Name: Met behulp van Microfluidics Chips voor Live Imaging en Studie van Injury Reacties in Drosophila Larven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Leer niet-invasieve immobilisatie van Drosophila larven voor live imaging met een PDMS microfluidische chip. Deze methode maakt tijdopnamen van axonale transport en zenuwregeneratie mogelijk zonder giftige anesthetica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation, (licentienummer IOS-0842701 om CAC), en het National Institute of Health (R00MH080599 naar BY, R21 NS062313 naar NC, en NS069844 te CAC). We willen graag James Schutt, Emily Han en Leni Truong erkennen voor de technische ondersteuning en de Bloomington Stock centrum voor vlieg lijnen. Alle chips werden gefabriceerd op Lurie Nanofabrication Facility van de Universiteit van Michigan.

1. Het maken van de PDMS Chip Om een ​​PDMS chip van de SU-8 mal te maken, volg dan de stappen 1,1-1,7. Als een chip is bij de hand, maar moet samengesteld voor gebruik, doorgaan naar stap 1.8. <ol><li> Meng 45 g van PDMS basis en 4,5 g van de verharder (10:1 ratio) van een PDMS-kit in een kleine wegwerp plastic container en meng ze grondig met behulp van een plastic roerstokje. </li><li> Zet het vat in een vacuüm verpakking (bijvoorbeeld een exsiccator) gedurende 10 min om eventuele luchtbellen te verwijderen. </li><li> Plaats de SU-8 mal de bodem van een 150 mm diameter plastic schaaltje en giet langzaam de PDMS mengsel in de mal. Zorg dat er geen luchtbellen te genereren tijdens het gieten van PDMS. </li><li> Hard de PDMS in een oven (of incubator) bij 650 ° C gedurende 4 uur. </li><li> Verwijder de uitgeharde PDMS/SU-8 mal uit de oven en laat het afkoelen voor een paar minuten. </li><li> Met behulp van een scheermesje, snijd de uitgeharde PDMS langs de rand van de SU-8 schimmel en verwijdert u deze en SU-8 mal. </li><li> Verdeel de PDMS plaatin afzonderlijke PDMS chips met een scheermesje. </li><li> Met behulp van een 21 G naald afgeven, prik een gat in de vacuümpoort (weergegeven in figuur 1A) van het PDMS chip. </li><li> Neem een ​​23 G doseernaald en draai de naald van de sokkel een paar keer om de naald breken tippen van de sluis hub. </li><li> Steek de 23 G naald in een klein stukje van de polyethyleen buis, zodat de buis omvat tenminste een millimeter van de naald. Maak dan gebruik van een scheermesje om uit de buurt van de naald knip het teveel aan slangen. Dit creëert een plastic ring rond een uiteinde van de naald, die een afdichting creëert wanneer ze in het vacuüm inlaatkanaal. </li><li> Voor gebruik met een omgekeerde microscoop (figuur 1B en 2A-B): steek de 23 G naald in het gat van de vacuüm-poort. Voor gebruik met een rechtopstaande microscoop (figuren 1C en 2C-D): Por tweede gat aan de zijkant van de PDMS chip met een 21 G Vervennsing naald; dit gat zal de toegang tot het eerste gat vanaf de zijkant voorzien. Steek vervolgens de 23 G naald met slang ring in de zijkant gat. Leg een stuk dubbelzijdig plakband over de bovenkant van de PDMS chip om het bovenste gat (figuur 1C) te dichten. </li><li> Neem een ​​stuk polyethyleen buis die ongeveer 20 cm lang. Sluit het ene uiteinde van de slang aan de naaldpunt dat in het vacuüm-poort wordt geplaatst. </li><li> Sluit de andere kant van de slang aan op een van de poorten van een 3-weg klep (zie &#39;3-weg kraan &#39;in de lijst van materialen) </li><li> Bevestig een injectiespuit 20 ml in een van de twee overgebleven poorten. De laatste poort is open voor het milieu. </li></ol> 2. Met behulp van de Larve Chip voor Live Imaging <ol><li> Reinig de PDMS chip met doorzichtig plakband. Bevestig een stukje tape aan de onderkant van de chip. Zorg ervoor dat de tape wordt het gehele PDMS oppervlak aan te raken, en trek het tape. </li><li> Herhaal de bovenstaande stap 2-3x te zorgen dat er tegeen deeltjes of olie (overgedragen van eerdere experimenten) op het oppervlak van de chip PDMS. Omdat de PDMS chip herbruikbaar, is het zeer belangrijk om olieresten verwijderen omdat de hechting van PDMS kunnen beïnvloeden glazen en resulteren in onvoldoende afdichting. </li><li> Transfer vroeg (dwz foerageergebied) larven 3 e instar een petrischaal met water. (Het voederen 3e instar larven in het voedsel, in plaats van de kant van de cultuur flacon). Baad de larven in het water om kweekmedium te verwijderen. </li><li> Neem een ​​schone glazen dekglaasje en plaats een kleine druppel Halocarbon 700 olie in het centrum. </li><li> Met behulp van een tang, voorzichtig pick-up een schone, vroeg-geënsceneerde larve 3 e instar van het water (de larve moet ~ 3,5-4 mm lang zijn). Plaats het dier even op een lichtgewicht doekje of papieren handdoek om het overtollige water te verwijderen en plaats het op de olie druppel. De druppel moet klein genoeg zodat de luchtpijp van de larven niet gecoat zijn. Laat de larve stay op Oliedruppelsnelheid voor 10 sec. </li><li> Verwijder de larve uit de olie te laten vallen en plaats het op een schoon glas dekglaasje. </li><li> Breng de larve naar een andere schone glazen dekglaasje. Deze stap verwijdert overtollige olie. </li><li> Besteed aandacht aan larve oriëntatie. Voor de beeldvorming van de neurale snoer en segmentale zenuwen, moet de buikzijde van larve zitten op het dekglaasje. De dorsale zijde, gekenmerkt door twee longitudinale tracheale buizen, moet naar boven wijzen. Let op: dit is de oriëntatie van de larve natuurlijk de voorkeur. </li><li> Plaats voorzichtig de PDMS-chip op de top van de larve. De larve worden afgestemd op centrum midden van de microkamer, met zijn staart gericht op de vacuüm poort. Zorg ervoor dat de larve niet de randen van de kamer raken. Dit is vooral belangrijk voor de anterieure en posterieure tracheale terminals. Opmerking: deze stap wordt best gedaan onder een stereomicroscoop. </li><li> Duw de PDMS chip tegen het glas dekglaasje om een ​​goede afdichting te bereiken. Zorg ervoor dat de larve geheelomsloten door de microkamer wanneer de PDMS chip wordt het aanraken van de glazen dekglaasje. </li><li> Zet de 3-weg-klep, zodat de spuit lucht kan trekken uit de PDMS microkamer (door de slang) om een ​​vacuüm te creëren. </li><li> Met een hand de PDMS chip / glas dekglaasje stevig. Gebruik de andere hand om de zuiger te trekken. Trekken 2-2,5 ml lucht, totdat de weerstand wordt gevoeld in de spuit handvat, om vacuüm te creëren. Het vacuüm veroorzaakt een afdichting tussen de PDMS chip, olie en dekglaasje interfaces en beperkt de mobiliteit van de larve. </li><li> Schakel de klep af zodat de PDMS chip wordt geïsoleerd uit de injectiespuit en uit de omgeving. Hierdoor wordt een relatief stabiele vacuümniveau gehandhaafd in de microkamer zonder dat de spuit plunjer. </li><li> Controleer de larve onder de stereoscoop om ervoor te zorgen dat het hele dier lichaam wordt geplaatst in de microkamer, en dat het dier is immobiel. De luchtpijp moet zichtbaar zijn. De rest van dePDMS chip moet in contact met het dekglaasje. Opmerking: Zie de figuren 2E en 2F voor voorbeelden van dieren correct geïmmobiliseerd in de chip. Sommige ingevuld oriëntaties getoond in Figuren 2G en 2H. </li><li> Plaats de larve chip (PDMS chip + glas dekglaasje) op de microscoop. De larve chip, de slang en de spuit moet zorgvuldig worden behandeld om loslating van het PDMS chip van het dekglaasje te voorkomen. Voor een rechtopstaande microscoop, bevestig de &#39;top&#39; kant van de chip aan de microscoop podium met dubbelzijdige tape (figuur 1C). </li><li> Gebruik een sterk vergrotende doelstelling (olie-immersie, 40-63X wordt aanbevolen) om structuur (s) van het dier van belang vinden en voer de beeldvorming. In sommige gevallen kan een kleinere vergroting nodig om het gewenste gebied van beeldvorming te identificeren voordat het naar hogere vergroting. </li><li> Bij beeldvorming is voltooid, laat het vacuüm door het schakelen van de klep naar de positiedat open is voor het milieu. </li><li> Maak de PDMS chip van het dekglaasje. De larve moet onmiddellijk beweeglijk zijn. </li><li> Gebruik een tang om de larve van de microkamer te verwijderen en plaats voorzichtig het larve op een druivensap agar plaat voor herstel. </li></ol> 3. Induceren van een Nerve Crush Letsel aan larvale Segmentale Zenuwen <ol><li> Volg stap 2.3 te isoleren vroeg geënsceneerde 3 larven e instar van het gewenste genotype. Zoals beschreven in stap 2.3 baden de larven in water om het voedsel te verwijderen. </li><li> Gebruik een standaard fly CO 2 anesthetization station, met CO 2 pad onder een dissectie stereomicroscoop gehouden, om de larven te onderwerpen. Larven moet immotile worden na plaatsing op de CO 2-pad voor 1-2 minuten. </li><li> Plaats nu een enkele verdoofde larve op een druivensap agar plaat onder de stereomicroscoop. Draai het dier ventrale zijde tot aan de buikzenuwkoord visualiseren en segmentale zenuwen door cuticula ( <strong&gt; Figuur 3). Zorg ervoor dat de larve is volledig immotile. </li><li> Met behulp Dumostar nummer-5 tang, knijp de segmentale zenuwen strak via de cuticula voor 5-10 sec. Als dit correct is gedaan, de cuticula intact blijft en het lichaam muur wordt niet doorboord. Opmerking: De schade kan worden uitgevoerd op verschillende posities langs de anterior-posterior lichaamsas, zolang de buikzenuwkoord, speekselklieren en darmen niet beschadigd. De meest effectieve schade locatie aan het einde van de 3e abdominaalsegment, zie figuur 3D. Letsel op deze locatie beschadigt de meest zenuwen en is het makkelijkst te reproduceren zonder het doden van het dier. </li><li> Na de blessure, draait het dier zodat de ventrale zijde naar beneden op de druif plaat. Het moet in staat zijn om haar hoofd te bewegen en te eten. Als de blessure succesvol was, dan is de achterste helft van de larve zal worden verlamd. </li><li> Houd de gewonde dieren op het druivensap agar plaat op 25 &amp;# 176, C de gewenste tijd overeenkomstig het experimentele doel. Voor motoneuronen, de proximale stomp begint te ontkiemen binnen 8-10 uur op letsel 14, en de distale stomp begint te ontaarden binnen 6-8 uur 15. Voor klasse IV da sensorische neuronen, de proximale stomp begint te ontkiemen binnen 4-6 uur, en de distale stomp start te ontaarden binnen 3-4 uur na het letsel. Opmerking: met geschikte Gal4 drivers en fluorescente reporters, kunnen de kiemen en degeneratie worden waargenomen in de larve chip (zie bijvoorbeeld figuur 6). </li></ol>

