Cel Knijpen als een robuuste, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Het algemene doel van het falling-experiment is om macromoleculen zonder gebruik van vectoren in doelcellen af te leveren middels mechanische disruptie. Dit wordt bereikt door het doeltype cellen eerst in suspensie te brengen met het gewenste aflevermateriaal en dit te laden in het reservoir van een speciaal ontworpen microfluïdisch apparaat. In een tweede stap wordt het microfluïdische apparaat onder druk gezet, waardoor de cellen door een reeks microfluïdische kanalen worden geleid die de cellen samenpersen om tijdelijke membraandisruptie te faciliteren.

Vervolgens krijgen de cellen de tijd om te incuberen in aanwezigheid van het te leveren doelmateriaal om diffuus transport van het materiaal in het cytoplasma van de cel te vergemakkelijken, terwijl het celmembraan herstelt. Er worden resultaten behaald die een effectieve levering van macromoleculen aantonen met behulp van flowcytometrie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals electroporatie en lipofectie is dat deze in staat is om uitdagende celtypen en materialen aan te pakken die niet effectief via andere methoden kunnen worden afgeleverd. Deze methode kan cruciale vragen in het biologische veld beantwoorden, zoals hoe de herprogrammering van cellen kan worden verbeterd. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie en diagnose van kanker, omdat het systeem manipulatie van immuuncellen mogelijk maakt om hun anti-tumorwerking te verhogen.

Begin met het vervaardigen of aanschaffen van het microfluïdische apparaat, de houder voor het apparaat, de plastic vloeistofreservoirs en de O-ringen die hier worden getoond en waarvan de details in het bijbehorende tekstprotocol staan vermeld, en vul vervolgens drie afsluitbare containers gedeeltelijk met 70% ethanol. Plaats de apparaten in de eerste container, de reservoirs en O-ringen in de tweede container en de houders in de derde. Vul de containers vervolgens volledig aan met 70% ethanol.

Plaats vervolgens zowel de houder met de reservoirs en O-ringen als de houder met de klemmen gedurende vijf tot 10 minuten in een ultrasoonbad voor gebruik. Dit helpt om eventuele verontreinigende deeltjes uit eerdere experimenten te verwijderen terwijl de componenten worden gesoniceerd; maak ondertussen de werkruimte in een veiligheidskabinet schoon met 70% ethanol. Steriliseer daarna alle benodigde materialen, inclusief de drie houders en een pincet, door ze af te vegen met 70% ethanol en plaats ze in het veiligheidskabinet om met de assemblage te beginnen.

Plaats eerst twee tot drie pluisarme doekjes in het werkgebied. Verwijder vervolgens de plastic reservoirs met een pincet uit de ethanolcontainer en leg ze op de doekjes om de capillaire werking en de verdamping van ethanol van het binnenoppervlak te vergemakkelijken. Tik voorzichtig tegen de reservoirs om de verwijdering van de ethanoloplossing te bevorderen.

Gebruik indien nodig persgas om het reservoir volledig te spoelen. Zodra de reservoirs zijn opgedroogd, worden de O-ringen in de juiste gleuven van de reservoirs geplaatst. Gebruik vervolgens een pincet om de chip met de bovenzijde naar boven in de apparaathouder te plaatsen.

Zorg ervoor dat de chip plat in de houder ligt en pas dit indien nodig aan met de pincet. Als het apparaat niet correct in de houder past, bestaat het risico dat het tijdens de volgende stappen breekt. Plaats vervolgens voorzichtig de reservoirs op de houder en lijn ze uit met de klemmen.

Zorg ervoor dat de O-ringen niet uit hun sleuven vallen. Druk tijdens dit proces de reservoirs voorzichtig naar beneden totdat ze met een klik op hun plaats vallen. Controleer of beide zijden van de reservoirs stevig vastzitten en of de chip in de juiste positie lijkt te zitten.

Oefen geen overmatige druk uit op de reservoirs. De druk kan namelijk de chips voor primaire cellijnen of adhesieve cellijnen breken. Plaats de cellen één tot twee dagen vóór het experiment, zodat ze niet meer dan 80% confluent zijn.

Op de dag van het experiment. Oogst direct voor het experiment de cellen en resuspendeer deze in medium of een andere gewenste buffer op een concentratie tussen 1 en 10 miljoen cellen per milliliter. Leid de celsuspensie vervolgens voorzichtig door een 40 micron cell strainer mesh om te voorkomen dat celklonters en matrix het apparaat verstoppen.

