Met behulp van Microfluidics Chips voor Live Imaging en Studie van Injury Reacties in Drosophila Larven
7 februari 2014
Drosophila larven zijn een aantrekkelijk model systeem voor live-imaging vanwege hun doorschijnende cuticula en krachtige genetica. Dit protocol beschrijft hoe u een single-layer PDMS apparaat, genaamd de 'larve chip' voor live-beeldvorming van cellulaire processen binnen neuronen van 3 e instar Drosophila larven benutten.
Het algemene doel van het volgende experiment is om drosophila-larven niet-invasief te immobiliseren voor live beeldvorming met behulp van een aangepaste microfluïdische kamer. Een derde in ster-larven wordt in de chip geplaatst met wat olie om de larven te verzegelen. Vervolgens wordt de chip op de larven geplaatst zodat het lichaam in de kamer past.
De chip is verbonden met een spuit zodat er een vacuüm kan worden aangelegd. De beweeglijkheid van de larven wordt beperkt en structuren in het ventrale deel van het dier worden dicht bij de dekglas geduwd. Met behulp van een confocale microscoop kunnen structuren gemakkelijk worden afgebeeld, zoals de details van sensorische neuronaxonen en de regeneratie van segmentale zenuwen na geïnduceerde zenuwbeschadiging.
Andere methoden om josepha te immobiliseren voor live beeldvorming, enorme chloroformether of ISO-anesthetica. Het grote voordeel van deze techniek is dat het het gebruik van dergelijke toxines vermijdt, die interfereren met de fysiologie van het dier. En het toegevoegde voordeel van de afwezigheid van toxines is dat de larve GB veilig is om mee te werken. De robuuste immobilisatie maakt beeldvorming mogelijk van snelle gebeurtenissen zoals snellere axonaal transport en veranderingen in intracellulair calcium.
Een enkele larve kan meerdere keren worden geïmmobiliseerd en geïmagerd in de chip. Dit maakt tijd-levens mogelijk. Beeldvorming van processen die zich over een periode van maximaal 72 uur voordoen. Begin met het verkrijgen van een monster PDMS-chip om dit protocol uit te proberen.
Instructies over het maken van een A-P-D-M-S-chip van een SU acht mallen kunnen worden gelezen in de tekstprotocol met behulp van een 21 gauge dispensernaald. Maak een gat in de vacuümpoort van het PDMS-chip voor een omgekeerde microscoop. Verwijder een 23 gauge naald van zijn basis, de vergrendelingshub met een paar draaien.
Steek vervolgens de naaldtip in een klein stuk polyethyleenbuis zodat de buis minimaal een millimeter van de naald bedekt. Gebruik een scheermes om het overtollige buis af te snijden. Dit laat een plastic ring achter die een afdichting kan maken.
Steek de 23 gauge naaldtip in het gat van de vacuümpoort. Voor een rechtopstaande microscoop, maak een tweede gat aan de zijkant van het PDMS-chip met een 21 gauge dispensernaald. Dit gat geeft toegang tot het eerste gat vanaf de zijkant.
Steek vervolgens de 23 gauge naaldtip en de buisring in het zijgat. Plak een stuk dubbelzijdig plakband over de bovenkant van het PDMS-chip om het bovenste gat af te sluiten. Bevestig een stuk van twintig centimeter polyethyleenbuis tussen de naaldtip die in de vacuümpoort van de chip is gestoken en een van de poorten van een drieledig ventiel.
Bevestig vervolgens een 20 milliliter spuit in een van de twee resterende poorten van het ventiel en laat de laatste poort open. Reinig de PDMS-chip met transparant plakband. Bevestig een stuk plakband op de onderkant van de chip.
Zorg ervoor dat het plakband de hele PDMS-oppervlakte raakt en trek vervolgens het plakband af. Herhaal deze reinigingsmethode drie keer. Omdat de PDMS-chip herbruikbaar is, is het erg belangrijk om olieresiduen te verwijderen, omdat dit de hechting van PDM op glas kan beïnvloeden. Verplaats vroeg zoekend forageren.
Laat de derde instar-larven van het voedsel naar een petrischaal met water. Het moet tussen de 3,5 en vier millimeter lang zijn om correct in de chip te passen. Doe de larven in het water om het kweekmedium te verwijderen.
Speel vervolgens een kleine druppel halo carbon 700 olie in het midden van een glazen dekglas en gebruik een pincet om voorzichtig een gewassen larve op te pakken. Plaats het kort op een lichtgewicht doek om het af te deppen en beweeg het vervolgens gedurende 10 seconden naar de olie. De druppel moet klein genoeg zijn zodat de trachea van de larven niet bedekt zijn.
