Name: PLGA-nanodeeltjes gevormd door enkelvoudige- of dubbele-emulsie met vitamine E-TPGS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Leer PLGA-nanodeeltjes produceren met regelbare grootte door enkelvoudige- of dubbele-emulsie met vitamine E-TPGS als emulgator. Deze methode optimaliseert aangepaste geneesmiddelafgifte voor therapeutische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs hebben geen erkenningen.

1. Nanoparticle Preparatie
Alle stappen met oplosmiddel of opgelost/geëmulgeerde polymeer dienen in een chemische afzuigkap uitgevoerd te worden.
<ol>
	<li>Weeg 100 mg (+/- 5 mg) van poly(lactisch-co-glycolzuur) (PLGA) en plaats in een 13 mm x 100 mm testbuis.</li>
	<li>Breng 1 ml oplosmiddel (ethylacetaat (EtAc) of dichloormethaan (DCM)) over met een glazen serologische pipet naar het monster.</li>
	<li>Dek de bovenkant van de buis af met een klein stukje aluminiumfolie en wikkel de folie stevig vast met Parafilm, zorg ervoor dat de Parafilm strak over de bovenrand van de buis en de onderrand van de folie wordt gewikkeld.</li>
	<li>Markeer het niveau van het oplosmiddel aan de buitenkant van de testbuis. Laat het polymeer een nacht oplossen, voeg de volgende dag extra oplosmiddel toe als er verdamping optreedt. 
	Opmerking: Polymeer kan ook op de dag van de bereiding van de nanodeeltjes worden opgelost, indien nodig. Volg stappen 1.1-1.3, en klop vervolgens krachtig met de vortexer totdat al het polymeer volledig is opgelost (~10 min).</li>
	<li>Bereid een werkgebied in de afzuigkap voor met de volgende apparatuur/materialen naast de ultrasoonbad: een vortexer, twee kleine glazen Pasteur-pipetten met rubberen bulb en een magnetische roerplaat. Plaats een grote beker met ijswater op een standaard onder de ultrasoonbad.</li>
	<li>Voeg 45 ml van 0,3% w/v Vitamine E-TPGS toe aan een 200 ml glazen beker met een magnetische roerstaaf en stel de roersnelheid in op 360 rpm.</li>
	<li>Voeg 2 ml van 0,3% w/v Vitamine E-TPGS toe aan een 13 mm x 100 mm glazen testbuis.</li>
	<li>Voeg geneesmiddel toe: 
	Voor hydrofobe middelen: voeg het encapulant rechtstreeks toe aan de polymeeroplossing (let op om de wanden van de testbuis te vermijden) en klop de buis tot het encapulant homogeen verdeeld is. 
	Voor hydrofiele middelen: emulgeer het encapulant met de polymeeroplossing voordat u verder gaat. Voeg tot 50 μl van het geneesmiddel in water of buffer toe aan het oppervlak van de polymeeroplossing. Soniceer kort om het geneesmiddel met polymeer te emulgeren (meestal 10 sec, of zo nodig om een homogene, ondoorzichtige oplossing te verkrijgen). Deze sonicatiestap moet op ijs worden uitgevoerd.</li>
	<li>Plaats de open polymeer/encapulantbuis nabij de vortexer. Terwijl u de testbuis met Vitamine E-TPGS verticaal en op hoge vortex houdt, gebruikt u een glazen Pasteur-pipet om de polymeer/encapulantoplossing druppelsgewijs toe te voegen. Let op om de zijden van de buis te vermijden en laat de polymeeroplossing rechtstreeks op het oppervlak van de vortexende emulgator druppelen. Nadat de hele 1 ml van de polymeeroplossing is toegevoegd aan de Vitamine E-TPGS, blijft u de oplossing (nu een emulsie) 15 sec kloppen.</li>
	<li>Breng de geëmulgeerde polymeer onmiddellijk over naar de ultrasoonbad. Houd de testbuis ondergedompeld in ijswater en soniceer de emulsie in drie 10 sec stoten (40% amplitude voor een 700 W sonicator, 1/8 in sondepuntgrootte). Beweeg de emulsie op en neer langs de sonde om een gelijkmatige sonicatie te garanderen, wees voorzichtig om de sonde niet aan de zijden of de bodem van de testbuis te laten raken. Pauzeer tussen elke tien seconden sonicatie om de oplossing te laten afkoelen voordat u verdergaat.</li>
	<li>Voeg 1-2 ml van 0,3% Vitamine E-TPGS uit de roerende oplossing toe aan de emulsie met een glazen Pasteur-pipet, die de geëmulgeerde polymeer dunner maakt zodat deze gemakkelijker kan worden gegoten. Giet de emulsie in de roerende oplossing. Herhaal deze stap om alle resterende oplossing uit de testbuis in de roerende oplossing te wassen.</li>
	<li>Laat nanodeeltjes drie uur lang hard worden terwijl u roert. Als het encapulant lichtgevoelig is, kan de beker in aluminiumfolie worden gewikkeld, met de bovenkant opengelaten om verdamping van het oplosmiddel te vergemakkelijken.</li>