Nadat het mengsel is gefilterd, werden 300 µL van de celsuspensie in een aparte buis gemengd met de gewenste concentratie van het aflevermateriaal. Voor deze demonstratie worden per 50 µL celsuspensie twee µL dextrine met een concentratie van 5 mg/mL en twee µL Alexa 488 isotoopcontrole-antilichaam toegevoegd.

Meng vervolgens voorzichtig 100 µL van de cellen door te pipetteren. Pipetteer daarna met behulp van gel-laadpunten de cellen en het leveringsmateriaal in een van de reservoirs, bevestig de drukslang aan het gevulde reservoir en draai de knop handvast aan om een goede afdichting te garanderen. Stel vervolgens de luchtdruk op de regulator in op 70 PSI om de snelheid waarmee de cellen door het apparaat bewegen te regelen.

De druk moet worden geoptimaliseerd voor de specifieke combinatie van cellen en microfluïdische chip die in elk experiment wordt gebruikt. Wanneer alles is voorbereid, brengt u het apparaat naar ooghoogte en oriënteert u het zodanig dat de vloeistof in het reservoir gemakkelijk zichtbaar is. Druk vervolgens op het drukknopventiel om het reservoir onder druk te zetten en de celstroom te starten.

Let op de snelheid waarmee de vloeistof uit het reservoir stroomt. Als de vloeistof aanzienlijk vertraagt ten opzichte van de initiële stroomsnelheid, is het gemonteerde apparaat waarschijnlijk verstopt en moet het worden vervangen. De verhoogde afschuifspanning veroorzaakt door de blokkade zal leiden tot een grotere celsterfte dan normaal.

Wanneer het vloeistofniveau ongeveer twee millimeter boven de bodem van het reservoir bevindt, draait u de regelaar snel naar 0 PSI om de stroom te stoppen. Het is belangrijk om de luchtstroom te stoppen voordat het reservoir leeg is, anders kan het monster uit het opvangreservoir worden geblazen. Verzamel vervolgens de behandelde cellen uit het uitlaatreservoir en plaats deze in een microcentrifugebuis.

Bij kamertemperatuur zullen de beladen cellen tot 10 minuten lang materiaal blijven opnemen. Na 10 minuten worden de cellen uitgeplaat met extra medium, of worden de cellen gebruikt volgens de experimentele behoeften. Herhaal deze stappen om voldoende behandelde cellen te verzamelen en vervang de chips indien deze verstopt raken; gooi de verstopte apparaten na elk volgend monster weg.

Wijzig de stroomrichting om verstoppingseffecten te minimaliseren. Wanneer de celopvang voltooid is, ontkoppel dan voorzichtig de reservoirs van de hoofdhouder door de klemarmen opzij te duwen. Plaats vervolgens elk onderdeel dat opnieuw gebruikt zal worden in de juiste bewaarbevanger en vul deze met verse 70% ethanol.

Plaats ten slotte alle gebruikte chips in een aparte container voor een correcte afvoer. De afleveringsefficiëntie en celviabiliteit van HeLa-cellen werden gemeten. Na een reeks experimenten werden drie verschillende microfluïdische chips getest bij een reeks snelheden tot 600 mm/s.

Deze tests toonden aan dat verhoogde stroomsnelheden de afgifte van fluorescentie-geconjugeerde dextrine van drie kilodalton in de cellen verbeterden voor elk van de geteste chips. Daarnaast zorgden de verhoogde snelheden er ook voor dat de celviabiliteit in de geteste apparaten met ongeveer 20% daalde. Deze hoeveelheid celdood is relatief laag en is in onjuist ontworpen apparaten vaak veel hoger.

De opname van Pacific blue-geconjugeerd dextrine in de controlecelpopulatie aan de linkerzijde is het resultaat van beperkte oppervlaktebinding en endocytotische effecten, aangezien de cellen gedurende dezelfde tijd aan het afleveringsmateriaal zijn blootgesteld als de behandelde cellen. Aan de rechterzijde is de populatie levende cellen te zien die door het microfluïdische apparaat bewegen terwijl ze zijn blootgesteld aan dezelfde concentratie dextrine als de controlecellen.

De cellen in het gearceerde gebied worden beschouwd als niet-geleverd, en de cellen rechts van de lijn worden gedefinieerd als geleverd. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in minder dan een uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals post-optometrische analyses, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over de leveringsefficiëntie en de functionaliteit van het materiaal na de ontwikkeling.

Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van regeneratieve geneeskunde om celprogrammering in volwassen primaire cellen te onderzoeken middels directe proteïne-aflevering. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het zelfknijpende systeem moet opzetten en bedienen voor uw gewenste toepassing.