Plaats vervolgens de larve kort op een schoon glazen dekglas en beweeg het naar een ander dekglas. Verwijder zo wat meer olie. Let op de oriëntatie van de larve om de neurale draad en segmentale zenuwen af te beelden.
De ventrale kant moet naar beneden zijn. De gemakkelijk te identificeren tracheabuizen moeten omhoog zijn. Plaats nu voorzichtig de PDMS-chip op de larve.
Lign de larve op het midden van de microkamer. Met de achterste kant gericht naar de vacuümpoort, mag de larve de randen van de kamer niet raken. Zodra het is uitgelijnd, duwt u de PDMS-chip tegen het glazen dekglas om een goede afdichting te bereiken.
Controleer vervolgens nogmaals of de larve volledig in de microkamer is ingesloten. Schakel nu het drieledig ventiel naar de spuit. Houd de PDMS-assemblage stevig vast en trek de spuitpomp om twee tot 2,5 millimeter lucht terug te trekken totdat er weerstand wordt gevoeld.
Zo creëert u een vacuüm. Draai vervolgens het ventieldicht. Om het vacuüm zorgvuldig te behouden, controleert u de larve nogmaals.
Zijn lichaam moet geïmmobiliseerd zijn in de microkamer en de trachea moet zichtbaar zijn. De rest van het PDMS-chip moet in contact zijn met het dekglas. Oriëntaties zoals deze zijn niet correct. Beeld nu de larve af.
Als u een rechtopstaande microscoop gebruikt, bevestigt u de bovenkant van de chip met dubbelzijdig plakband aan het podium. Wanneer de beeldvorming is voltooid, laat u het vacuüm los. Trek vervolgens de PDMS-chip los van het dekglas.
De larve zou onmiddellijk mobiel moeten zijn met behulp van pincetten. Breng de larven terug naar een druivensap-agarplaat voor herstel. Plaats een enkele verdoofde larve op een druivensap-agarplaat.
Onder de stereomicroscoop draait u het dier met de ventrale kant naar boven. Om het ventrale zenuwkoord en de segmentale zenuwen te visualiseren, moet u ervoor zorgen dat de larve volledig onbeweeglijk is. Lokaliseer het zenuwkoord en de speekselklieren.
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het niet-invasief immobiliseren van Drosophila-larven voor live imaging met behulp van een aangepaste microfluïdische kamer. De techniek maakt het mogelijk om cellulaire processen binnen neuronen te observeren, in het bijzonder in de context van axonaal transport en zenuwregeneratie.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Live imaging-technieken
Achtergrond
- Drosophila-larven zijn een waardevol model voor het bestuderen van neuronale processen vanwege hun transparantie en genetische hanteerbaarheid.
- Live-imaging kan inzicht bieden in dynamische cellulaire gebeurtenissen in real-time.
- Traditionele immobilisatiemethoden maken vaak gebruik van schadelijke anesthetica die de fysiologie kunnen beïnvloeden.
- Dit protocol beoogt een veiliger alternatief te bieden voor imaging zonder toxische stoffen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een niet-invasieve methode voor het immobiliseren van Drosophila-larven voor beeldvorming.
- Het faciliteren van de observatie van neuronale structuren en processen.
- Het mogelijk maken van herhaalde beeldvorming van dezelfde larve over langere perioden.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een PDMS-microfluidisch apparaat om larven te immobiliseren.
- Toepassing van een vacuüm om de beweeglijkheid van de larven te beperken.
- Beeldvorming met behulp van een confocale microscoop om neuronale structuren te visualiseren.
- Gedetailleerde voorbereiding van de PDMS-chip en positionering van de larven voor optimale beeldvorming.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle immobilisatie van larven zonder gebruik van toxische anesthetica.
- Duidelijke beeldvorming van axonale terminalen van sensorische neuronen en segmentale zenuwregeneratie.
- Mogelijkheid tot het uitvoeren van time-lapse imaging over een periode van 72 uur.
- Demonstratie van kinesine-gemedieerd transport van synaptische blaasjes.
Conclusies
- De gemodificeerde microfluïdische kamer biedt een veilige en effectieve methode voor live-imaging van Drosophila-larven.
- Deze aanpak maakt het mogelijk om snelle neuronale gebeurtenissen en herstelprocessen te bestuderen.
