Name: Het identificeren van eiwit-eiwit interactie in Drosophila Adult Heads door Tandem Affinity Purification (TAP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Leer eiwit-eiwit interacties identificeren in Drosophila volwassen hoofden met Tandem Affinity Purification. Deze methode maakt biochemische analyse mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek naar genfunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken EUROSARF voor het sturen van gist TAP expressie plasmiden. We zijn ook dankbaar voor redactionele hulp van Ryan Labadens. Dit werk werd ondersteund door een NIH / NINDS subsidie ​​(R01NS070962) naar CW

1. Genereer UAS-TAP gelabeld Transgene Flies <ol><li> Genereer pUAST-TAP-gelabeld DNA-constructen. <ol><li> Bepaal welke zijde (N-of C-terminus) van het aas eiwit de TAP tag moet worden gefuseerd, op basis van de proteïne structuur / functie. Zie de bespreking voor meer details. </li><li> Subkloneren van het cDNA coderende gebied van het gen van belang in de meervoudige kloneringsplaatsen (MCS) van de pUAST-NTAP of pUAST-CTAP vectoren N-of C-eindstandige-gemerkte UAS-transgenen TAP respectievelijk genereren. Zie Figuur 1 voor gedetailleerde kaarten en bruikbare restrictie sites en reading frames. </li></ol></li><li> Genereer UAS-TAP gelabeld transgene vliegen. <ol><li> Genereer transgene vliegen volgende standaardprotocollen met P-element bemiddelde inbrengen 11. Een aantal injectie services zijn commercieel verkrijgbaar. </li><li> Steek neuronale GAL4 driver (dwz BG380-GAL4) om elke afzonderlijke transgene lijn en bepalen de eiwitexpressieniveausIedere regel door Western blot (met peroxidase Anti-peroxidase-antilichaam) en / of immunokleuring (met anti-TAP-antilichaam). In het algemeen wordt een transgene lijn met een niveau van eiwitexpressie die dicht bij het endogene eiwit aanbevolen voor TAP procedures. Zie de bespreking voor meer details. </li><li> PerformGAL4/UAS-based rescue experimenten om de functionaliteit van de TAP-gelabeld transgenen bevestigen als verlies-van-functie mutanten van de genen van belang zijn beschikbaar. Kies een transgen dat nagenoeg mutantfenotypes voor volgende TAP experimenten redden. </li></ol></li></ol> 2. Bereid Monsters voor TAP Procedure <ol><li> Genereer een vlieg voorraad die zowel een neuronale GAL4 driver (bijv. BG380-Gal4) en de gekozen-TAP gelabeld transgen om uitbreiding van vliegen monsters gemak draagt. Verzamel de F1 nakomelingen van de GAL4 bestuurder en de UAS-transgen kruis in zeldzame gevallen waarin de bovenstaande combinatie veroorzaakt overleving en groei nadeel. &lt;/ Li&gt; <li> Verzamel kleine schaal monsters en optimaliseren lysis voorwaarde voor het oplosbaar maken van de TAP-gelabeld eiwit. <ol><li> Wordt reeks lysis buffers een combinatie van niet-ionogene detergentia NP-40 (0,1-1%), NaDOC (0,1-1%) en Triton X-100 (0,05-0,5%). Zie Tabel 1 en discussie voor meer gegevens. </li><li> Op de top van een CO2-pad, gebruik # 5 tang te ontleden 20 volwassen hoofden van de TAP transgen uitdrukken vliegen en verzamelen ze in een 1,5 ml buis aan elkaar lysebuffer conditie te testen. </li><li> Voeg 100 ul lysisbuffer testen aan de buis en homogeniseer de hoofden van strijken op en neer met een plastic stamper, voeg nog eens 100 ul buffer testen. </li><li> Draai de kop lysaat bij 21.500 xg gedurende 10 min (4 ° C), en scheiden het supernatant en pellet na centrifugeren. Voeg 25 ul 2x SDS beladingsbuffer respectievelijk de pellet en 10 ul 4x SDS laadbuffer tot 30 ul van supernatant. </li><li> Kook beide monsters gedurende 5 min en analyseren naast-Side met SDS-PAGE en daaropvolgende Western Blot met PAP antilichaam. Bepaal de oplosbaarheid van de verhouding van TAP-eiwitniveaus in supernatant vs de pellet. </li></ol></li><li> Bereid monster in grootschalige <ol><li> Openen en verzamel volwassen vliegen. <ol><li> Vouw de neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene voorraad in flessen en flip de flessen om de 3 dagen tot accumulerend 250 flessen worden gebruikt voor het verzamelen. </li><li> Verzamel 1-3 dagen oude volwassen vliegt in 50 ml conische buizen, zet de tube in vloeibare stikstof onmiddellijk diepvries de vliegen. Bewaar het vliegen in een -80 ° C vriezer. Merk op dat het volume van de vliegen niet hoger zijn dan 2/3 van de 50 ml buis. </li></ol></li><li> Verzamel fly hoofden (het uitvoeren van deze stap op de top van gepoederde droogijs). <ol><li> Haal de voorgekoeld zeven en de vijzel en stamper van de -80 ° C vriezer en leg ze op droog ijs, idealiter in een grote ijsemmer. Stapel twee VS standaard test zeven met een nr. 25 op the top en nr. 40 onderaan. </li><li> Neem de bevroren vliegt uit en drop ze in vloeibare stikstof en houden de vliegen daar voor ongeveer 10 minuten. Vortex of schud de buizen krachtig om de koppen, poten en vleugels breken met de lichamen. </li><li> Giet het mengsel op de bovenste zeef en schud de zeven krachtig terwijl elk van de zeven bij elkaar. Na zeven, zullen de lichamen blijven op de bovenste zeef, vliegen hoofden zal op de onderste zeef worden behouden, en poten, vleugels en ander vuil zal om het droogijs vallen. Scheid de twee zeven en zorgvuldig over te dragen de vlieg hoofden aan de koude mortel. </li></ol></li><li> Meng