Name: Kwantitatieve Optische Microscopie: Meting van Cellulaire biofysische eigenschappen met een standaard optische microscoop (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Leer hoe u celmassa, volume en dichtheid kwantificeert met een standaard optische microscoop en beeldverwerking in MATLAB. Deze niet-invasieve methode werkt zonder fixatie of kleuring.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (U54CA143906 naar KGP, OJTM en R01HL101972 te OJTM) en een Oregon Medical Research Foundation Early Clinical Investigator Award (KGP). OJTM is een American Heart Association Established Investigator (13EIA12630000). Wij danken dr. Eric Anderson van de Ridder Cancer Institute voor het bereiden van cel samples gebruikt in dit werk.

1. Microscoop Specificaties Om beeldvorming uit te voeren op de juiste wijze de microscoop moet aan de volgende specificaties: <ol><li> Bezitten zowel differentieel interferentie contrast (DIC) en helderveld (BF) contrast. </li><li> Laat computergestuurde z-as beweging. </li><li> Hebben een verstelbare opening halte naar de condensor lens numerieke lensopening te variëren. Een opening met een gegradeerde regel of elektronische uitlezing moet de waarde van de numerieke apertuur kennen. De numerieke apertuur uiteen van 0,1 tot NIQPM tot 0.9 (of hoger) voor HTDIC. </li><li> De microscoop moet een smalle band kleur filter moet worden gebruikt voor helderveld beeldvorming. Dit filter is vereist om de refractie-increment, een golflengte-afhankelijke facture gebruikt om fase omzetten massadichtheid voor NIQP vast. </li></ol> 2. Differentieel Interferentie Contrast (DIC) Z-stack Acquisitie <ol><li> Open de SlideBook software eennd een nieuwe dia voor het verzamelen. </li><li> Open vervolgens de Focus Window. Selecteer DIC onder de sectie Filter Set. Op het tabblad Bereik in de sectie condensor, past de schuifbalk Aperture naar de verste juiste positie (helemaal open). Dit zorgt voor een hoge numerieke apertuur verlichting en verbetert de optische sectie van het monster. </li><li> Focus op het monster met behulp van een DIC doelstelling. Stel de halogeenlamp intensiteit totdat het monster goed zichtbaar. Om ervoor te zorgen de camera niet wordt verzadigd is, selecteert u het tabblad Camera in de Focus Venster en controleer of het histogram van pixel intensiteiten binnen het dynamische bereik van de camera. </li><li> Open het venster Fotolader. In de sectie Capture type, controleert u de 3D-box. In de sectie 3D Capture, selecteer het bereik rond centrum en terugkeren naar de huidige locatie </strong&gt; dozen en geef de Z-richting bereik, het aantal vliegtuigen, en stapgrootte. De Z-richting bereik moet het gehele monster te nemen. </li><li> In de sectie Filter Set van het venster Fotolader, vinkt u het vakje DIC en geef belichtingstijd. In de sectie beeldinformatie, de naam van de afbeelding (optioneel), en selecteer Start om de beeldvorming te starten. </li></ol> 3. Bright Field (BF) Z-stack Acquisitie <ol><li> Zodra de microscoop klaar is met het verzamelen van de DIC Z-stack van het monster, opent de Focus Venster en selecteer Open in het gedeelte Filter Set. Pas de schuifbalk Aperture naar de verste linker positie (helemaal gesloten) naar laag NA verlichting te bieden. </li><li> Wijzig de microscoop lichtpad filter naar groen. Stel de halogeenlamp intensiteit totdat het monster zichtbaar. Zorg dat er geen verzadiging van de camera door de optie <strong&gt; tabblad Camera in de Focus Venster en controleren of het histogram van pixelintensiteiten is binnen het opgegeven bereik. </li><li> Open het venster Fotolader. De 3D Capture instellingen uit de DIC Z-stack overname wordt weergegeven. </li><li> In de sectie Filter Set van het venster Fotolader, vinkt u het vakje te openen en belichtingstijd. In de sectie beeldinformatie, de naam