Cel Knijpen als een robuuste, Microfluidic Intracellular Delivery Platform
7 november 2013
Rapid mechanische vervorming van de cellen heeft ontpopt als een veelbelovende,-vector vrije methode voor intracellulaire levering van macromoleculen en nanomaterialen. Dit protocol biedt gedetailleerde stappen over hoe het systeem te gebruiken voor een breed scala aan toepassingen.
Het algemene doel van het valexperiment is om macromoleculen vectorvrij af te leveren aan doelcellen met behulp van mechanische verstoring. Dit wordt bereikt door eerst het doelceltype in suspensie te plaatsen met het gewenste afleveringsmateriaal en het in het reservoir van een speciaal ontworpen microfluïdisch apparaat te laden. Als tweede stap wordt het microfluïdisch apparaat onder druk gezet en worden de cellen door een reeks microfluïdische kanalen gedreven die de cellen knijpen om tijdelijke membraanverstoring te vergemakkelijken.
Vervolgens worden de cellen gedurende een bepaalde tijd in aanwezigheid van het doelafleveringsmateriaal ingecubeerd om diffuus transport van het materiaal in het celcytoplasma te vergemakkelijken. Terwijl de celmembraan wordt hersteld. Resultaten worden verkregen die effectieve aflevering van macromoleculen laten zien door het gebruik van flowcytometrie.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals ation en lipo perfectie, is dat het in staat is om uitdagende celtypen en materialen aan te pakken die niet effectief kunnen worden afgeleverd door andere methoden. Deze methode kan sleutelvraagstukken in het biologische veld beantwoorden, zoals hoe cellen re programmeren kunnen worden verbeterd. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de therapie en diagnose van kanker omdat het systeem manipulatie van immuuncellen mogelijk maakt om hun antitumor effectiviteit te verbeteren.
Om te beginnen, fabriceer of koop het microfluïdisch apparaat, apparaathouder, plastic vloeistof reservoirs en O-ringen zoals hier getoond en vermeld met details in het bijbehorende tekstprotocol, vul vervolgens drie afsluitbare containers gedeeltelijk met 70%ethanol. Plaats de apparaten in de eerste container, de reservoirs en O-ringen in de tweede container en houders in de derde. Vul vervolgens de containers voor de rest van de weg met 70%ethanol.
Plaats vervolgens de container met de reservoirs en O-ringen evenals degene met de houders in een ultrasone bad gedurende vijf tot tien minuten voor gebruik. Dit helpt om eventuele verontreinigende deeltjes uit eerdere experimenten te verwijderen terwijl de component het werkgebied in een bioveiligheidskabinet met 70%ethanol sonische afveegt. Steriliseer vervolgens al het benodigde materiaal, inclusief de drie containers en een paar pincetten, door ze af te vegen met 70%ethanol en plaats ze in het bioveiligheidskabinet om met de montage te beginnen.
Leg eerst twee tot drie weinig pluizende doekjes in het werkgebied. Verwijder vervolgens de plastic reservoirs uit de ethanolcontainer met behulp van pincetten en leg ze op de doekjes om het wegsijpelen en verdampen van ethanol van de binnenoppervlakte te vergemakkelijken. Tik voorzichtig op de reservoirs om de verwijdering van de ethanoloplossing te helpen.
Gebruik indien nodig perslucht om de reservoir volledig te ontluchten. Zodra de reservoirs droog zijn, plaats de O-ringen in de juiste gleuven op de reservoirs. Gebruik vervolgens pincetten om de chip met de kant omhoog in de apparaathouder te plaatsen.
Zorg ervoor dat de chip plat in de houder ligt en pas indien nodig aan met behulp van de pincetten. Als het apparaat niet goed past in zijn houder, bestaat het risico dat het tijdens de volgende stappen breekt. Plaats vervolgens voorzichtig de reservoirs op de houder en lijn ze uit met de clips.
Zorg ervoor dat de O-ringen niet uit hun gleuven vallen. Druk tijdens dit proces voorzichtig op de reservoirs totdat ze op hun plaats klikken. Zorg ervoor dat beide zijden van de reservoirs veilig zijn en dat de chip zich in de juiste positie lijkt te bevinden.