de vlieg hoofden <ol><li> Op de top van droog ijs, slijp de hoofden met de mortier en de stamper om poederachtige deeltjes, breng de poeder om een ​​15 ml glazen Dounce Tissue Grinder dat was voorgekoeld op ijs. </li><li> Meet de gewichten van de molen voor en na de kop monster erin werd gegoten, en bereken dan hoeveel het hoofd sample weegt. Een totaal van 6-15 gram vlieg koppen volstaat voor elke TAP experiment dienovereenkomstig aanpassend aan de expressieniveaus van het eiwit. Voeg 15 ml ijskoude homogenisatiebuffer (lysisbuffer geoptimaliseerd in stap 2.2) om het poeder en wrijf vervolgens met de grote ruimte stamper totdat het is gemakkelijk voor de stamper te gaan op en neer. Houd het glas molen op het ijs te allen tijde. </li></ol></li><li> Bereid de supernatant voor TAP <ol><li> Breng de homogenaat een snelle centrifugebuis en centrifugeren gedurende 20 min bij 50.000 xg ~ (4 ° C). Breng de bovenstaande om een ​​nieuwe high-speed centrifuge buis en herhaal het centrifugeren nog een keer. </li><li> Breng de bovenstaande om een ​​ultracentrifuge buis en het uitvoeren van een 40 min ~ 250.000 xg spin om het supernatant verder te wissen. De supernatant is klaar voor de tandem affiniteitszuivering procedures na ultracentrifugatie. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. TAP Zuivering </p&gt; De volgende secties werden afgeleid van de Seraphin lab TAP protocol 12 (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf ) <ol><li> Voer IgG kraal affiniteitzuivering <ol><li> Bereid IgG sepharose kralen terwijl de monsters worden gecentrifugeerd. Was 400 ul IgG kraal 3x in een 15 ml Falcon buis met 10 ml koud IgG wassen buffer. Voor elke wasbeurt, rock de buis zachtjes gedurende 2 minuten, en dan spin down de kralen aan 1000 xg gedurende 2 minuten. Aan het einde van de derde maal, verwijdert de buffer en slechts de korrels in de buis. </li><li> Breng zorgvuldig de heldere supernatant (~ 15 ml) in de 15 ml buis met de IgG kralen. Incubeer de kralen en hersenen lysaat mix bij 4 º C op een nutator gedurende 2 uur. </li><li> Opzetten van een schone en lege micro kolom met ongeveer 15 ml totaal volume in de koude kamer. Laad de IgG kraal mengsel door gestaag te gieten het mengsel in de kolom, probeer niet te vangen elkeluchtbellen in de kolom. Laat de kralen om zich te vestigen in de kolom en de buffer langzaam leeglopen door zwaartekracht. </li><li> Was de kolom grondig met 10 ml koud IgG wasbuffer na alle van de hersenen lysaat heeft stroomde door de vaste IgG kolom. Herhaal het wassen 2x. Opmerking: laat nooit de kraal aan de lucht in. </li></ol></li><li> Voer TEV decollete <ol><li> Na de derde wassen, spoel de kolom weer met 10 ml TEV decollete buffer. Deze stap bereidt de IgG kraal die het aas complex voor TEV decollete sequestrates. </li><li> Vlak voordat de laatste druppel TEV buffer over te druppelen uit, zet een cap op de bodem van de kolom om de stroom te blokkeren, voeg 1,3 ml TEV buffer die 130 eenheden TEV enzym aan de kolom en vervolgens veilig dop boven de kolom. Controleer de kolom goed afgedicht aan beide uiteinden. </li><li> Draai de kolom bij 18 º C gedurende 2 uur om de TEV enzym aan het peptide te splitsen op de TEV-site en laat het eiwitcomplex while achterlating van het proteïne A-domein peptide gebonden aan de IgG sepharose korrels. </li></ol></li><li> Voer Calmoduline kraal affiniteitzuivering <ol><li> Bereid de Calmodulin korrels terwijl de IgG korrels geïncubeerd met TEV enzym. Was 200 ul Calmodulin parels in een 15 ml Falcon buis 3x met telkens 10 ml koud Calmodulin binding buffer. Voor elke wasbeurt, schud de buis gedurende 2 minuten op een nutator, en dan spin down de kralen aan 1000 xg gedurende 2 minuten. Aan het einde van de derde maal, neem alles uit de buffer en laat alleen de kralen in de buis. </li><li> Aan het einde van de TEV incubatie (stap 3.2.3), de terugkeer van de kolom IgG terug naar de koude kamer en zet deze recht omhoog. Laat de kralen na gedurende 10 minuten. </li><li> Verwijder de dop en dan de onderste dop en verzamelen de 1,3 ml TEV decollete product in een 15 ml Falcon buis. Laat de buffer uitlekken volledig. Voeg een extra 200 ul TEV buffer om de kolom naar het dode volume van de kolom duwen, het verzamelen van de flow-out in dezelfde buis. </li><li> Voeg 4,5 ml van Calmodulin binding buffer en 4,5 ul 1 M CaCl2 aan de 1,5 ml TEV splitsingsproduct boven verzameld. De CaCl2 dient om de EDTA titreren van de TEV buffer. Breng de 6 ml mengsel aan de buis met de Calmodulin kralen en draai de buis bij 4 ° C op een nutator 1 uur. </li><li> Opgezet andere schone en lege micro kolom met ongeveer 10 ml totaal volume in de koude kamer. Laad de Calmoduline kraal mengsel aan de kolom en laat het uitlekken door de zwaartekracht. </li><li> Wanneer alle oplossing stroomde door vaste Calmodulin kolom, spoel de kolom tweemaal met elk 10 ml koud Calmodulin binding buffer. Opmerking: vermijd het verstoren van de Calmoduline kralen en proberen om het oppervlak van de bolletjes zo plat mogelijk tijdens het wassen te houden. </li></ol></li><li> Elueer het aas complex van Calmoduline kolom. Direct na het wassen, elueren de kolom Calmoduline met vijf fracties van 200 pi koude Calmodulin elutiebuffer. Voor