van de afbeelding (optioneel), en selecteer Start om Z-stack beeldverwerving initiëren. </li></ol> 4. Exporteren Z-stack Afbeeldingen <ol><li> Open een Z-stack capture. De weergave 100%. Stel het histogram van de pixelwaarden te geven tussen 0 en de maximale pixelwaarde van de camera (4095 voor 12 bits camera 65.535 16 bits.). </li><li> Selecteer Weergave&gt; Exporteer&gt; TIFF Series. Dit zal de Z-stack exporteren als een reeks TIFF-afbeeldingen(Een voor elke Z vlak). Sla het TIFF-serie in een aparte map met een naam die een underscore aan het eind (dwz &quot;DIC Stack 1_&quot;) heeft. Herhaal dit met elke DIC of BF Z-stack. </li></ol> 5. Volume Metingen <ol><li> Open het HTDIC MATLAB programma met de titel &quot;JoVE_HTDIC_v1.m&quot;. </li><li> Op grond van artikel 0 van het HTDIC programma, het actualiseren van de afhankelijkheden directory variabele. Kopieer en plak de map met de hilbert_transform_dic.m en sobel_edge_detect.m bestanden van explorer (PC) in tussen de enkele aanhalingstekens volgende &quot;dependencies_directory =&quot;. ExecuteSection 0 van het JoVE_HTDIC_v1.m programma. </li><li> In paragraaf 1, het actualiseren van de &quot;images_directory&quot;. Nogmaals, kopieer en plak de map met de door-focus afbeeldingen in. Tif vorm tussen de enkele aanhalingstekens. Alleen loopt DEEL 1 ONCE. </li><li> Uitlijning en rotatie van beelden voor Hilberttransformatie Run afdeling 2 van de code. Er verschijnt een dialoogvenster met de titel &quot;Definieer HTDIC parameters&quot; verschijnt. Vijf numbers zijn vereist van de gebruiker: het brandvlak nummer waar het DIC beeld van het monster in focus, laterale resolutie (micrometer / pixel in het beeld), de axiale resolutie (dit is 0,1 voor het acquisitie in 0,1 micrometer axiale stappen), de draaihoek van het imago van de DIC nodig om te presteren de Hilbert transformatie, typische waarden zijn 45 en -135. Ten slotte voert de regio van belang de grootte, deze parameter bepaalt de lengte van een zijde van een doos die later zal verschijnen - typische waarde is 400. Klik op Ok. </li><li> Een beeld van de DIC focal plane door de focal plane nummer zal verschijnen met een blauwe doos. Plaats de doos over de functie van belang zijn, bijvoorbeeld een cel. De box hoeft niet vierkant. Zodra de doos is gepositioneerd boven de gewenste regio, dubbelklik binnen het strafschopgebied. </li><li> Een ander cijfer zal nu verschijnen: een bijgesneden en geroteerd beeld van de regio geselecteerd in de vorige stap belang dit cijfer bevat. Het contrast van het beeld moet zodanig zijndie donkere functies verschijnen links terwijl heldere functies verschijnen aan de rechterkant. Sleep het blauwe vak over de regio van belang, opnieuw vorm te geven als dat nodig is. </li><li> Paragraaf 3 genereert een masker voor de z-stack kubus. Er zijn twee soorten maskers beschikbaar: een rechthoekig masker een rechthoek rond de cel en een vrije hand hulpmiddel om de cel van belang overzicht handmatig maken. </li><li> Om een ​​rechthoekig masker, uncomment lijn 167 en commentaar lijn 170 (commentaar van een lijn door het plaatsen van een &quot;%&quot; aan het begin van die lijn) te genereren. Uitvoeren hoofdstuk 3 van het programma. Klik in de afbeelding en sleep de muis om te beginnen met het definiëren van de rechthoekige masker. Dubbelklik op het vakje om het te accepteren. </li><li> Om een ​​hand-drawn masker, commentaar lijn 167 en lijn 170 uncomment genereren en uitvoeren van sectie 3. Klik en teken de gewenste masker met de muis. Dubbelklik op het masker om het te accepteren. </li><li> Run Sectie 4to construeren de Hilbert getransformeerd DIC afbeelding stapel en de bijbehorende DIC afbeelding stapel van het gebied van belang.Het masker gebouwd in hoofdstuk 3 zal worden toegepast op de hilberttransformatie DIC stack en de reguliere DIC