<ol><li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li>
<li>Gunawardena, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li>
<li>Miller, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+demonstrates+that+Liprin-alpha+is+required+for+trafficking+of+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles.</a> Curr. Biol. 15, 684-689 (2005).</li>
<li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+a+synapse+grow%3A+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li>
<li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li>
<li>Schmid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+site-specific+changes+of+glutamate+receptor+composition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo.</a> Nat. Neurosci. 11, 659-666 (2008).</li>
<li>Fuentes-Medel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+and+muscle+sculpt+neuromuscular+arbors+by+engulfing+destabilized+synaptic+boutons+and+shed+presynaptic+debris%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Glia and muscle sculpt neuromuscular arbors by engulfing destabilized synaptic boutons and shed presynaptic debris.</a> PLoS Biol. 7, (2009).</li>
<li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndlauer%2C+TF+%22Building+an+imaging+chamber+for+in+vivo+imaging+of+Drosophila+larvae%22">Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae</a>. , Cold Spring Harb. Protoc. 476-480 (2012).</li>
<li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+reduces+excitability+of+Drosophila+larval+motoneurons+by+activating+a+hyperpolarizing+leak+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance.</a> Anesthesiology. 108, 434-446 (2008).</li>
<li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+depresses+glutamate+release+by+reducing+neuronal+excitability+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction.</a> J. Physiol. 558, 489-502 (2004).</li>
<li>Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+vivo+neuronal+transport+in+genetic+model+organisms+using+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices.</a> Traffic. 12, 372-385 (2011).</li>
<li>Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chips+for+in+vivo+imaging+of+cellular+responses+to+neural+injury+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chips for in vivo imaging of cellular responses to neural injury in Drosophila larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li>
<li>Schmid, A., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neuromuscular+junctions%3A+histology+and+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of neuromuscular junctions: histology and in vivo imaging.</a> Methods Mol. Biol. 420, 239-251 (2008).</li>
<li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+turnover+of+the+Wallenda%2FDLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).</li>
<li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda%2FDLK+MAP+kinase+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J. Neurosci. 32, 610-615 (2012).</li>
<li>Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Laser+Axotomy+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo Laser Axotomy in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li>
<li>Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+a+Low-budget+Laser+Axotomy+System+to+Study+Axon+Regeneration+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (57), (2011).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2.</a> 2, 2024-2032 (2007).</li>
<li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).</li>
<li>Rao, S., Lang, C., Levitan, E. S., Deitcher, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+neuropeptide+expression%2C+transport%2C+and+exocytosis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Visualization of neuropeptide expression, transport, and exocytosis in Drosophila melanogaster.</a> J. Neurobiol. 49, 159-172 (2001).</li>
<li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even-skipped%2C+acting+as+a+repressor%2C+regulates+axonal+projections+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130, 5385-5400 (2003).</li>
<li>Rietdorf, J., Steitz, A., Heidelberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+unmixing+macro+for+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22European+Advanced+Light+Microscopy+Network%22%5BJournal%5D)">Linear unmixing macro for ImageJ.</a> European Advanced Light Microscopy Network. , (2004).</li>
<li>Koon, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulatory+and+paracrine+control+of+synaptic+and+behavioral+plasticity+by+octopaminergic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Autoregulatory and paracrine control of synaptic and behavioral plasticity by octopaminergic signaling.</a> Nat. Neurosci. 14, 190-199 (2011).</li>
<li>Yarali, A., Gerber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Neurogenetic+Dissociation+between+Punishment-%2C+Reward-%2C+and+Relief-Learning+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Neurogenetic Dissociation between Punishment-, Reward-, and Relief-Learning in Drosophila.</a> Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).</li>
<li>Kuo, C. T., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrite-specific+remodeling+of+Drosophila+sensory+neurons+requires+matrix+metalloproteases%2C+ubiquitin-proteasome%2C+and+ecdysone+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dendrite-specific remodeling of Drosophila sensory neurons requires matrix metalloproteases, ubiquitin-proteasome, and ecdysone signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15230-15235 (2005).</li>
<li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Microfluidic+Devices+for+in+vivo+Imaging+of+C.+elegans%2C+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li>
<li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+highwire+ubiquitin+ligase+promotes+axonal+degeneration+by+tuning+levels+of+nmnat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein.</a> PLoS Biol. 10, (2012).</li>
<li>Shin, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74, 1015-1022 (2012).</li>
<li>Watkins, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DLK+initiates+a+transcriptional+program+that+couples+apoptotic+and+regenerative+responses+to+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">DLK initiates a transcriptional program that couples apoptotic and regenerative responses to axonal injury.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 4039-4044 (2013).</li>
<li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li>
<li>Guo, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), (2009).</li>
<li>Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+up-regulation+of+microtubule+dynamics+and+polarity+reversal+during+regeneration+of+an+axon+from+a+dendrite%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 767-777 (2010).</li>
<li>Miller, D. L., Ballard, S. L., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+synaptic+growth+and+function+in+Drosophila+with+an+extended+larval+stage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Analysis of synaptic growth and function in Drosophila with an extended larval stage.</a> J. Neurosci. 32, 13776-13786 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Maken of verkrijgen van de larve chip: De larve chip bestaat uit een PDMS blok is (de zogeheten PDMS chip &#39;) bevestigd aan een glazen dekglaasje. Het protocol in stap 1 beschrijft de procedure voor het maken en gebruiken larve chips, uitgaande van een SU-8 mal is beschikbaar. De SU-8 matrijs microfabricated fotolithografische patroonvorming door een 140 urn dikke SU-8 fotoresistlaag op een silicium wafer (voor details zie Ghannad-Rezaie et al.. 12). Zoals de microfabricage van de SU-8 schimmel toegang tot gespecialiseerde apparatuur nodig is, raden wij het ​​bestellen van een microfabrication faciliteit (bv. De LNF faciliteit aan de Universiteit van Michigan 14), of van een gieterij door toezending van het ontwerp van de chip die wordt verstrekt als een aanvullend bestand. Wil men het ontwerp van de chip PDMS (bijv. voor gebruik met larven van verschillende afmetingen), een CAD-software DXF (bijv. Autocad) behandelt veranderen worden gebruikt. Een SU-8 schimmel kan ook worden gemaakt in eigen huis volgens de instructies in Mondal et al.. Kan 27 Veel lezers vinden het handig om gewoon het verkrijgen van een monster PDMS chip om te proberen de techniek voor het vervaardigen van hun eigen chips. Deze wordt op verzoek ter beschikking worden gesteld. Gebruik van de microfluïdische &#39;larve chip&#39; voor live-imaging: De immobilisatie werkwijze de larve chip vermijdt het gebruik van anesthetica en in plaats daarvan omvat druk, via de toepassing van een vacuüm, om beweging van het dier te beperken. Hoewel dieren immobilisatie kan overleven in de chip voor meerdere uren 12, een kortere immobilisatie periode (5-15 min) wordt aanbevolen. Dit is genoeg tijd voor de beeldvorming van vele cellulaire gebeurtenissen van belang, met inbegrip van veranderingen in de intracellulaire calcium, of snel axonale transport. Dit is ook voldoende tijd voor de gewenste manipulaties in levende dieren, zoals laser gebaseerde microchirurgie, photobleaching en photoconverSion. Om gebeurtenissen in lengterichting over een langere periode in een enkel dier te bestuderen, dieren kunnen worden in de chip meerdere malen geplaatst en afgebeeld, gescheiden door perioden van rust. Druivensap agar-platen zijn ideaal voor rust tussen beeldvorming sessies, omdat ze zorgen voor een gemakkelijke bron van voedsel en vocht. Meerdere beeldvorming sessies wel invloed larvale overleving tot op zekere hoogte, omdat elke sessie brengt een aantal risico&#39;s voor het beschadigen van het dier (zie deel 2 in het oplossen van problemen, hieronder). Dieren kunnen routinematig worden afgebeeld&gt; 5 keer in de loop van twee dagen met een meer dan 50% overlevingskans. Aangezien de dieren niet verdoofd, ze gezond en beweeglijk onmiddellijk na afgifte van het vacuüm in de chip. Er is derhalve geen behoefte aan herstel tussen beeldvorming sessies, dus de tijd afstand tussen sessies is flexibel en kan worden aangepast aan de doelstellingen van het experiment. Problemen oplossen: De meest voorkomende technische isvervolgt met larve chip en aanbevolen oplossingen zijn de volgende: (1) Het dier is te veel bewegen. Te veel mobiliteit kan interfereren met de beeldvorming doelen. De meest voorkomende redenen als de larve chip a) het dier is te klein voor de chip, of b) de toegepaste onderdruk tijdens de immobilisatie stap wordt aangetast. De larve chip beschreven in dit protocol is bedoeld voor de vroege geënsceneerde larven 3 e instar. De optimale grootte van het dier 3.5-4 mm (aan de sagittale as). Om de onderdruk voldoende is, trekt de spuit 2-2,5 ml of totdat weerstand wordt gevoeld in de handgreep. Een indicatie dat het vacuüm werkt, is dat kleine luchtbellen in de perimeter kanaal kan worden gezien bewegen langzaam naar het vacuüm bron. Een andere indicatie dat het dekglaasje altijd moet reizen met de chip wanneer de chip wordt opgetild boven (en dit is de aanbevolen methode voor het transporteren van de kamerzodra de larven is gepositioneerd en het vacuüm is ingeschakeld). Het vacuüm kan worden bemoeilijkt indien er scheuren in de buis, of er olie in de buis. Dit kan gemakkelijk worden opgelost door het vervangen van de 23 G afgeven naaldpunt en polyethyleen-50 buis (van stap 1,6-1,14). (2) Het dier sterft na beeldvorming in de chip. De procedure