</ol>
2. Nanodeeltjes Verzameling
<ol>
	<li>Deel de verharde nanodeeltjes op in twee Oak Ridge centrifugebuizen (30 ml nominaal volume) en balanceer tot binnen 0,1 g.</li>
	<li>Centrifugeer nanodeeltjes in een vaste hoek rotor gedurende 15 min bij 17.000 x g. Langere centrifugeertijden zullen resulteren in het verzamelen van een hoger fractie van kleinere nanodeeltjes.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg, let op om het nanodeeltjespelletje niet te verstoren (water kan worden gegoten of gepipetteerd). Voeg 15 ml diH2O toe en gebruik een waterbadsonicator en/of vortexer om de nanodeeltjes volledig te resuspenderen.</li>
	<li>Combineer de inhoud van de twee centrifugebuizen tot één en herhaal stappen 2.1-2.3 nog 2x, voor een totaal van drie wasbeurten in 30 ml van diH2O elke keer. Het vloeistofvolume van de laatste pelletresuspendering moet 4-5 ml zijn. 
	Een gewichtsverhouding van 1:2 trehalose:polymeer kan op dit punt worden toegevoegd als cryoprotectant (bevries een kleine aliquot van nanodeeltjes zonder trehalose voor SEM-beeldvorming). IJskristallen die zich vormen tijdens het bevriezingsproces kunnen het oppervlak van de deeltjes beschadigen en aggregatie induceren, en de opname van trehalose is getoond om de uniforme en volledige resuspendering van PLGA-nanodeeltjes te verbeteren13.</li>
	<li>Breng de nanodeeltjes over naar een vooraf gewogen 5 ml centrifugebuis en bevries gedurende minimaal 30 min op -80 &#17

<ol><li>Peer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanocarriers+as+an+emerging+platform+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 751-760 (2007).</li>
<li>Jiang, W., Gupta, R. K., Deshpande, M. C., Schwendeman, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+poly%28lactic-co-glycolic+acid%29+microparticles+for+injectable+delivery+of+vaccine+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) microparticles for injectable delivery of vaccine antigens.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 57, 391-410 (2005).</li>
<li>Haag, R., Kratz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+therapeutics%3A+Concepts+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem%22%5BJournal%5D)">Polymer therapeutics: Concepts and applications.</a> Angew. Chem. 45, 1198-1215 (2006).</li>
<li>Tong, R., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+polymeric+nanomedicines%5BTitle%5D)+AND+%22Polym.+Rev%22%5BJournal%5D)">Anticancer polymeric nanomedicines.</a> Polym. Rev. 47, 345-381 (2007).</li>
<li>Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+polymeric+nanoparticles+based+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surf.+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems.</a> Colloids and Surf. B Biointerfaces. 75, 1-18 (2010).</li>
<li>Anderson, J. M., Shive, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradation+and+biocompatibility+of+PLA+and+PLGA+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 28, 5-24 (1997).</li>
<li>Jain, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+manufacturing+techniques+of+various+drug+loaded+biodegradable+poly%28lactide-co-glycolide%29+%28PLGA%29+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The manufacturing techniques of various drug loaded biodegradable poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) devices.</a> Biomaterials. 21, 2475-2490 (2000).</li>
<li>Danhier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA-based+nanoparticles%3A+An+overview+of+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">PLGA-based nanoparticles: An overview of biomedical applications.</a> J. Control. Rel. 161, 505-522 (2012).</li>
<li>Mu, L., Feng, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+controlled+release+formulation+for+the+anticancer+drug+paclitaxel+%28Taxol%29%3A+PLGA+nanoparticles+containing+vitamin+E+TPGS.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">A novel controlled release formulation for the anticancer drug paclitaxel (Taxol): PLGA nanoparticles containing vitamin E TPGS.</a> J. Control. Rel. 86, 33-48 (2003).</li>