stack wanneer &quot;maskON&quot; is ingesteld op 1 op lijn 179. Instelling &quot;maskON&quot; naar 0 zal image stacks bouwen zonder toepassing van het masker. </li><li> Run Afdeling 5 om het beeld segmentatie van de xz dwarsdoorsneden van het gebied van belang te optimaliseren. Figuur 500, die door het programma verschijnt met drie verschillende soorten contrast. Het succes van het algoritme om de randen van de cel voorbeeld afhankelijk van een combinatie van de gebruikte masker en de waarde &quot;drempel&quot; op regel 229 van het programma. Begin met een waarde van 0,5. Stel de waarde van de drempel en herhaald dit deel van het programma tot de juiste schetsen bereikt in een van de kolommen. </li><li> Als het schetsen was beste in kolom 1, gebruiken Hoofdstuk 6 om het volume te bepalen met behulp van DIC afbeelding segmentatie. Als kolom 2 gaf een optimaal resultaat, lopen hoofdstuk 7 naar cel volume van Hilbert-getransformeerde DIC beelden bepalen. Als kolom 3 gave optimale resultaten, rennen sectie 8 volume bepalen met behulp van Fourier-gefilterde Hilbert-getransformeerd DIC beelden. </li><li> De afgemeten hoeveelheid van het monster, gerapporteerd in kubieke urn (fl) wordt gepresenteerd in de titel van fig. 600, 700 of 800 door het programma afhankelijk van volumemeting gekozen. </li></ol> 6. Massa Metingen <ol><li> Open het NIQPM MATLAB programma met de titel &quot;JoVE_NIQPM_v1.m&quot;. </li><li> Op grond van artikel 0 van het NIQPM programma, het actualiseren van de locatie van drie mappen die nodig zijn om het programma uit te voeren. Dit zijn de &quot;dependencies_directory,&quot; de &quot;brightfield_directory,&quot; en de &quot;dic_directory.&quot; </li><li> Vervolgens, ren Sectie 1. Dit gedeelte van de code genereert een helder beeldveld kubus van het volledige gebied van de volledige set van beelden. Alleen loopt DEEL 1 ONCE. </li><li> Vervolgens, ren Sectie 2. Er verschijnt een dialoogvenster met de titel &quot;Definieer NIQPM parameters&quot; verschijnt. Vier getallen nodig van de gebruiker: het brandvlak nummer waar het helder veld beeld van desteekproef is in focus, laterale resolutie (micrometer / pixel in het beeld), de axiale resolutie (dit is 0,1 voor het acquisitie in 0,1 micrometer axiale stappen), en de regio van belang de grootte, deze parameter bepaalt de lengte van een zijde van een doos die later zal verschijnen - een typische waarde is 200. Klik op Ok. </li><li> Een beeld van de heldere veld focal plane door de focal plane nummer zal verschijnen met een blauwe doos. <ol><li> Als het beeld niet scherp is, dubbelklikt u in het blauwe vak en herhaling deel 2, moet u het brandvlak nummer aanpassen in het dialoogvenster. </li><li> Als het beeld is scherpgesteld, sleept u het blauwe vak rond het beeld en het formaat ervan wijzigen door het selecteren van de knooppunten van de doos en ze zo nodig te slepen. Plaats de doos rond de functie van belang zijn, bijvoorbeeld een cel. De box hoeft niet vierkant. Dubbelklik in het vak om het te accepteren. </li></ol></li><li> Vervolgens, ren afdeling 3 een stapel helder veld beelden construeren bijgesneden om de regio inlangstelling. </li><li> Om de fase kaart, afbeelding pseudo DIC, en vergelijkingen met heldere getrouw beeld van de DIC veld beelden en genereren, rennen Sectie 4. </li><li> Met de pseudo DIC en ware DIC beelden zo veel mogelijk een plan massadichtheid, totale massa en histogram van de celdichtheid kan worden bepaald door het uitvoeren punt 5a of 5b. Sectie 5a op geautomatiseerde kostganger detectie van het veld - optimize &quot;drempel&quot; op lijn 300 - kenmerkende waarden variëren tussen de 0,1-1. Herhaald dit gedeelte als nodig is om de waarde van de drempel optimaliseren. Artikel 5b, voert bepaling van de massa, etc. nadat de gebruiker de cel van belang schetst. </li></ol>