is bedoeld om minimale stress veroorzaken bij het ​​dier, en andere dieren, wild-type genotype hebben een&gt; 90% overlevingskans, zelfs na een uur van immobilisatie op de chip 12. Aangezien sommige genotypes minder veerkrachtig om de stress van de chip kan zijn, controleer dan eerst dat wild-type dieren (bijvoorbeeld Canton S) overleven de immobilisatie techniek. a) De meest voorkomende oorzaak van sterfte is onjuist positioneren van de larve (zie figuren 2G-H). Als delen van de cuticula, het hoofd en de luchtpijp zijn niet helemaal in de kamer, dan kunnen ze beschadigd raken tijdens de immobilisatie, en eenlarve dat te groot is voor de chip (&gt; 4 mm) minder kans om te overleven. b) Een minder voorkomende oorzaak voor letaliteit is het gebruik van te veel druk of vacuüm bij het plaatsen van chip. Indien juist gepositioneerd in de chip, de druk die door het vacuüm wordt goed verdragen. Overmatige druk, hetzij van het vacuüm of in de eerste fase van het positioneren van het dier kan een probleem zijn. Het beste is om de mate van druk die nodig is door empirisch onderzoek met wildtype larven van de juiste grootte te leren. c) Als er te veel Halocarbonolie dekt luchtpijp van het dier het dier kan mogelijk problemen met de lange-termijn overleving. De olie speelt een aantal belangrijke rollen in de chip: het is belangrijk voor het creëren van het vacuüm, de optiek tijdens de beeldvorming en uitdroging tegengaat in de chip. Overmatige olie moet worden vermeden. (Dit kan ook leiden tot olie in de buizen en spuit, afbreuk het vacuüm). De voorgestelde protocol lagen gewoon de ventrale zijde van de larve met olie, dan reGaat overtollige olie door plaatsing van de larve op een schoon dekglaasje alvorens naar de uiteindelijke dekglaasje voor de beeldvorming. d) fototoxiciteitstests kan worden ervaren van de opnamesessie. Zoals bij elke live-imaging toepassing, is het ideaal om korte belichtingstijden te gebruiken met een lage intensiteit laserlicht, die het best bereikt met behulp van een zeer gevoelige camera of detector. Probeer om de verlichting te minimaliseren met UV-licht, waaronder een breed spectrum licht gecreëerd door Hg lichtbronnen. Andere kwesties en toekomstige richtingen: Aangezien deze methode niet verdovingsmiddelen gebruiken, het hart van het dier blijft kloppen. Dit zorgt voor een aantal onvermijdelijke mobiliteit, die beeldvorming in sommige plaatsen meer dan anderen beïnvloedt. De voorbeelden tonen dat de buikzenuwkoord, segmentale zenuwen en lichaamswand gemakkelijk kan worden afgebeeld zonder tussenkomst van de hartslag. In gevallen waarin de hartslag beïnvloedt beeldvorming, kan de regelmatige bewegingen soms worden gecorrigeerd voor metin analyse software (bijvoorbeeld de Image Stabilizer plugin voor ImageJ). Dit werkt goed als afzonderlijke objecten bewegen op een snelle tijdschaal (bijvoorbeeld ~ 1 micrometer / sec voor snelle axonale transport) of op een zeer langzame tijdschaal (minuten tot uren). Echter, wanneer het object (en) van belang bewegen met een bereik van snelheden en richtingen, kan het moeilijker zijn om te corrigeren voor de hartslag veroorzaakte bewegingen. Een ander probleem is een lichte variatie in de optica van dier tot dier, of tussen meerdere beeldvorming sessies van hetzelfde dier in de chip. Hoe dieper het voorwerp van belang is in het dier, hoe groter deze variant zal zijn. Segmentale zenuwen en de buikzenuwkoord zijn doorgaans te diep binnen dan dieren af ​​te beelden op een gewone microscoop. Het milde druk ervaren in de larve chip duwt Maar deze structuren zeer dicht bij de nagelriem en dekglaasje. De exacte afstand van deze structuren van het dekglaasje zullen kleine schommelingen van tr hebbenial voor de rechter. De variatie objecten sluit de cuticula, zoals de cellichamen van sensorische neuronen, minder. Daarom is het belangrijk, met name voor het maken van metingen van de intensiteit, een groot aantal dieren en onafhankelijke experimenten gebruiken in verband met de verscheidenheid van optiek. Hoewel de hier getoonde voorbeelden gericht op processen in neuronen, moet de aanpak vatbaar voor een structuur beeldvorming in het dier dat in de focus diepte van het microscoopobjectief kan worden gebracht zijn. Dit omvat de cuticula, lichaam muur spieren, en hun NMJs. Luchtpijp aan de buikzijde van het dier en mogelijk delen van het spijsverteringskanaal worden afgebeeld. Het dier kan ook worden gepositioneerd met zijn dorsale zijde naar het dekglaasje korte termijn beeldvorming van structuren nabij het dorsale oppervlak. De mogelijkheid om beeld structuren diep in het dier wordt beperkt door de werkafstand van het microscoopobjectief gebruikt. Structuren zoals imaginal schijven zijn niet toegankelijk voor een sterke vergroting (bijv. 40X) doelstellingen. De larve chips beschreven in dit protocol zijn ontworpen voor larven in de 3 fase vroege derde instar (variërend in grootte 3,5-4 mm). Maar veel interessante vragen vereisen beeldvorming in verschillende larvale stadia. Kleinere chips instar larven nd 2, of groter chips geschikt late 3e stadia plaats kan gemakkelijk worden ontworpen met behulp van hetzelfde principe. (Aanvullende Figuur 1 bevat een gemakkelijk aanpasbaar DXF-bestand voor het maken van siliconen mallen met veranderde kamer maten). De simpele principe van de omkeerbare afdichting kan zelfs worden toegepast op andere organismen zoals C. elegans of zebravis, met de belangrijkste variant zijn de kamergrootte. Een bruikbare toekomstige richting is een chip die veel dieren kunnen immobiliseren tegelijk te gebruiken voor screeningsdoeleinden ontwerpen. Echter, dit zou het ontwerp moeten significant verschillend te zijnvan het huidige apparaat, waarbij de punten van positioneren van de dieren in de chip moet onafhankelijk geregeld voor elk dier. De zenuw verliefd test voor het bestuderen van letsel reacties in larvale perifere zenuwen: De zenuw verbrijzeling test beschreven voor larvale segmentale zenuwen is een eenvoudige methode voor het introduceren van een letsel van perifere axonen in Drosophila. Voordelen van deze methode zijn: a) het is eenvoudig uit te voeren met standaard gereedschap in een Drosophila lab (een stereomicroscoop CO2 bron en forceps), b) kan snel worden uitgevoerd voor vele dieren, waardoor biochemische analyse zenuw koorden na verwonding haalbare 14 c) de moleculaire en cellulaire reacties op deze letsels zijn zeer reproduceerbaar 14,15,28 en kan worden gebruikt om processen die belangrijk zijn in gewervelde neuronen 29,30 ontdekken. Alternatieve werkwijzen voor het verwonden van neuronen te focusa high-power laser, bijvoorbeeld een gepulste UV of femtosecondlaser, een axon te verbreken via laser microchirurgie 17,31-33. De larve chip is een ideale methode voor het positioneren van het dier zoals microchirurgie. Vanwege kleine verschillen in de optica tussen onderzoeken zoals hierboven, de laser gebaseerde methode kan moeilijker te reproduceren larven, vooral in larvale segmentale zenuwen. Ook laser gebaseerde axonalverwonding vergt meer tijd om elk dier te positioneren, dus is moeilijk uit te voeren op grote schaal (met een groot aantal dieren). Problemen oplossen: De meest voorkomende technische kwestie van de zenuw te verpletteren is de dood van schade aan inwendige organen. Bij het uitvoeren van de crush, is het belangrijk de buikzenuwkoord, speekselklieren, of darmen niet bekneld raken. Het is ook belangrijk de cuticula niet te doorboren. Deze kwesties worden best vermeden doordat de tang bij een hoek van 45 ° naar de cuticula oppervlakteactievee (zie figuur 3). De kwaliteit van de tang heeft een grote invloed op de effectiviteit van de crush en overleving daarna. Wij raden Dumostar nummer 5 tang. Om hun scherpte behouden, moet de tang voorzichtig worden behandeld, niet voor andere doeleinden gebruikt, en vervangen zodra zij bot of verbogen. De grootte van het dier kan ook invloed op de effectiviteit van de crush. Kleine dieren (minder dan 3 mm in lengte) zijn veel minder kans om de schade te overleven. Bij grotere dieren, (zwerven 3e stadia), is het moeilijker om de zenuwen te lokaliseren en schade aan de grote speekselklieren en darmen voorkomen, en er is minder tijd om verwonding respons studie voor de verpopping. De zenuw verliefd is het meest effectief uitgevoerd in larven begin 3 e instar (die ~ 3-4,5 mm in de lengte langs de achterwaartse as staan). Het voedselbron dat het dier wordt verhoogd op kan rakensterkte van de cuticula en de overleving na de crush. Het wordt aanbevolen om dieren in voedsel gemaakt van een standaard gist-glucose recept verhogen. De beste methode om te leren hoe je de crush effectief te doen is om te oefenen op veel dieren, eerst met het primaire doel van het bereiken van de overleving (en niet verpopping) 24 uur na de crush. Beginners hebben doorgaans een lage overlevingskans (bijv. 10%), maar zodra de techniek wordt aangeleerd, kan de overlevingskansen bereiken ~ 90%. Andere kwesties en toekomstige richtingen: De crush test biedt een krachtige methode om de kiemen van axon proximale bestuderen om de schade plaats en degeneratie van axonen en synapsen distaal van de verwonding. Terwijl de tarieven van degeneratie variëren tussen de verschillende soorten neuronen, ze zijn zeer reproduceerbaar voor een gegeven type neuron, die bewijs van de reproduceerbaarheid van het letsel assay. In tegenstelling, de regeneratieve &#39;kiemenrespons waargenomen bij proximale axonen is een grotere uitdaging om te studeren. Alle axonen in de deelzenuwvoor initiëren uitgebreide kiemen dicht om de schade website (zie bijvoorbeeld Figuur 6 en Figuur 3). Maar de omvang van kiemen kan variëren van neuron tot neuron, en is moeilijk te kwantificeren. Een vergelijkbare mate en variabiliteit in het kiemen kan worden waargenomen na meer focale laesies van enkele motoneuronen in segmentale zenuwen geïntroduceerd door middel van een UV-pulsed dye laser. We interpreteren het nondiscriminate gerichtheid van de kiemen wordt veroorzaakt door de afwezigheid van leiding signalen in het segmentale zenuwen. Daarentegen sensorisch neuron axons verwond laser dicht bij hun cellichamen ondergaan nieuwe axonale groei in dezelfde richting als de verloren axon 34. Axonen in deze regio van het dier zijn waarschijnlijk blootgesteld aan meer specifieke positie-informatie voor begeleiding van de regenererende axonen. De omgeving binnen segmentale zenuwen waarschijnlijk veel resemblan hebbence voor het milieu die de axonen oorspronkelijk genavigeerd tijdens hun begeleiding in het embryo, dus naar verwachting geen informatie hoeft te regenererende axonen leiden. Een andere beperking voor het bestuderen van de regeneratie met behulp van de deelzenuwvoor verliefd test is dat de benadeelde zintuiglijke en motoneuron axonen hebben nog steeds een aanzienlijke afstand tot (0,25-1 mm) om hun doel te bereiken, en een beperkt tijdsbestek (&lt;3 dagen) te dekken voordat het dier ondergaat verpopping. Een recente studie heeft een genetische manipulatie van de prothoraciotropic hormoon receptor die de duur van de 3e instar larvale stadium 35 triples geïdentificeerd. Deze manipulatie is het tijdschema verlengen bestuderen van de terugwinning en degeneratie van neuronen na verwonding significant, 9 in plaats van 3 dagen. Dit kan lang genoeg om nieuwe evenementen, zoals de heraansluiting van een gewonde axon met zijn postsynaptische doel te observeren zijn, vooral als de schade wordt veroorzaakt in de buurt van de synaptische einde.