elke fractie zachtjes voeg 200 ul elutiebuffer aan de kolom en verzamel het eluaat gemarkeerd met een 1,5 ml Eppendorf buis. Herhaal dit 4x. </li><li> Analyseer het eiwitcomplex door SDS-PAGE <ol><li> Neem een ​​kleine hoeveelheid van elk van de vijf fracties (ongeveer 30 ui) en voeg SDS laadbuffer. Kook de monsters gedurende 5 minuten en plaats de monsters side-by-side met eiwitten moleculaire merkers in een gradiënt (4-15%) SDS-PAGE gel. </li><li> Nadat de monsters volledig zijn opgelost in de gel, stop de elektroforese en vlekken op de gel met geen G-250-gebaseerde gevoelige colloïdale Coomassie kleuringen zoals &#39;blue zilver&#39; kleuring 13. Zilverkleuring is optioneel, maar niet de voorkeur omdat het niet volledig compatibel met de volgende massaspectrometrie. Bewaar de rest van het eluaat in een -80 ° C vriezer voor verdere analyse zoals massaspectrometrie voor het blootleggen van de moleculaire identiteit van het gezuiverde eiwit complex. See discussie. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+atlas+of+the+physical+interactome+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).</li>
<li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+survey+reveals+modularity+of+the+yeast+cell+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery.</a> Nature. 440, 631-636 (2006).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li>
<li>Forler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protein+complex+purification+method+for+functional+proteomics+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes.</a> Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).</li>
<li>Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+complexes+in+Drosophila+with+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).</li>
<li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+technology%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification technology: an overview.</a> Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).</li>
<li>Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+proteomics%3A+characterization+of+protein+complexes+using+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+method%3A+an+efficient+system+for+protein+complex+purification+and+protein+interaction+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification.</a> Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Bachmann, A., Knust, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+P-element+transposons+to+generate+transgenic+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of P-element transposons to generate transgenic flies.</a> Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Candiano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+silver%3A+a+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li>
<li>Tian, X., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ubiquitin-mediated+pathways+in+regulating+synaptic+development%2C+axonal+degeneration+and+regeneration%3A+insights+from+fly+and+worm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm.</a> J. Physiol. , (2013).</li>
<li>Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highwire+function+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+spatial%2C+structural%2C+and+temporal+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements.</a> J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).</li>
<li>Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DFsn+collaborates+with+Highwire+to+down-regulate+the+Wallenda%2FDLK+kinase+and+restrain+synaptic+terminal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth.</a> Neural Dev. 2, 16(2007).</li>
<li>Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Rae1+controls+the+abundance+of+the+ubiquitin+ligase+Highwire+in+post-mitotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).</li>
<li>Burckstummer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).</li>
<li>Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+affinity+purification+in+Drosophila%3A+the+advantages+of+the+GS-TAP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system.</a> Fly. 2, 229-235 (2008).</li>
<li>Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+interacting+partners+using+tandem+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification.</a> J. Vis. Exp. (60), e3643(2012).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+Angelman+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for Angelman syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).</li>
<li>Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+proteomics+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Shotgun proteomics in neuroscience.</a> Neuron. 63, 12-26 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Werkwijze tandem affiniteitszuivering (TAP) heeft een dubbele zuiveringsprotocol dat de isolatie en verrijking van eiwitcomplexen via twee onafhankelijke affiniteit zuiveringsstappen maakt. Het ontwerp van de TAP-tag is niet beperkt tot wat in dit protocol, andere proteïne bindende domeinen en motieven zijn ook van toepassing als bufferomstandigheden dienovereenkomstig aangepast. Een goed voorbeeld van andere TAP tags is het GS-TAP tag, een combinatie van een G-eiwit en een streptavidine-bindende motief, gemaakt door gr...