<ol><li>Zernike, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Das+Phasenkontrastverfahren+bei+der+mikroskopischen+Beobachtung%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Technische+Physik%22%5BJournal%5D)">Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung.</a> Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).</li>
<li>Zernike, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+contrast%2C+a+new+method+for+the+microscopic+observation+of+transparent+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Physica%22%5BJournal%5D)">Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects.</a> Physica. 9 (42), 974-986 (1942).</li>
<li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+Phase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Finding Phase.</a> Nat. Cell Biol. 11, (2009).</li>
<li>Smith, F. H. Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).</li>
<li>Nomarski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinterf%C3%A9rom%C3%A8tre+diff%C3%A9rentiel+%C3%A0+ondes+polaris%C3%A9es%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Radium%22%5BJournal%5D)">Microinterféromètre différentiel à ondes polarisées.</a> J. Phys. Radium. 16, (1955).</li>
<li>Lang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomarski+differential-interference+contrast+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Zeiss+Inform%22%5BJournal%5D)">Nomarski differential-interference contrast microscopy.</a> Zeiss Inform. 70, 114-120 (1968).</li>
<li>Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-enhanced+contrast%2C+differential+interference+contrast+%28VEC-DIC%29+microscopy%3A+a+new+method+capable+of+analyzing+microtubule-related+motility+in+the+reticulopodial+network+of+Allogromia+laticollaris%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil.+Cytoskel%22%5BJournal%5D)">Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris.</a> Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).</li>
<li>Inoué, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+image+processing+greatly+enhances+contrast%2C+quality%2C+and+speed+in+polarization-based+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy.</a> J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).</li>
<li>Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+shape+change+and+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Platelet shape change and spreading.</a> Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).</li>
<li>Barer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+microscopy+and+mass+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interference microscopy and mass determination.</a> Nature. 169, 366-367 (1038).</li>
<li>Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractometry+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Refractometry of living cells.</a> Nature. 171, 720-724 (1953).</li>
<li>Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+development+and+experimental+evaluation+of+imaging+models+for+differential+interference+contrast+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).</li>
<li>Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+phase+imaging+using+differential+interference+contrast+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy.</a> J. Microsc. 214, 7-12 (2004).</li>
<li>Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+optical+pathlength+distributions+from+images+obtained+by+a+wide%E2%80%90field+differential+interference+contrast+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide‐field differential interference contrast microscope.</a> J. Microsc. 188, 149-157 (1997).</li>
<li>Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport-of-intensity+approach+to+differential+interference+contrast+%28TI-DIC%29+microscopy+for+quantitative+phase+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging.</a> Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).</li>
<li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scattering-phase+theorem%3A+anomalous+diffraction+by+forward-peaked+scattering+media%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Exp%22%5BJournal%5D)">Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media.</a> Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).</li>
<li>Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Carr%C3%A9+differential+interference+contrast+microscopy+to+assess+phase+and+amplitude%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative Carré differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).</li>
<li>Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+optical+phase+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantitative optical phase microscopy.</a> Opt. Lett. 23, 817-819 (1998).</li>
<li>Paganin, D., Nugent, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-interferometric+phase+imaging+with+partially+coherent+light%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Non-interferometric phase imaging with partially coherent light.</a> Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).</li>
<li>Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. on-interferometric <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((non-iterative+phase+retrieval+by+Green%E2%80%99s+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">non-iterative phase retrieval by Green’s functions.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).</li>
<li>Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+quantification+of+cellular+mass%2C+volume%2C+and+density+of+circulating+tumor+cells+identified+in+an+ovarian+cancer+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient.</a> Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).</li>
<li>Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+single+cell+refractive+index%2C+dry+mass%2C+volume%2C+and+density+using+a+transillumination+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).</li>
<li>Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractive+index+maps+and+membrane+dynamics+of+human+red+blood+cells+parasitized+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum.</a> , 105-13730 (2008).</li>
<li>Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+cycle-dependent+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of cycle-dependent cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).</li>
<li>Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+cell+membrane+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of cell membrane tension.</a> Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).</li>
<li>Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffraction+phase+microscopy+for+quantifying+cell+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics.</a> Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).</li>
<li>Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+phase+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic phase microscopy.</a> Nat. Methods. 4 (9), 717-719 (2007).</li>
<li>Charrière, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+refractive+index+tomography+by+digital+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy.</a> Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).</li>
<li>Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral-domain+optical+coherence+phase+microscopy+for+quantitative+phase-contrast+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging.</a> Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).</li>
<li>Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+light+interference+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22SLIM%29.+Opt.+Exp%22%5BJournal%5D)">Spatial light interference microscopy.</a> SLIM). Opt. Exp. 19, 1016-1026 (2011).</li>
<li>Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hilbert+phase+microscopy+for+investigating+fast+dynamics+in+transparent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems.</a> Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).</li>
<li>Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-interference-channel+quantitative-phase+microscopy+of+live+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics.</a> Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).</li>
<li>Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).</li>
<li>Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Hilbert+transform+for+3D+visualization+of+differential+interference+contrast+microscope+images%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images.</a> J. Microsc. 199, 79-84 (2001).</li>
<li>Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+label-free+imaging+technique+for+the+quantification+of+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen financiële belangen in het gepresenteerde werk.