De fruitvlieg, Drosophila melanogaster, is gebruikt als modelorganisme voor meer dan 100 jaar, en is behulpzaam geweest bij het ​​definiëren fundamentele signalering en ontwikkelingstrajecten die geconserveerd van ongewervelde menselijke bewezen. Live-beeldvorming is een belangrijke benadering van het bestuderen van cellulaire mechanismen, en de eenvoudige bouwplan en doorschijnende cuticula van de Drosophila larve maakt het een aantrekkelijk systeem voor live-imaging, met name omdat er veel genetische tools beschikbaar voor het uitdrukken van fluorescent gelabelde eiwitten in specifieke celtypen. Een belangrijke uitdaging voor live-imaging technieken is om niet-invasief te immobiliseren en de positie van een dier voor microscopie. Conventionele benaderingen omvatten immobilisatie dissectie 1,2 of gebruik van chloroform, beide doden dier. De verdovingsmiddelen ether 4 en isofluorane 5-8 zijn ook gebruikt. Terwijl anesthetica bieden veel voordelen, Ze neurale activiteit en belangrijke fysiologie (inclusief de hartslag) 9-11 remmen ook, dus kan het proces bestudeerd beïnvloeden en stress creëren op het dier. Er zijn ook menselijke bezorgdheid over de veiligheid voor het werken met ether en isofluorane. We hebben een drugsvrije methode om Drosophila larven te immobiliseren in een enkele laag PDMS microfluïdische apparaat, dat noemen we de &#39;larve chip&#39; 12 ontwikkeld. Dit protocol beschrijft hoe inwinnen of de larve chip, en hoe deze te gebruiken voor live-imaging in larven 3 e instar vroeg-geënsceneerd. De chip bestaat uit een-gezellige-passende microkamer, die, op verzoek van een vacuüm via een spuit, immobiliseert het dier via zachte mechanische kracht. De immobilisatie methode brengt ventrale structuren zoals de zenuw koord, segmentale zenuwen, en het lichaam muur spieren, in de nabijheid van een glazen dekglaasje. Dit zorgt voor een hoge resolutie afbeelding van dergelijke structuren met hoge numerieke apertuur (hoge vergroting) doelstellingen. Voordelen van de larve chip opzichte van andere conventionele technieken omvatten de volgende: (i) gebruik van de larve chip vervangt het gebruik van chemische stoffen, waardoor in vivo beeldvorming van niet-verdoofde dieren. (Ii) Larven herstellen direct na vrijlating uit de chip (in tegenstelling tot een 2 uur herstelperiode voor isofluorane 8,13). Dit zorgt voor beeldvorming in brede tijdschalen, variërend van milliseconden tot enkele minuten, uren en dagen. (Iii) het gebruik van PDMS, een gasdoorlatend materiaal zorgt voor continue diffusie van zuurstof / lucht uit de omgeving in de larve lichaam. (Iv) De chip is makkelijk en veilig te gebruiken, en (v) het is herbruikbaar en kan worden vervaardigd tegen minimale kosten. Naast de gebruiksaanwijzing van de larve chip, dit protocol enkele voorbeelden van het gebruik studeren neuronale gebeurtenissen in 3e instar larven geven. Deze omvatten live-beeldvorming van Axonal transport, calcium reacties op letsel, en time-lapse-studies van de handel in foto-converteerbare eiwitten over lange afstanden en tijdschalen. Een andere toepassing van de chip neuronale reacties op axonalverwonding bestuderen. Hiervoor is een extra procedure is beschreven (in deel 3) voor het verwonden van axonen binnen perifere zenuwen door een segmentale zenuw crush. Deze eenvoudige bepaling kan zowel snel en reproduceerbaar uitgevoerd onder standaard ontleding stereomicroscoop, die zorgt voor veel dieren tegelijk te verwerken. Cellulaire reacties op de schade kan worden bestudeerd door live-imaging in de larve chip.