Het definiëren van de moleculaire pathways of netwerken die een bepaald biologisch proces bemiddelen is een van de uiteindelijke doelen van het biomedisch onderzoek. Vlieg genetici hebben zwaar afhankelijk van forward genetics, vooral modifier genetische screens (zowel enhancer en suppressor-schermen), factoren die samenwerken, parallel met, of stroomopwaarts of stroomafwaarts van een gen van belang te identificeren. Echter, forward genetics schermen vaak niet om essentiële genen te identificeren die, wanneer gemuteerd, veroorzaken dodelijkheid in vroege ontwikkelingsstadia, of genen met functionele redundantie en compensatie waarvan het verlies van de functie alleen leiden tot subtiele defecten die moeilijk om te scoren zijn. Een manier om deze moeilijkheid te overwinnen is het screenen op directe eiwit-eiwit interacties. Voor meer dan een decennium, een groeiende lijst van biochemische methoden, waaronder gist two-hybrid, faag display, chemische cross-linking, Co-IP, Tandem Affinity Purification (TAP), enz. zijn gebruikt om eiwitten te onderzoeken-Eiwit interacties. Elk van deze benaderingen heeft zijn eigen set van sterke en zwakke punten met betrekking tot de gevoeligheid en specificiteit. Onder hen, kan de TAP detectiemethode voor fysieke interactie onder nagenoeg fysiologische omstandigheden, behouden specificiteit en samenhang 2 en omvat de mogelijkheid om uit te breiden tot hoog-analyses 3,4. TAP methode werd oorspronkelijk ontwikkeld in gist door Rigautand collega 1. Bij deze werkwijze wordt een eiwit van interesse tot expressie met een TAP-tag. De TAP-label herbergt twee onafhankelijke affiniteit bindende domeinen: een eiwit Een domein dat bindt aan IgG en een-calmoduline bindend domein. De twee domeinen worden gescheiden door een TEV (Tobacco Etch Virus) splitsingsplaats. Een dergelijke combinatie zorgt voor twee onafhankelijke rondes van affiniteit zuiveringen voldoende niet-specifieke bindingen te verminderen en te verrijken specifieke bindingen 1. Voor dit geval, de TAP methode is een zeer krachtige methodiekd identificeren in vivo interactie van een bepaalde proteïne, hoewel overexpressie het exogene proteïne kan meer vatbaar voor koppelen met eiwitten die normaal niet complex met zijn endogene tegenhanger maken. Sinds de ontwikkeling, heeft de TAP methode is toegepast in vele andere systemen, waaronder cel-cultuur-gebaseerde systemen 5,6 en andere in vivo modellen voor de 6-9. Hier beschrijven we de aanpassing van de TAP methode in Drosophila. We hebben eerst genereren pUAST-NTAP en pUAST-CTAP vectoren klonering en fusie van de TAP-tag aan de N-of C-uiteinde van het gen van belang te vergemakkelijken. De UAS-TAP gelabeld transgen wordt vervolgens uitgedrukt in het zenuwstelsel onder controle van een neuronale GAL4 driver 10. Vervolgens zal een groot aantal volwassen vlieg koppen worden verzameld, die hoog gehalte aan neurale cellen en zijn gemakkelijk te scheiden van andere lichaamsdelen na bevriezing basis van grootte verschillen. De volwassen hoofden zijn gehomogeniseerd en opgeruimd by sequentiële centrifugeren, en het supernatant is onderworpen aan een hieronder beschreven TAP procedure.