- Het protocol kan worden aangepast voor diverse imaging-toepassingen binnen het neurowetenschappelijk onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Niet-invasieve immobilisatie van modelorganismen maakt longitudinale beeldvorming van dynamische cellulaire processen mogelijk zonder farmacologische storende factoren, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie bij targetvalidatie. De larvenchip faciliteert herhaalde beeldvormingssessies gedurende 72 uur, waardoor axonale transport, letselresponsen en regeneratie in een fysiologisch relevant systeem kunnen worden beoordeeld. Deze aanpak verhoogt het voorspellende vertrouwen in preklinische modellen door de natuurlijke biologie te behouden tijdens de observatie van neuronale dynamiek.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het onderzoeken van therapeutische hypothesen mogelijk door directe visualisatie van axonaal transport en calciumsignalering in neuronen.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door herhaalde beeldvorming van dezelfde larve mogelijk te maken om de targetinteractie en padmodulatie in de loop van de tijd te beoordelen.
- Voorspellende waarde: Biedt kwantitatieve resultaten van organeltransport en letsel-geïnduceerde responsen, wat het vertrouwen in targets bij neurowetenschappelijke ontdekkingen vergroot.
Screening & assay-ontwikkeling
- Klaarzetten van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door larven te immobiliseren voor consistente, hoge-resolutie beeldvorming van ventrale structuren.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gestandaardiseerde preparatie en afsluiting van larven in PDMS-microkamers mogelijk, waardoor variabiliteit in live-imaging assays wordt verminderd.
- Schaalbaarheid: Faciliteert snelle immobilisatie- en beeldvormingscycli, wat ondersteuning biedt voor medium-throughput evaluatie van genetische of farmacologische perturbaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Modelleert axonale beschadiging en regeneratieprocessen die relevant zijn voor mechanismen van neurodegeneratieve ziekten.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen discovery-imaging en preklinische validatie door time-lapse studies naar Walleriaanse degeneratie en axonale sprouting mogelijk te maken.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Ondersteunt go/no-go beslissingen door regeneratieve versus degeneratieve reacties op zenuwpletsering te kwantificeren.
Integratie van Pipeline en Workflow
De larvechip wordt geïntegreerd in vroege discovery-workflows door live imaging van neuronale processen mogelijk te maken vóór de identificatie van lead-verbindingen, wat hypothesetesten en het verduidelijken van pathways in Drosophila-gebaseerde modellen ondersteunt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing via directe beeldvorming van kinesine-gemedieerd vesikeltransport en calciumfluxen in sensorische neuronen.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via reproduceerbare immobilisatie en nabijheid van de ventrale zijde tot het dekglas voor consistente beeldvorming.
- Analytica: Maakt kwantitatieve meting van axonale transportsnelheden (1.0 µm/s anterograad, 0.8 µm/s retrograad) en detectie van calciumpieken mogelijk met behulp van genetisch gecodeerde indicatoren.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinisch werk door het modelleren van reacties op axonale beschadiging, inclusief uitlopers en fragmentatie, over uitgebreide tijdsverloop.
- Hergebruik in de praktijk: Positioneert de PDMS-microfluïdische chip als een herbruikbaar platform voor longitudinale studies over meerdere experimentele sessies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door observatie van snelle neuronale gebeurtenissen mogelijk te maken zonder door anesthetica veroorzaakte fysiologische verstoringen.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde chipvoorbereiding, vacuümgebaseerde immobilisatie en reinigingsprotocollen om interferentie door olieresten te voorkomen.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door herhaald gebruik van individuele larven mogelijk te maken, waardoor het aantal dieren dat nodig is voor longitudinale studies wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk via kwantificeerbare beeldvorming van degeneratie- en regeneratiemetrieken na letsel.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van microfluïdische apparaten, het bedienen van vacuümsystemen en confocale microscopie voor optimale beeldvorming.
- Is afhankelijk van toegang tot PDMS-gietvormgereedschappen, spuitgebaseerde vacuümpoorten en polyethyleenslangen voor afdichting en fluïdische verbindingen.
- Necessiteert standaardisatie tussen teams voor de preparatie van larven, het aanbrengen van olie en de uitlijning van de kamer om consistente immobilisatie te garanderen.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen aan verschillende larvegrootten, waarbij aanpassingen van de chipafmetingen vereist zijn op basis van de lichaamslengte (3,5–4 mm voor de standaardchip).
- Bevat praktische beperkingen, zoals de noodzaak om coating met tracheale olie te vermijden en een juiste ventrale oriëntatie te waarborgen voor visualisatie van het zenuwstreng.