<table><tbody><tr><td>0.5 mm Polyethyleen buis</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-11B</td><td>Polyethyleen buis, I.D. = 0.023 in O.D. = 0.038 in</td></tr><tr><td>1 mm Polyurethaan buis</td><td>Fisher Scientific</td><td>BB521-63</td><td>Polyurethaan buis, I.D. = 0.063 in&nbsp; O.D. = 0.125 in</td></tr><tr><td>Barb naar barb connector</td><td>Bio Rad</td><td>732-8300</td><td>0.8 mm barb naar barb connector</td></tr><tr><td>3-weg Stopkraan klep</td><td>Bio Rad</td><td>732-8104</td><td>Schroefklep voor de spuit</td></tr><tr><td>Spuit (20 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-33</td><td>Schroef 20 ml spuit voor&nbsp; vacuüm genereren</td></tr><tr><td>Dispensernaalden, 23 G (0.4 mm I.D., 0.6 mm O.D.)</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A684</td><td>Naald voor uitlaatverbinding</td></tr><tr><td>Dispensernaalden, 21 G, (0.6 mm I.D.,&nbsp; 0.8 mm O.D.)</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A679</td><td>Naald voor uitlaatverbinding</td></tr><tr><td>Halocarbon olie</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td>Halocarbon olie 700</td></tr><tr><td>Dumostar nummer 5 Pincet</td><td>Roboz</td><td>RS-498</td><td>Voor zenuwbreuk</td></tr><tr><td>PDMS Kit (Basis en uitharder)</td><td>Ellsworth</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>Dow Corning Sylgard 184 Siliconen Encapsulant 0.5 kg Kit Clear</td></tr><tr><td>Glas dekvlakken</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-C</td><td>24 mm x 40 mm (dikte volgens aanbeveling voor uw microscoopobjectief)</td></tr><tr><td>Wegwerp plastic beker (9 oz)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastiek koffieschuimer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veiligheidsmesje</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Druivensap agar platen</td><td></td><td></td><td>Zie <a href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925">http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925</a> voor recept</td></tr></tbody></table>