<table><tbody><tr><td>U.S.A. standaardtestzeef No. 25</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-881-18</td><td></td></tr><tr><td>U.S.A. standaardtestzeef No. 40</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-881-21</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml</td><td>Kimble Chase</td><td>885300-0015</td><td></td></tr><tr><td>IgG sepharose kralen</td><td>Pharmacia</td><td>17-0969-01</td><td></td></tr><tr><td>Econo-column 0,7 cm x 20 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>737-4721</td><td></td></tr><tr><td>Econo-column 0,5 cm x 15 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>737-4716</td><td></td></tr><tr><td>Calmodulin kralen</td><td>Stratagene</td><td>214303</td><td></td></tr><tr><td>Coors Molen enstamper</td><td>CoorsTek</td><td>60311</td><td></td></tr><tr><td>AcTEV Protease</td><td>Invitrogen</td><td>12575-015</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Mix</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr></tbody></table>

het identificeren van eiwit-eiwit interactie in<em&gt; drosophila</em&gt; adult heads door tandem affinity purification (tap)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetische screens uitgevoerd met behulp van Drosophila melanogaster (fruitvlieg) hebben talloze mijlpaal ontdekkingen gedaan in de opmars van de biologische wetenschappen. Echter, het gebruik van biochemische schermen gericht op uitbreiding van de kennis die uit de genetische analyse werd pas onlangs ontdekt. Hier een methode beschrijven we aan het eiwitcomplex te zuiveren dat associeert met een eiwit van interesse van volwassen vlieg hoofden. Deze methode maakt gebruik van het Drosophila GAL4/UAS systeem lokaas eiwit gefuseerd met een Tandem Affinity Purification (TAP) tag in vlieg neuronen in vivo expressie en vervolgens worden twee ronden van zuivering met gebruik van een TAP werkwijze gelijk aan die oorspronkelijk vastgesteld gist 1 om de interacties eiwitcomplex zuiveren. Aan het einde van deze procedure wordt een mengsel van verschillende eiwitcomplexen verkregen waarvan de moleculaire identiteit kan worden bepaald door massaspectrometrie. Validatie van de kandidaat-eiwitten zullen profiteren van de resource en het gemak van het uitvoeren van verlies-van-functie studies in vliegen. Soortgelijke benaderingen kunnen worden toegepast op andere vliegen weefsels. Wij geloven dat de combinatie van genetische manipulaties en dit proteomics aanpak in de vlieg modelsysteem bezit een enorm potentieel voor de aanpak van fundamentele problemen op het gebied van de neurobiologie en daarbuiten.