In het algemeen, NIQPM is een buigingsbegrensde techniek gevalideerd op optische pad-lengtes variërend ,25-44,7. Validering werd bij n = 1,596 polystyreen bolletjes variërend in diameter van 0,11-9,8 urn gesuspendeerd in Fluoromount G (gegevens niet getoond). Cellen bezitten optische pad-lengtes die variëren van bijna 0-7. Bij het meten van de verdeling dichtheid van een monster kan men vinden dat het imago van de pseudo DIC ziet er prima uit, terwijl de kaart dichtheid bezit ongewenste acht...

Het gebruik van optische microscopie is nu alomtegenwoordig in het onderzoek naar de cellulaire organismen. Door hun lage endogene absorptie en verstrooiing zwakke eigenschappen over het zichtbare optische spectrum, worden cellen niet sterk beïnvloeden de amplitude van de optische golven te doorkruisen en lijken derhalve semi wanneer afgebeeld met standaard helderveld microscopen. Cellulaire specimens Wel vertragen optische golven reizen door hen op een wijze die recht evenredig is met de hoeveelheid lokale massadichtheid in een bepaald gebied van de ruimte waardoor het licht reist. Benutting van deze heterogene vertraging of &quot;fase&quot; profiel van optische golven die via microscopische preparaten werd voor het eerst beschreven in 1935 door Frits Zernike 1 en experimenteel gerealiseerd door Zernikein 1942 2. Zernike werd bekroond met de Nobelprijs in 1953 voor deze prestatie. Zeiss gecommercialiseerd deze modaliteit in 1945 3. In 1955, Smith en NomarskIk zou hun eerste werkzaamheden op het gebruik 4 en theorie 5 van differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie is een modaliteit die de ruimtelijke gradiënt van fase gebruikt als contrast mechanisme presenteren. DIC werd gecommercialiseerd door Zeiss in 1965in nauwe samenwerking met Nomarski 6. In 1981, twee laboratoria aangetoond dat de eerste geregistreerde levende cellen DIC beeldspraak met de opname van video-camera&#39;s in de optiek trein van de DIC microscoop 7, 8. Het tijdperk van live cell imaging werd geboren. Sinds die tijd heeft de uitvoering van zowel fase-contrast-en DIC op commerciële microscopen grotendeels ongewijzigd geweest. Deze methoden worden voornamelijk gebruikt door biologen om beelden van cellen te produceren voor de kwalitatieve doelen: monitoring van de morfologie, het volgen van subcellulaire structuren, en onderzoeken van membraan dynamica 9. Deze technieken zijn kwalitatief van hun &quot;off-the-shelf&quot; configuratie zowel fase en DIC afbeeldingen zijn willekeurig functies van de lichtbron intensiteit, de verlichting optiek instellingen, en CCD-camera te krijgen, gamma, en belichtingsinstellingen. Een klein legioen van fysici en optische ingenieurs heeft getracht om commerciële beeldvormende modaliteiten kwantitatieve maken. Een van de eerste pogingen waren twee brieven aan de natuur in 1952 en 1953, waarin de arts-draaien-biofysicus Robert Naakter aangetoond dat het gebruik van fase microscopie om cellulaire droge massa van cellen te bepalen door een schatting fase verschuivingen door middel van deze celtypen met een algemeen verkrijgbare fase microscoop 10, 11. Fase microscopie 10,11, DIC microscopie 12-17, en helder veld 18-22 optische weglengte, fase, de massa te bepalen: Het veld heeft een veelheid aan technieken in de daaropvolgende jaren gebaseerd op drie basis-label-free contrast mechanismen ontwikkeld dichtheid, brekingsindex en celvolume. In parallel, een grote collectie aangepaste optische instrumenten zijn ook ontwikkeld sinds de jaren 1950, en hebben vergaande optische metingen, variërend van toepassingen in parasiet groei 23, aan het documenteren van de celcyclus 24 te onderzoeken membraan dynamiek van rode bloedcellen 25 gemaakt. In het bijzonder, heeft de afgelopen tien jaar een schat aan label-free kwantitatieve microscopie zien in de vorm van diffractie fase microscopie 26, tomografische fase microscopie 27 digitale holografische microscopie 28, fase gevoelige optische coherentie microscopie 29, ruimtelijke licht interferentiemicroscopie 30, Hilbert fase microscopie 31 en kwantitatieve fase microscopie 32. Ondanks hun gezamenlijke successen, zijn deze instrumenten niet