met behulp van microfluidics chips voor live imaging en studie van injury reacties in<em&gt; drosophila</em&gt; larven

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live-beeldvorming is een belangrijke techniek voor het bestuderen celbiologische processen, maar dit kan een uitdaging in levende dieren. De doorschijnende cuticula van de Drosophila larve maakt het een aantrekkelijke modelorganisme voor live-imaging studies. Echter, een belangrijke uitdaging voor live-imaging technieken is om niet-invasief te immobiliseren en de positie van een dier op het microscoop. Dit protocol biedt een eenvoudige en makkelijk te gebruiken methode voor het immobiliseren en beeldvorming Drosophila larven op een polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdische apparaat, dat noemen we de &#39;larve chip&#39;. De larve chip bestaat uit een gezellige-passende PDMS microkamer dat een dunne glazen dekglaasje, die, op verzoek van een vacuüm via een spuit, immobiliseert het dier en brengt ventrale structuren zoals de zenuw koord, segmentale zenuwen, en het lichaam wordt bevestigd muur spieren, in de nabijheid van het dekglaasje. Dit zorgt voor een hoge resolutie imaging, en belangrijker nog, vermijdt het gebruik van anesthetics en chemicaliën, die het onderzoek van een groot aantal fysiologische processen vergemakkelijkt. Aangezien larven herstellen gemakkelijk van de immobilisatie kunnen ze gemakkelijk worden veelvuldige beeldvorming sessies. Dit zorgt voor longitudinale studies over de tijd cursussen, variërend van uren tot dagen. Dit protocol beschrijft stap voor stap hoe u de chip en hoe de chip voor live-imaging van neuronale gebeurtenissen in larven 3 e instar benutten bereiden. Deze gebeurtenissen zijn het snelle transport van organellen in axonen, calcium reacties op letsel, en time-lapse-studies van de handel in foto-converteerbare eiwitten over lange afstanden en tijdschalen. Een andere toepassing van de chip is om regeneratieve en degeneratieve reacties op axonalverwonding bestuderen, zodat het tweede deel van dit protocol beschrijft een nieuwe en eenvoudige procedure voor het verwonden van axonen binnen perifere zenuwen door een segmentale zenuw crush.

