Kwantitatieve Optische Microscopie: Meting van Cellulaire biofysische eigenschappen met een standaard optische microscoop
7 april 2014
We beschrijven het gebruik van een standaard optisch microscoop om kwantitatieve metingen van cellulaire massa, volume en dichtheid uit te voeren door een combinatie van lichtveld en differentiële interferentiecontrast beeldvorming.
Het algemene doel van deze procedure is om fundamentele fysieke kenmerken van cellulaire monsters te kwantificeren, inclusief massa en volume, met een standaard optische microscoop en beeldverwerking. Dit wordt bereikt door eerst cellulaire monsters, die op glazen deksels zijn gekweekt, op microscoopglaasjes te monteren. Vervolgens worden door focus helderveld en differentiële interferentiecontrast beelden verkregen.
Vervolgens wordt elke Z-stack van afbeeldingen ingevoerd in afzonderlijke MATLAB-beeldverwerkingsprogramma's die de fysieke gegevens extraheren. Uiteindelijk worden de fundamentele fysieke eigenschappen van cellulaire monsters verkregen met behulp van door focus intensiteitsmetingen, onder helderveldcontrast en differentiële interferentiecontrastmicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals fluorescentiemicroscopie, is dat cellulaire monsters niet hoeven te worden gefixeerd, gepermeeerd of gekleurd.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van celbiologie, zoals hoe subcellulaire dichtheid is georganiseerd tijdens de celcyclus of tussen verschillende celpopulaties die bijdragen aan een ziektetoestand. Gebruik een microscoop met zowel DIC- als helderveldcapaciteiten en aanvullende specificaties volgens het tekstprotocol begin met het openen van slide book-software en het maken van een nieuwe slide voor beeldacquisitie. Open vervolgens het focusvenster en selecteer onder de filterset-sectie DIC Op het scope-tabblad onder de condensorsectie, stel de openingsschuifregelaar naar de verste rechter positie. Dit zorgt voor hoge numerieke apertuurverlichting en verbetert het optisch secteren van het monster.
Na het vastleggen van een DIC-stack van het monster, opent u het focusvenster en selecteert u open. Onder de filterset-sectie, stelt u de openingsschuifregelaar naar de verste linker positie geheel gesloten om lage NA-verlichting te bieden. Na aanpassing van de signaalintensiteit, opent u het beeldvastleggingsvenster.
De 3D-vastleggingsinstellingen van de DICZ-stack-acquisitie worden weergegeven in de filterset-sectie van het beeldvastleggingsvenster. Vink het open vakje aan en specificeer de belichtingstijd. In de sectie beeldinformatie, noemt u het beeld en selecteert u start om de Zack-beeldacquisitie te starten.
Exporteer vervolgens de Z-stacks volgens het tekstprotocol om volumemetingen uit te voeren in het H-T-D-I-C MATLAB-programma genaamd JoVE HT DCO V one M Onder sectie nul, werkt u de variabele afhankelijkhedenmap bij door de map te kopiëren en plakken die de hilbert. Transform DM en sobel edge Detect M-bestanden bevat vanuit de verkenner. Tussen de enkele aanhalingstekens na afhankelijkhedenmap gelijk is, voer sectie nul van het joco HT DCO V one M-programma uit.
In sectie één, werkt u de afbeeldingenmap bij door de map te kopiëren en te plakken die de door focus afbeeldingen in dot TIF-formaat bevat. Tussen de enkele aanhalingstekens voert u deze sectie slechts één keer uit om afbeeldingen uit te lijnen en te roteren. Voor hilbert transformeert u sectie twee van de code Een dialoogvenster met de titel HT DIC-parameters definiëren verschijnt.
Voer vervolgens het focale vlaknummer in waarop de DIC-afbeelding van het monster scherp staat, de laterale resolutie, de axiale resolutie, de rotatiehoek van de DIC-afbeelding die nodig is om de hilbert-transformatie uit te voeren, en ten slotte de grootte van het gebied van belang. Klik vervolgens op OK. Een afbeelding van het DIC-focaal vlak gespecificeerd door het focale vlaknummer verschijnt met een blauwe vak.
Plaats het vak over het kenmerk van belang, zoals een cel. Zodra het vak over het gewenste gebied is geplaatst, dubbelklik binnenin de B. De contrast van het beeld moet zodanig zijn dat donkere kenmerken links verschijnen terwijl heldere kenmerken rechts verschijnen. Sleep het blauwe vak over het gebied van belang en vorm het zo nodig om.
Vervolgens, onder sectie drie, om een rechthoekige masker te genereren, geeft u commentaar op regel 1 6 7 en geeft u commentaar op regel 1 7 0. Voer sectie drie van het programma uit door in het beeld te klikken en de muis te slepen om het rechthoekige masker te definiëren. Dubbelklik vervolgens op het vak om het te accepteren. Om een handgetekend masker te genereren, geeft u commentaar op regel 1 6 7 en geeft u geen commentaar op regel 1 7 0 voordat u sectie drie uitvoert. Door te klikken en met de muis het gewenste masker te tekenen, dubbelklikt u op de masker om het te accepteren. Sectie vier, om hilbert-getransformeerde beeldstacks te construeren volgens het tekstprotocol, voert u sectie vijf uit.