verspreid naar het grotere gebied van biologische onderzoekers gevolg, meestal, hun complexe instrumentatie en computationele vereisten. Hierin we drenderen het gebruik van een standaard optische microscoop kwantitatieve metingen van gewicht, volume en dichtheid op cellulaire monsters uitgevoerd door een combinatie van helderveld en DIC beelden. Twee primaire benaderingen worden gepresenteerd: noninterferometric kwantitatieve fase microscopie (NIQPM), op de metingen van de totale celmassa en subcellulaire distributie dichtheid te voeren, en Hilbert transformeren differentieel interferentie contrast microscopie (HTDIC), om het volume te bepalen. De belangrijkste voordelen van NIQPM en HTDIC lag in hun technologische toegankelijkheid. De beeldvormende voorwaarden voor de succesvolle uitvoering binnen het bereik van de normale werking van de meeste commercieel beschikbare microscopen. Daarnaast is de post-processing algoritmes zijn stabiel, snel en robuust - hebben in MATLAB geïmplementeerd met behulp van snelle Fourier-transformatie (FFT) gebaseerde algoritmen waar mogelijk. NIQPM is een methode om fase en de axiaal geïntegreerde massadichtheid van cel reconstruerenlaire exemplaren uit helder veld beeldspraak. Sommatie van deze axiaal geïntegreerd massadichtheid over het gebied van het model geeft de totale droge massa gehalte van het monster. De NIQPM protocol is gebaseerd op de fundamenten van Paganin en Nugent 18, 19 experimentele basis - waarbij werd aangetoond dat de fase profiel van een cel kan worden gereconstrueerd door-focus helderveld beeld van het monster - en theoretisch werk van Frank , Altmeyer en Wernicke 20 - op het oplossen van de asparallelle golfmodellen op een efficiënte FFT-gebaseerde manier. De aansluiting van fase naar de droge massa dichtheid is gebaseerd op het werk van Barer 10, 11 en Popescu 33. Volumetrische informatie kan worden verkregen bij door-focus DIC beelden onder hoge NA verlichting omstandigheden die optische sectie van het monster staat langs de optische as. Hilbert transformatie proces op het DIC afbeelding stapels vergrootranddetectie algoritmen voor het lokaliseren van het monster grenzen in drie dimensies door het scheiden van de grijswaarden van het monster intensiteit van die van de achtergrond. Dit werk is afkomstig van Arinson et al.. 34 hoewel we beiden Fourierfiltering methoden geïntroduceerd om contrast en een Sobel-gebaseerde Edge-detectiemethode voor geautomatiseerde volumetrische analyse van het monster te verbeteren. We hebben ook eerder gevalideerde HTDIC op polystyreen bolletjes variërend in grootte van de diffractie limiet tot 20 urn diameter 36. Terwijl zowel NIQPM en HTDIC technologisch toegankelijk vanwege hun ontwikkeling op commerciële microscopen, worden de methoden fundamenteel beperkt door de hardware configuratie van de microscopen zelf. De belangrijkste beperkingen van deze technieken zijn tweeledig: slow z-stack overname tijd op commerciële scopes, als gevolg van de vertaling van het gehele monster etappe in tegenstelling tot enkel het objectief, Beperkt momenteel onderzoek verschijnselen sneller dan ongeveer 1 frame / minuut en tweede diffractie effecten beperken de bruikbaarheid van NIQPM en HTDIC voorwerpen variërend in grootte van 0,2 tot 10 en 20 micrometer in doorsnede, respectievelijk. Daarom moet het model en de bijbehorende tijdsdynamiek plaats aan bepaalde grootte en temporele beperkingen op het gebruik van deze methoden op typische &quot;off-the-shelf&quot; instrumenten mogelijk. Opwindend, zijn de meeste vaste cellulaire exemplaren gemakkelijk onderzocht met deze methoden. Een overzicht van de NIQPM en HTDIC protocollen zijn aangegeven in figuur 1. In figuur 2 illustreren we optimale en suboptimale door-focus beeldvorming onder zowel lage als hoge NA verlichting voorwaarden voor zowel helderveld en DIC beelden. Figuren 3 en 4 tonen de parameter-afhankelijkheid van de NIQPM algoritme markeren geslaagde en mislukte implementaties. <strong&gt; Figuur 5 illustreert de stappen die betrokken zijn bij de HTDIC beeldverwerking algoritme en toont de optimale uitvoering van het algoritme om cellulaire volume bepalen.