Druk niet met overmatige kracht op de reservoirs. Omdat de druk de chips voor primaire of adhesie kan breken. Cellijnen, plaats cellen één tot twee dagen voor het experiment zodat ze niet meer dan 80%confluent zijn.
Op de dag van het experiment. Direct voorafgaand aan het experiment, oogst de cellen en suspendeer ze in media of een andere gewenste buffer bij tussen een en tien miljoen cellen per milliliter. Haal vervolgens voorzichtig de celsuspensie door een 40 micron celzeef mesh om klonten van cellen en matrix te voorkomen die het apparaat verstoppen.
Na het zeven, meng 300 microliter van de celsuspensie met de gewenste concentratie afleveringsmateriaal in een aparte buis. Voor deze demonstratie worden twee microliters dextrine bij vijf milligram per milliliter en twee microliters Alexa. 4 88 isotoopcontrole antilichaam toegevoegd per 50 microliter celsuspensie.
Meng vervolgens voorzichtig 100 microliter van de cellen door pipetteren. Pipet vervolgens met behulp van gelbelasting tips de cellen en het afleveringsmateriaal in een van de reservoirs, bevestig drukbuis naar het gevulde reservoir en draai de knoopvinger vast om een goede plafond te garanderen. Pas vervolgens de luchtdruk aan op 70 PSI op de regulator om de snelheid te regelen waarmee cellen door het apparaat reizen.
De druk moet worden geoptimaliseerd voor de specifieke cel- en microfluïdische chipcombinatie die in elk experiment wordt gebruikt. Met alles voorbereid, breng het apparaat op ooghoogte en oriënteer het zodat de vloeistof in het reservoir gemakkelijk zichtbaar is. Druk vervolgens op de drukknop klep om het reservoir onder druk te zetten en het celstroming te beginnen.
Let op de snelheid waarmee de vloeistof uit het reservoir stroomt. Als de vloeistof aanzienlijk langzamer wordt in verhouding tot de oorspronkelijke stroomsnelheid, is het gemonteerde apparaat waarschijnlijk verstopt en moet het worden vervangen. De verhoogde schuifspanning veroorzaakt door de blokkade zal groter dan normaal celdood veroorzaken.
Wanneer het vloeistofniveau ongeveer twee millimeter van de bodem van het reservoir is, draai snel de regulator naar nul PSI om de stroom te stoppen. Het is belangrijk om de luchtstroom te stoppen voordat het reservoir leeg is, anders kan het monster uit het opvangreservoir worden geëjecteerd. Verzamel vervolgens de behandelde cellen uit het uitstroomreservoir en plaats ze in een microcentrifugebuis.
Bij kamertemperatuur zullen de behandelde cellen materiaal blijven opnemen tot maximaal 10 minuten. Na 10 minuten, plateer de cellen met extra media of ga door met het gebruik van de cellen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor vector-vrije aflevering van macromoleculen in doelcellen door middel van snelle mechanische vervorming. Het protocol beschrijft het gebruik van een microfluïdisch apparaat om dit proces te vergemakkelijken.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Microfluïdica
- Intracellulaire afleveringstechnieken
Achtergrond
- Mechanische verstoring biedt een nieuwe benadering voor het afleveren van materialen in cellen.
- Deze methode kan moeilijke celtypen targeten die moeilijk te transfecteren zijn.
- Het heeft potentiële toepassingen in kankertherapie en manipulatie van immuuncellen.
- Flowcytometrie wordt gebruikt om de effectiviteit van de aflevering te beoordelen.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor efficiënte intracellulaire aflevering van macromoleculen.
- Om het begrip van cel-reprogrammeringstechnieken te verbeteren.
- Om de therapeutische werkzaamheid van immuuncellen tegen tumoren te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Fabricage en sterilisatie van een microfluïdisch apparaat.
- Bereiding van celsuspensies en afleveringsmaterialen.
- Drukverhoging van het microfluïdisch apparaat om celvervorming te induceren.