Om de beeldafscheiding van de xz dwarsdoorsnede-afbeeldingen van het gebied van belang te optimaliseren. Figuur 500 geproduceerd door het programma verschijnt en toont drie verschillende soorten contrast. Het succes van het algoritme om de randen van de cel te vinden, is afhankelijk van een combinatie van het gebruikte masker en de waarde van de drempel op regel 2, 2, 9 van het programma. Begin met een waarde van 0,5 en pas de waarde van de drempel aan en voer deze sectie van het programma opnieuw uit totdat de juiste omtrekking is bereikt in een van de kolommen.
Als de omtrekking het beste was in kolom één, in DIC-segmentatie, gebruikt u sectie zes om het volume te bepalen. Als kolom twee optimale resultaten opleverde, voert u sectie zeven uit om het celvolume van hilbert, transformeert u DIC-beeldmateriaal. Als kolom drie de optimale resultaten opleverde, gebruikt u voorgefilterde hilbert-transformatie DIC-beeldmateriaal terwijl u sectie acht uitvoert om het volume te bepalen voor het nemen van massametingen in het NIQ PM MATLAB-programma en getiteld JO VCO NI qpm V1 M Onder sectie nul. Werk de locatie van de drie mappen afhankelijkheden, BRIGHTFIELD en DIC-map bij na het uitvoeren van sectie één, voert u sectie twee uit in het dialoogvenster getiteld N-I-Q-P-M-parameters definiëren. Voer het focale vlaknummer in waarop de helderveld
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode om cellulaire massa, volume en dichtheid te kwantificeren met behulp van een standaard optische microscoop. De techniek combineert helder veld en differentiële interferentiecontrast beeldvorming om nauwkeurige metingen te verkrijgen zonder de noodzaak voor specimen fixatie of kleuring.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Cellulaire biologie
- Microscopietechnieken
- Beeldverwerking
Achtergrond
- Het kwantificeren van fysische eigenschappen van cellen is essentieel voor verschillende biologische studies.
- Traditionele methoden vereisen vaak fixatie of kleuring, wat cellulaire eigenschappen kan veranderen.
- Deze methode maakt gebruik van niet-invasieve beeldvormingstechnieken.
- Helder veld en differentiële interferentiecontrast microscopie leveren heldere beelden van levende cellen op.
Doel van het onderzoek
- Om een techniek te ontwikkelen voor het meten van cellulaire massa, volume en dichtheid.
- Om de voordelen van het gebruik van standaard optische microscopie boven fluorescentiemicroscopie aan te tonen.
- Om een methode te bieden die geen celfixatie of kleuring vereist.
Gebruikte methoden
- Cellulaire specimens op glazen dekvlakken monteren.
- Door focus helder veld en differentiële interferentiecontrast beelden verkrijgen.
- Z stack beelden invoeren in MATLAB voor beeldverwerking.
- Fysische gegevens extraheren uit intensiteitsmetingen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van cellulaire massa, volume en dichtheid.
- De effectiviteit van de beeldvormingstechniek aangetoond.
- Een niet-invasieve methode voor het analyseren van levende cellen geboden.
- De voordelen ten opzichte van traditionele methoden gehighlight.
Conclusies
- Deze methode maakt nauwkeurige metingen van cellulaire eigenschappen mogelijk zonder de cellen te veranderen.
- Het opent nieuwe wegen voor het bestuderen van dynamische processen in levende cellen.
- De techniek kan worden toegepast in verschillende biologische onderzoeksvelden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative optical microscopy using standard equipment enables direct measurement of cellular mass, volume, and density without fixation or staining, supporting high-fidelity biological interrogation. This capability enhances predictive confidence in early discovery and target validation by providing robust, label-free biophysical data. The approach is particularly relevant for portfolio triage and mechanistic de-risking where live-cell physical properties inform go/no-go decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of subcellular density and mass distribution in live cells.
- Supports functional target validation by correlating physical cell states with biological hypotheses.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct measurement of cellular biophysical features.
- Improves predictive confidence for early-stage portfolio decisions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, label-free biological systems for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for assay standardization and benchmarking.
- Enables reliable evaluation of compound effects on cell mass and volume.
- Supports scalability and platform reuse with off-the-shelf microscope compatibility.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biophysical measurements with disease-relevant cellular phenotypes when applicable.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling non-destructive analysis.
- Reduces risk in translational studies by supporting label-free, quantitative endpoints.
- Offers predictive de-risking value for preclinical model selection.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical research, leveraging standard optical microscopy infrastructure.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via quantitative mass and density mapping.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible, and quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Generates robust measurements and statistical outputs for cross-condition comparison.
- Translational Research: Enables non-destructive, quantitative endpoints for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, accessible capability for diverse cell-based R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows using commercial microscopes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust biophysical data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical microscopy and image processing.
- Needs access to standard brightfield and DIC-equipped microscopes and MATLAB-based analysis tools.
- Demands cross-team standardization of imaging and analysis protocols for reproducibility.
- Adaptation may be limited by specimen size (0.2–10 μm for NIQPM, up to 20 μm for HTDIC) and acquisition speed.
- Temporal resolution is constrained by z-stack acquisition rates on commercial microscopes.