Hier laten we onze inspanningen in het identificeren Highwire-interagerende eiwitten in de vlieg hersenen. Highwire (Hiw) en de gewervelde en ongewervelde homologen zijn enorm ubiquitine ligasen die de ontwikkeling en reparatie van het zenuwstelsel 14 reguleren. Ze delen een aantal zeer geconserveerde functionele domeinen. Echter, hun moleculaire acties niet geheel duidelijk. Werk in worm, vliegen en muizen leidde tot de huidige werkmodel dat Hiw functioneert als een E3 ligase en als een steiger eiwit om de v...

Drosophila is beroemd om zijn krachtige genetische manipulatie, maar niet voor de geschiktheid van diepgaande biochemische analyse. Hier presenteren wij een-TAP gebaseerde procedure tot interactie partners van een eiwit van belang te identificeren van de vlieg hersenen. Deze procedure kan mogelijk leiden tot nieuwe wegen van onderzoek.

Het identificeren van eiwit-eiwit interactie in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads door Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Het algemene doel van deze procedure is het zuiveren van de in vivo interagerende eiwitten van een gen van belang uit de volwassen hersenen van de fruitvlieg. Dit wordt bereikt door eerst transgene vliegen te genereren die het tap-getagde lokaaseiwit tot expressie brengen en de koppen van deze volwassen vliegen te verzamelen. De tweede stap bestaat uit het voorbereiden van het supernatant van het lysaat van de vliegenkop voor de tap-procedure, gevolgd door sequentiële immunoglobuline G-zuivering, TEV-splitsing en calmoduline-zuivering.De volgende vijf eluties werden verzameld uit de laatste stap van de tap-procedure, samen met het totale hersenlysaat en het proteïnecomplex. Na TEV-splitsing werden deze gescheiden via SDS-PAGE en gevisualiseerd met zilverkleuring. Uiteindelijk wordt de tweede elutie doorgaans onderworpen aan massaspectrometrie voor proteïne-identificatie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals TAL-hybride en core-IP-experimenten, is dat de eiwit-eiwitinteracties die door tap worden gedetecteerd plaatsvinden onder bijna fysiologische omstandigheden, wat helpt om de specificiteit van die interacties te behouden. Twee ron

identifying-protein-protein-interaction-drosophila-adult-heads-tandem

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een nieuwe kwantitatieve proteomics-techniek voor het identificeren van eiwitcomplexen in Saccharomyces cerevisiae. In deze studie hebben we gebruik gemaakt van de SILAC methode, samen met affiniteit zuivering, gevolgd door tandem massaspectrometrie te identificeren met een hoge specificiteit van de binding partners van een ER-eiwit, Scs2p.

Identificatie van eiwit-complexen met kwantitatieve proteomics in S. cerevisiae

Tandem Affinity Purification is een robuuste aanpak voor de identificatie van eiwitbinding partners. Als proof of concept, werd deze methode toegepast op de goed gekarakteriseerde translatie initiatie factor eIF4E van co-neerslag de gastheercel factoren die betrokken zijn in de vertaling initiatie. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast aan een cellulair of viraal eiwit.

