dat lysosome-geassocieerd membraaneiwit een in blauw heeft, maar niet cathepsine D in groen, wat aantoont dat de LPS aanwezig was in de late endosomen, die niet kunnen fuseren met lysosome zoals verwacht van beenmerg-afgeleide macrofagen.

Bacteriele pathogeeninteracties werden verder geanalyseerd via hun infectie door TMA Wiley eye. Zoals verwacht, waren de bacteriën in rood niet gelokaliseerd in het compartiment dat KPS en D herbergt, dat weer in groen verschijnt. In deze representatieve immunoblot werden signaaltransductieroutes van beenmerg-afgeleide macrofagen beoordeeld, wat aantoont dat beenmerg-afgeleide macrofagen, net als weefsel, geïsoleerde macrofagen gefosforyleerde P 38 alfa map kinase niveaus verhogen als reactie op esia coli LPS-stimulatie.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van cellulaire microbiologie, zoals in welk intracellulair compartiment micro gelokaliseerd is.