Drosophila larven zijn een aantrekkelijk model systeem voor live-imaging vanwege hun doorschijnende cuticula en krachtige genetica. Dit protocol beschrijft hoe u een single-layer PDMS apparaat, genaamd de &#39;larve chip&#39; voor live-beeldvorming van cellulaire processen binnen neuronen van 3 e instar Drosophila larven benutten.

Met behulp van Microfluidics Chips voor Live Imaging en Studie van Injury Reacties in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om drosophila-larven op een niet-invasieve manier te immobiliseren voor live imaging met behulp van een aangepaste microfluïdische kamer. Een derde-instar-larve wordt in de chip geplaatst met wat olie om te helpen de larve af te sluiten. Vervolgens wordt de chip bovenop de larve geplaatst, zodanig dat het lichaam in de kamer past.De chip is verbonden met een spuit zodat er een vacuüm kan worden aangelegd. De beweeglijkheid van de larven wordt hierdoor beperkt en structuren in het ventrale deel van het dier worden dicht tegen het dekglas gedrukt. Met behulp van een confocale microscoop kunnen structuren eenvoudig worden afgebeeld, zoals de details van axonterminalen van sensorische neuronen en de regeneratie van segmentale zenuwen na geïnduceerde zenuwbeschadiging.Andere methoden om josepha te immobiliseren voor live imaging maken gebruik van chloroform, ether of ISO-anesthetica. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gebruik van dergelijke toxines, die de fysiologie van het dier beïnvloeden, wordt vermeden. Een bijkomend voordeel van de afwezigheid van toxines is dat de larve veilig is om mee te werken. De robuuste immobilisatie maakt imaging van snelle gebeurtenissen mogelijk, zoals sneller axonaal transport en veranderingen in intracellulair calcium.Een enkele larve kan in de chip worden geïmmobiliseerd en meerdere keren worden afgebeeld. Dit maakt time-lapse imaging mogelijk van processen die plaatsvinden gedurende een periode van maximaal 72 uur. Begin met het verkrijgen van een proef-PDMS-chip om dit protocol uit te proberen.Instructies voor het maken van een A-P-D-M-S chip vanuit een SU-8 mal kunnen worden gelezen in het tekstprotocol met behulp van een doseernaald van 21 gauge. Maak een gaatje in de vacuümpoort van de PDMS-chip voor een geïnverteerde microscoop. Verwijder een naald van 23 gauge uit de basis, de lock hub, door een paar keer te draaien.Steek vervolgens de naaldpunt in een klein stukje polyethyleenslang, zodat de slang minstens één millimeter van de naald bedekt. Gebruik een scheermesje om het overtollige deel van de slang af te snijden. Dit laat een plastic ring over die als afdichting kan dienen.Steek de punt van de naald (23 gauge) in het gat van de vacuümpoort. Maak bij een rechtopstaande microscoop met een doseernaald (21 gauge) een tweede gat in de zijkant van de PDMS-chip. Dit gat biedt zijdelingse toegang tot het eerste gat.Steek vervolgens de naaldpunt van 23 gauge en de slangring in het zijgat. Plaats een stukje dubbelzijdige tape over de bovenkant van de PDMS-chip om het bovenste gat af te dichten. Bevestig een stuk polyethyleenslang van 20 centimeter tussen de naaldpunt die in de vacuümpoort van de chip is gestoken en een van de poorten van een driewegkraan.Bevestig vervolgens een spuit van 20 milliliter aan een van de twee resterende poorten van het ventiel, waarbij de laatste poort open blijft. Reinig de PDMS-chip met transparante plakband. Bevestig een stuk plakband aan de onderkant van de chip.Zorg ervoor dat de tape het gehele PDMS-oppervlak raakt en trek de tape vervolgens af. Herhaal deze reinigingsmethode drie keer. Aangezien de PDMS-chip herbruikbaar is, is het zeer belangrijk om olieresten te verwijderen, omdat deze de hechting van PDMS aan glas kunnen beïnvloeden. Transfer vroege foerageergedragingen.Verplaats larven in het derde stadium van het voedingsmedium naar een Petrischaal met water. Ze moeten tussen de 3,5 en vier millimeter lang zijn om correct in de chip te passen. Was de larven om het kweekmedium te verwijderen.Breng vervolgens met behulp van een pincet een kleine druppel halocarbon 700-olie aan in het midden van een glazen dekglas en pak voorzichtig een gewassen larve op. Plaats deze kort op een lichtgewicht doekje om hem af te drogen en verplaats hem daarna gedurende 10 seconden naar de olie. De druppel moet klein genoeg zijn zodat de trachea van de larven niet worden bedekt.Plaats de larven vervolgens kortstondig op een schoon glazen dekglas en verplaats ze naar een ander dekglas. Hiermee wordt er nog wat meer olie verwijderd. Let op de oriëntatie van de larven om het neurale koord en de segmentale zenuwen te kunnen afbeelden.De ventrale zijde moet naar beneden zijn gericht. De gemakkelijk te identificeren trachea-buisjes moeten naar boven wijzen. Plaats nu voorzichtig de PDMS-chip bovenop de larven.Lijn de larven uit in het centrum van de microkamer. De larve moet met de achterzijde naar de vacuümpoort gericht zijn en mag de randen van de kamer niet raken. Zodra de uitlijning voltooid is, wordt de PDMS-chip tegen het glazen dekglas gedrukt om een goede afdichting te verkrijgen.Controleer vervolgens of de larve volledig is omsloten in de microkamer. Zet nu het driewegkraantje naar de spuit. Houd de PDMS-assemblage stevig vast en trek de zuiger van de spuit naar achteren om twee tot 2,5 millimeter lucht te onttrekken totdat er weerstand wordt gevoeld.Hierdoor wordt een vacuüm gecreëerd. Sluit vervolgens de klep. Om het vacuüm zorgvuldig te behouden, controleert u de larven nogmaals.Het lichaam moet worden geïmmobiliseerd in de microkamer, waarbij de trachea zichtbaar moet blijven. De rest van de PDMS-chip moet in contact staan met het dekglas. Oriëntaties zoals deze zijn niet correct. Maak nu beelden van de larven.Als u een rechtopstaande microscoop gebruikt, bevestig dan de bovenzijde van de chip met dubbelzijdige tape aan de tafel. Wanneer de beeldvorming is voltooid, laat u het vacuüm los. Verwijder vervolgens de PDMS-chip van het dekglas.De larve moet onmiddellijk beweeglijk zijn met behulp van een pincet. Breng de larven terug naar een druivensap-agarplaat voor herstel. Plaats een enkele geneesde larve op een druivensap-agarplaat.Draai het dier onder de stereomicroscoop om zodat de ventrale zijde naar boven ligt. Om het ventrale zenuwstreng en de segmentale zenuwen te kunnen visualiseren, moet u ervoor zorgen dat de larve volledig bewegingsloos is. Lokaliseer de zenuwstreng en de speekselklieren.Het is belangrijk om deze structuren niet te beschadigen. Lokaliseer het uiteinde van het derde abdominale segment. Een letsel op deze plek beschadigt de meeste zenuwen en is het eenvoudigst te reproduceren zonder het dier te doden.De beschadiging kan ook worden aangebracht in meer posterieure segmenten met behulp van een duo star nummer vijf pincet. Knijp de segmentale zenuwen stevig door de cuticula gedurende 5 tot 10 seconden. Bij een correcte uitvoering blijft de cuticula intact en wordt de lichaamswand niet doorboord.Beheersing vereist oefening nadat het dier na de verwonding met de ventrale zijde naar beneden op de grote plaat is geplaatst. Het dier moet in staat zijn om zijn kop te bewegen en te eten. Als de verwonding succesvol was, zal de posterieure helft van de larven verlamd zijn.De larvenchip werd gebruikt om het kinesine-gemedieerde transport van synaptische blaasjes binnen individuele perifere axonen in beeld te brengen. De anterograde beweging van deze blaasjes werd gemeten op ongeveer 1,0 microns per seconde. De retrograde beweging werd gemeten op 0,8 microns per seconde.De immobilisatietechniek werd gebruikt voor lasersmicrochirurgie met een gepulste UV-kleflaser. Calciumgehaltes werden waargenomen in specifieke neuronen dankzij een genetisch gecodeerde indicator. G camp 3.0 Een calciumpiek wordt gedetecteerd na een sensorisch neuron.De dendriet is doorgesneden. Door het dier rust te gunnen tussen de beeldvormingssessies kunnen cellulaire gebeurtenissen in de loop van de tijd worden waargenomen. Na het verbrijzelen van de axonen van de motorneuronen in de emeric-regio vond er nieuwe uitsprouting plaats van de proximale axonstomp.Ondertussen vormden de distale axonen varicositeiten en raakten ze gefragmenteerd door het proces van walleriaanse degeneratie. Met behulp van de larva chip tracking is fotoconversie van fluorescerende eiwitten in vivo ook mogelijk. Een DRA twee alpha tubuline-fusie-eiwit, tot expressie gebracht in sensorische neuronen van klasse vier, werd gefotoconverteerd in de cellichamen.Binnen twee dagen was een aanzienlijke hoeveelheid fotogevervormd eiwit verplaatst naar de axonterminalen van de sensorische neuronen, ongeveer een millimeter verwijderd van de oorspronkelijke locatie in het cellichaam. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de larvenchip kunt gebruiken voor live-imaging van drosophila-larven en hoe u een zenuwcrush-letsel kunt veroorzaken. Zodra deze technieken onder de knie zijn, kunnen larven in slechts enkele minuten op de microscoop worden geplaatst.Het pletten van de zenuw gaat even snel. Daarom kunnen deze procedures worden ingezet voor grootschalige experimenten, zoals genetische screens. De chip kan worden gebruikt om structuren aan de ventrale zijde van de drosophila-larven te beelden.Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, spieren, neuromusculaire juncties, sensorische neuronen, perifere zenuwen en het ventrale zenuwstreng. Deze procedure kan ook worden gebruikt voor live-imaging van het larvale hart, de speekselklieren en de trachea. De larvale chip die in deze video wordt gebruikt, is gedimensioneerd voor dieren met een lengte tussen 3,5 en vier millimeter.Voor beeldvorming op kleinere of grotere schaal kunnen eenvoudig chips met een kleinere of grotere kamer worden gemaakt. Raadpleeg het aanvullende ontwerpbestand en de instructies voor het maken van PDMS-chips. De instructies voor het maken van de PDMS-chips zijn opgenomen in het geschreven protocol.Wij kunnen u een voorbeeldchip sturen als u contact met ons opneemt.