Identificatie van eiwit Interactie partners met behulp van Tandem Affinity Purification

Affiniteitszuivering van gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM) is een krachtige methode voor systematische mapping van eiwit interactie netwerken en het onderzoeken van de mechanistische basis van biologische processen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit (SPA) APM procedure ontwikkeld voor de...

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

This video demonstrates tandem affinity purification — a technique to purify protein complexes from eukaryotic cells to study protein-protein interaction. The complex contains two proteins labeled with different epitope tags. Upon the purification of the complex using two resins with an affinity for the two different tags in a sequential manner, the presence of both proteins in the elute confirms the interaction between the two.

Tandem Affinity Purification Assay to Study Protein-Protein Interactions

This video demonstrates the visualization of protein-protein interactions at the Drosophila neuromuscular junction (NMJ) using Proximity Ligation Assay (PLA). After isolating the body walls, interacting proteins are probed with primary antibodies and PLA-conjugated secondary antibodies. The proximity of the interacting proteins facilitates the ligation of probes with connector oligonucleotides, forming circular DNA, which is then amplified by rolling circle amplification. Fluorescent probes...

Detection of Protein-Protein Interactions in Drosophila Larvae Using a Proximity Ligation Assay

Multi-component eiwitcomplexen spelen een cruciale rol tijdens de cellulaire functie en ontwikkeling. Hier beschrijven we een methode die wordt gebruikt voor de inheemse eiwitcomplexen isoleren van Drosophila embryo's na in vivo verknoping gevolgd door zuivering van het verknoopte complexen voor de volgende structuur-functie analyse.

Een In vivo Crosslinking Aanpak eiwitcomplexen te isoleren van Drosophila Embryo&#39;s

Met behulp van eiwit microarrays met bijna het hele S. cerevisiae proteoom wordt gesondeerd voor snelle onpartijdige ondervraging van duizenden proteïne-proteïne interacties in parallel. Deze werkwijze kan worden gebruikt voor eiwit-kleine molecule, posttranslationele modificatie, en andere assays high-throughput.

Probing hoge dichtheid functioneel eiwit Microarrays om eiwit-eiwit interacties Detect

MyoD is een myogene transcriptiefactor met een sterk vermogen om myogene transdifferentiatie van vele volledig gedifferentieerde niet-spiercellijnen te induceren. De epigenetische mechanismen die bij deze transdifferentiatie betrokken zijn, zijn grotendeels onbekend. Hier beschrijven we een methode voor dubbele affiniteitszuivering, gevolgd door massaspectrometrie, om MyoD-partners uitputtend te karakteriseren.

Identificatie van MyoD Interactoomanalyse gebruik van Tandem Affinity Purification Gekoppeld aan massaspectrometrie

De Tandem Affinity Purification (TAP) methode is veel gebruikt om native complexen te isoleren uit cellulaire extracten, voornamelijk eukaryotisch, voor proteomics. Hier presenteren we een TAP-methodeprotocol dat is geoptimaliseerd voor de zuivering van native complexen voor structurele studies.

Zuivering van Inheemse Complexen voor de structurele studie Met behulp van een Tandem Affinity Tag Method

We beschrijven hier een nieuwe, robuuste en efficiënte tandem affinity-zuivering (TAP) methode voor de expressie, isolatie en karakterisering van eiwitcomplexen uit eukaryote cellen. Dit protocol kan worden gebruikt voor de biochemische karakterisering van discrete complexen, evenals voor de identificatie van nieuwe interactoren en post-translationele modificaties die hun functie reguleren.

Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen

Het doel van dit protocol is om een ​​eenvoudige en goedkope aanpak te geven voor het verzamelen van Drosophila embryo's op middelgrote schaal (0,5-1 g) en het bereiden van eiwit extracten die kunnen worden toegepast in stroomafwaartse proteomische toepassingen, zoals affiniteitszuivering-massaspectrometrie (AP-MS ).

Middelgrote voorbereiding van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo Extracten voor Proteomische Experimenten

Leer eiwit-eiwit interacties identificeren in Drosophila volwassen hoofden met Tandem Affinity Purification. Deze methode maakt biochemische analyse mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek naar genfunctie.

Het identificeren van eiwit-eiwit interactie in

Meer video's verkennen