<table><tbody><tr><td>Zeiss Axio Imager 2 microscoop</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Duitsland</td><td>Axio Imager D2</td><td>Microscoop</td></tr><tr><td>Groene filter (&lambda; = 540 &plusmn; 25 nm)</td><td>Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont</td><td>D540/25x</td><td>Groene filter</td></tr><tr><td>SlideBook 5.5 software</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado</td><td></td><td>Beeldverwervingssoftware</td></tr><tr><td>Polystyreen microsferen</td><td>Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN</td><td>PS06N</td><td>Polystyreen bollen</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech, Birmingham, Alabama</td><td>0100-01</td><td>Montage media</td></tr></tbody></table>

kwantitatieve optische microscopie: meting van cellulaire biofysische eigenschappen met een standaard optische microscoop

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We beschrijven het gebruik van een standaard optische microscoop kwantitatieve metingen van gewicht, volume en dichtheid op cellulaire monsters uitgevoerd door een combinatie van helderveld en differentieel interferentie contrast beelden. Twee primaire benaderingen worden gepresenteerd: noninterferometric kwantitatieve fase microscopie (NIQPM), op de metingen van de totale celmassa en subcellulaire distributie dichtheid te voeren, en Hilbert transformeren differentieel interferentie contrast microscopie (HTDIC) om het volume te bepalen. NIQPM is gebaseerd op een vereenvoudigd model van de voortplanting van golven, aangeduid als de paraxiale benadering, met drie onderliggende veronderstellingen: lage numerieke apertuur (NA) verlichting, zwak verstrooiing, en zwakke absorptie van licht door het monster. Gelukkig unstained cellulaire monsters aan deze veronderstellingen en lage NA verlichting is gemakkelijk te bereiken op de commerciële microscopen. HTDIC wordt gebruikt om volumetrische informatie te verkrijgen van door-focus DIC beelden onder hoge NA illuminatie voorwaarden. Hoge NA-verlichting kunnen verbeterde opdeling van het monster langs de optische as. Hilbert transformatie proces op de afbeelding DIC stapels verbetert randdetectie algoritmen voor het lokaliseren van het monster grenzen in drie dimensies door het scheiden van de grijswaarden van het monster intensiteit van die van de achtergrond. De belangrijkste voordelen van NIQPM en HTDIC lag in hun technologische toegankelijkheid met &quot;off-the-shelf&quot; microscopen. Er zijn twee fundamentele beperkingen van deze methoden: slow z-stack overname tijd op commerciële scopes heft momenteel het onderzoek naar verschijnselen sneller dan 1 frame / minuut, en ten tweede, diffractie effecten beperken het nut van NIQPM en HTDIC om objecten van 0,2 tot 10 (NIQPM) en 20 (HTDIC) micrometer in doorsnede, respectievelijk. Daarom moet het model en de bijbehorende tijdsdynamiek plaats aan bepaalde grootte en temporele beperkingen op het gebruik van deze werkwijzen mogelijk. Opwindend, de meeste vaste cellular exemplaren worden gemakkelijk onderzocht met deze methoden.

Juiste monster verlichting bij door-aandacht beeld acquisitie is cruciaal voor de succesvolle implementatie van de NIQPM een nd HTDIC algoritmen. In figuur 2 illustreren we lage en hoge NA verlichting zowel onder DIC en helder veld contrast voor een polystyreen bol en de humane colorectale adenocarcinoomcellijn SW620. Figuren 2A, 2C, 2I en 2K demonstreren optimale beeldvorming voor NIQPM. Figuren 2F, 2H, 2N en 2P demonstreren optimale beeldvorming voor ...

We beschrijven het gebruik van een standaard optisch microscoop om kwantitatieve metingen van cellulaire massa, volume en dichtheid uit te voeren door een combinatie van lichtveld en differentiële interferentiecontrast beeldvorming.

Kwantitatieve Optische Microscopie: Meting van Cellulaire biofysische eigenschappen met een standaard optische microscoop

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Het algemene doel van deze procedure is om basiskenmerken van cellulaire monsters, waaronder massa en volume, te kwantificeren met een standaard optische microscoop en beeldbewerking. Dit wordt bereikt door eerst cellulaire monsters, die op glazen dekglasjes zijn gekweekt, op microscoopglaasjes te monteren. Vervolgens worden through-focus brightfield- en differentiaalinterferentiecontrastbeelden verkregen.Vervolgens wordt elke Z-stapel afbeeldingen ingevoerd in afzonderlijke MATLAB-beeldverwerkingsprogramma's die de fysieke gegevens extraheren. Uiteindelijk worden de basis fysische eigenschappen van cellulaire monsters verkregen met behulp van intensiteitsmetingen door de focus, onder brightfield-contrast en differentieel interferentiecontrast-microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals fluorescentiemicroscopie, is dat cellulaire monsters niet gefixeerd, gepermeabiliseerd of gekleurd hoeven te worden.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de celbiologie, zoals de organisatie van de subcellulaire dichtheid tijdens de celcyclus of tussen verschillende celpopulaties die bijdragen aan een ziek

quantitative-optical-microscopy-measurement-cellular-biophysical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We zien een donker veld microscopie op basis van Gabor-achtige filter om subcellulaire dynamiek maatregel binnen enkele levende cellen. De techniek is gevoelig voor veranderingen in de structuur van de organellen, zoals mitochondriën fragmentatie.