using-microfluidics-chips-for-live-imaging-study-injury-responses

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We structurele kenmerken van de Glia-neuromusculaire synapsen beschreven in een roman Inside-out het prepareren van weefsels van levende larven gebruik van fluorescerende kleurstoffen met confocale microscopie. We leven zenuwuiteinden gelabeld met fluorescente primaire antilichamen tegen HRP, en ook gevisualiseerd het perisynaptic ruimte met fluorescerende dextranen.

Het visualiseren van de Live- Drosophila Gliale-neuromusculaire Junction met fluorescente kleurstoffen

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

De voorbereiding van de ontwikkeling en Adult Drosophila Hersenen en retinae voor Live Imaging

Een eenvoudige microfluïdische apparaat is ontwikkeld om verdoving gratis uit te...

Eenvoudige Microfluïdische Inrichtingen voor<em&gt; In vivo</em&gt; Beeldvorming van<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; En zebravis

Deze video beschrijft hoe u micro-invoegingen uitvoert die reagentia leveren in levende Drosophila-embryo's. Onderzoekers kunnen deze methode gebruiken om exogene verbindingen zoals nucleïnezuren en eiwitten te introduceren tijdens de vroege stadia van embryo-ontwikkeling. Het aanbevolen protocol demonstreert hoe de procedure voor injectie van een oplosbaar reagens moet worden opgezet en uitgevoerd - hier een fluorescerend eiwit voor live beeldvormingsexperimenten.

Micro-injection van Levende Embryo's Drosophila: Vroege Levering van Reagentia aan het Ontwikkelende Embryo

De embryonale epidermis zeer laat stadium Drosophila embryo's verschaft een in vivo systeem voor snelle steekwond respons-analyse en kunnen worden gecombineerd met genetische manipulatie of chemische behandelingen microinjectie studies gaan in wondgenezing voor de vertaling in zoogdierlijke modellen.

Micro-injectie wondproef en<em&gt; In vivo</em&gt; Lokalisatie van epidermale Wound Response Verslaggevers in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s.

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Dit protocol beschrijft een methode voor het monteren van Drosophila larven om langer dan 10 uur ononderbroken time-lapse beeldvorming bij intacte levende dieren te bereiken. Deze methode kan worden gebruikt om veel biologische processen dicht bij de larve lichaam wand beeld.

LarvaSPA, een methode voor het monteren van Drosophila Larve voor lange termijn Time-Lapse Imaging

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Dit protocol beschrijft een microfluïdisch systeem dat neuronale metabole dynamiek modelleert na axonale verwonding, waardoor beeldvorming, multi-omics-analyse en mechanistische studies van intrinsieke metabole remodellering mogelijk zijn.

Microfluïdische chip voor axonale letselmodellen, constructie en het mogelijk maken van multi-omics-analyse

Leer niet-invasieve immobilisatie van Drosophila larven voor live imaging met een PDMS microfluidische chip. Deze methode maakt tijdopnamen van axonale transport en zenuwregeneratie mogelijk zonder giftige anesthetica.

Met behulp van Microfluidics Chips voor Live Imaging en Studie van Injury Reacties in

Meer video's verkennen