- Flowcytometrie-analyse om het succes van de aflevering te evalueren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle aflevering van macromoleculen in doelcellen werd bereikt.
- Flowcytometrie bevestigde effectieve intracellulaire opname.
- De methode toonde voordelen ten opzichte van traditionele afleveringstechnieken.
- Potentiële toepassingen in kankerbehandeling werden benadrukt.
Conclusies
- Deze mechanische afleveringsmethode is een veelbelovend alternatief voor moeilijke celtypen.
- Het opent nieuwe wegen voor onderzoek naar cellulaire manipulatie en therapie.
- Verdere studies zijn nodig om de techniek te optimaliseren voor verschillende toepassingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Vector-free intracellular delivery remains a critical bottleneck in therapeutic development, particularly for primary immune cells and hard-to-transfect cell types. This microfluidic squeezing platform enables direct cytosolic delivery of macromolecules and nanomaterials without chemical modification or specialized buffers, reducing mechanistic ambiguity in target validation. By improving delivery efficiency in challenging systems, the method supports predictive confidence in early discovery and de-risks translational pathways for immunotherapy and regenerative medicine applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of therapeutic hypotheses in primary immune cells and reprogramming models.
- Operational Value: Provides a reproducible, buffer-free system for delivering transcription factors, antibodies, or nucleic acids to assess target engagement.
- Predictive Value: Supports go/no-go decisions by confirming intracellular delivery of effector molecules prior to functional assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, flow-cytometry-based readouts of delivery efficiency across cell types and material concentrations.
- Operational Value: Standardizes sample preparation through controlled shear rates and device geometry, minimizing variability in high-throughput screens.
- Assay Readiness: Outputs delivery percentage and viability metrics that enable compound or material ranking in lead identification workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-scale immune cell modulation to preclinical evaluation of enhanced anti-tumor efficacy.
- Mechanistic De-risking: Confirms cytosolic delivery of immunomodulatory proteins, reducing reliance on endogenous expression systems.
- Disease-Relevant Systems: Supports testing in primary T cells, dendritic cells, and stem cells relevant to cancer immunotherapy and regenerative medicine.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing in early biology, assay-ready sample generation for screening, and mechanistic validation prior to in vivo studies.
- Discovery Biology: Facilitates target validation by delivering CRISPR components, siRNAs, or antibodies to confirm pathway involvement in immune activation or cell fate.
- Screening: Delivers libraries of nanomaterials or peptides to immune cells for uptake and functional screening under standardized shear conditions.
- Analytics: Provides flow cytometry-derived delivery efficiency and viability percentages as quantitative endpoints for condition comparison.
- Translational Research: Enables preclinical testing of engineered immune cells with delivered payloads to assess tumor-killing activity in co-culture models.
- Enterprise Reuse: Platform design allows reuse across cell types and payloads with only pressure and chip optimization, supporting scalable deployment in discovery and process development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces false negatives in target validation by achieving delivery in primary and non-dividing cells where viral or lipid-based methods fail.
- Operational Value: Eliminates need for payload conjugation, specialized buffers, or viral production, simplifying workflow and reducing cost per condition.
- Strategic Value: Increases confidence in early-stage immunomodulatory candidates by confirming intracellular delivery before resource-intensive animal studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of delivery-dependent biologics, such as cytokine engagers or transcription factor therapies, based on achievable cytosolic concentrations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, cell suspension preparation, and pressure regulation to avoid clogging or excessive shear-induced death.
- Depends on access to microfluidic chips, pressure regulators, reservoir systems, and flow cytometry for readout; compatible with standard biosafety cabinet workflows.
- Necessitates standardization of cell concentration (1–10 million/mL), pre-straining through 40 µm filters, and incubation time (≤10 min post-delivery) for reproducibility across users and sites.
- Requires optimization of pressure (e.g., 70 PSI) and flow speed per cell type and chip design to balance delivery efficiency and viability, with viability loss typically <20% under optimized conditions.
- Limited by potential clogging from aggregates or debris, necessitating cell straining and regular chip exchange; performance varies with cell size, membrane stiffness, and payload molecular weight.