Optische Scatter Microscopie op basis van twee-dimensionale Gabor filters

Wij ontwikkelden een software platform dat Imaris Neuroscience, ImarisXT en MATLAB om de veranderingen in morfologie van een ongedefinieerde vorm uit driedimensionale confocale fluorescentie van afzonderlijke cellen te meten gebruikt. Deze nieuwe benadering kan worden gebruikt om veranderingen in celvorm na receptor activatie kwantificeren en dus een mogelijke extra hulpmiddel voor drug discovery.

Een analytisch instrument dat cellulaire morfologie Veranderingen van Drie-dimensionale Fluorescentie afbeeldingen kwantificeert

Dit manuscript beschrijft een methode om te visualiseren en te kwantificeren van gelokaliseerde vertaling gebeurtenissen in subcellular compartimenten. De in dit manuscript voorgestelde benadering is vereist van een basissysteem voor confocal beeldvorming en reagentia en snelle en kostenefficiënte.

Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling

Lens-vrije videomicroscopie ons in staat stelt om te controleren van celculturen direct in de incubator. Hier beschrijven we het volledige protocol gebruikt voor het verwerven en analyseren van een 2.7 dag lang verwerving van gekweekte HeLa cellen, wat leidt tot een dataset van 2.2 x 106 metingen van individuele cel morfologie en 10584 celcyclus tracks.

Lens-gratis videomicroscopie voor de dynamiek en de kwantitatieve analyse van aanhangend celkweek

Hier beschrijven we optische acquisitie en karakterisering van actiepotentiaalen van geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten met behulp van een snel modulair fotometriesysteem.

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Hier presenteren we een protocol om de intracellulaire mechanische eigenschappen van geïsoleerde embryonale zebraviscellen in driedimensionale opsluiting te onderzoeken met directe krachtmeting door een optische val.

Directe krachtmetingen van subcellulaire mechanica in opsluiting met behulp van optische pincetten

Hier wordt een geïntegreerd protocol op basis van een optisch pincet en defocusmicroscopie beschreven om de reologische eigenschappen van cellen te meten. Dit protocol is breed toepasbaar bij het bestuderen van de visco-elastische eigenschappen van erytrocyten onder variabele fysio-pathologische omstandigheden.

Kwantitatieve analyse van visco-elastische eigenschappen van rode bloedcellen met behulp van een optisch pincet en onscherpe microscopie

Door gebruik te maken van een multimodaal platform dat labelvrije optische beeldvormingsmodaliteiten combineert, hebben we een protocol ontwikkeld voor het visualiseren en kwantificeren van cellulaire dynamiek en metabolisme. Door middel van beeldvorming via multifotonfluorescentie, tweede harmonische generatie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie kunnen we een holistisch overzicht van de cellulaire en moleculaire omgeving genereren.

Multimodaal optisch beeldvormingsplatform voor het bestuderen van cellulair metabolisme

Dit protocol beschrijft een labelvrije optische diffractietomografie-gebaseerde workflow voor realtime beeldvorming en kwantitatieve analyse van macrofagenmorfodynamica. De methode maakt continue tracking van de morfologie en migratie van enkelcellige cellen mogelijk, waarbij tijdsresolutie metingen van het geprojecteerde gebied, de omtrek en de gemiddelde migratiesnelheid tijdens langdurige live-cell beeldvorming worden opgeleverd.

Realtime labelvrije beeldvorming en kwantitatieve analyse van macrofagenmorfodynamica met behulp van optische diffractietomografie

Optische resolutie fotoakoestische microscopie (OR-PAM) is een opkomende technologie die in staat van beeldvorming optische absorptie...

Drie-dimensionale Optische resolutie Fotoakoestisch Microscopie

Leer hoe u celmassa, volume en dichtheid kwantificeert met een standaard optische microscoop en beeldverwerking in MATLAB. Deze niet-invasieve methode werkt zonder fixatie of kleuring.

Kwantitatieve Optische Microscopie: Meting van Cellulaire biofysische eigenschappen met een standaard optische microscoop

Meer video's verkennen