<li>Mu, L., Feng, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA%2FTPGS+nanoparticles+for+controlled+release+of+paclitaxel%3A+effects+of+the+emulsifier+and+drug+loading+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">PLGA/TPGS nanoparticles for controlled release of paclitaxel: effects of the emulsifier and drug loading ratio.</a> Pharm. Res. 20, 1864-1872 (2003).</li>
<li>Collnot, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+E+TPGS+P-glycoprotein+inhibition+mechanism%3A+influence+on+conformational+flexibility%2C+intracellular+ATP+levels%2C+and+role+of+time+and+site+of+access%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Vitamin E TPGS P-glycoprotein inhibition mechanism: influence on conformational flexibility, intracellular ATP levels, and role of time and site of access.</a> Mol. Pharm. 7, 642-651 (2010).</li>
<li>Dintaman, J. M., Silverman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+P-glycoprotein+by+D-alpha-tocopheryl+polyethylene+glycol+1000+succinate+%28TPGS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of P-glycoprotein by D-alpha-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate (TPGS).</a> Pharm. Res. 16, 1550-1556 (1999).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly-penetrative%2C+drug-loaded+nanocarriers+improve+treatment+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A.%22%5BJournal%5D)">Highly-penetrative, drug-loaded nanocarriers improve treatment of glioblastoma.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. , (2013).</li>
<li>Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uptake+and+intracellular+fate+of+PLGA+nanoparticles+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The uptake and intracellular fate of PLGA nanoparticles in epithelial cells.</a> Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).</li>
<li>Niwa, T., Takeuchi, H., Hino, T., Nohara, M., Kawashima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+submicron+carriers+for+peptide+drugs%3A+Preparation+of+dl-lactide%2Fglycolide+copolymer+%28PLGA%29+nanospheres+with+nafarelin+acetate+by+a+novel+emulsion-phase+separation+method+in+an+oil+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Biodegradable submicron carriers for peptide drugs: Preparation of dl-lactide/glycolide copolymer (PLGA) nanospheres with nafarelin acetate by a novel emulsion-phase separation method in an oil system.</a> Int. J. Pharm. 121, 45-54 (1995).</li>
<li>Ameller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyester-poly%28ethylene+glycol%29+nanoparticles+loaded+with+the+pure+antiestrogen+RU+58668%3A+physicochemical+and+opsonization+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polyester-poly(ethylene glycol) nanoparticles loaded with the pure antiestrogen RU 58668: physicochemical and opsonization properties.</a> Pharm. Res. 20, 1063-1070 (2003).</li>
<li>Wischke, C., Schwendeman, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+encapsulating+hydrophobic+drugs+in+PLA%2FPLGA+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Principles of encapsulating hydrophobic drugs in PLA/PLGA microparticles.</a> Int. J. Pharm. 364, 298-327 (2008).</li>
<li>Batycky, R. P., Hanes, J., Langer, R., Edwards, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+theoretical+model+of+erosion+and+macromolecular+drug+release+from+biodegrading+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">A theoretical model of erosion and macromolecular drug release from biodegrading microspheres.</a> J. Pharm. Sci. 86, 1464-1477 (1997).</li>
<li>Panyam, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+degradation+and+in+vitro+release+of+a+model+protein+from+poly%28D%2CL-lactide-co-glycolide%29+nano-+and+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">Polymer degradation and in vitro release of a model protein from poly(D,L-lactide-co-glycolide) nano- and microparticles.</a> J. Control. Rel. 92, 173-187 (2003).</li>
<li>Siepmann, J., Faisant, N., Akiki, J., Richard, J., Benoit, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+size+of+biodegradable+microparticles+on+drug+release%3A+Experiment+and+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Effect of the size of biodegradable microparticles on drug release: Experiment and theory.</a> Journal of Controlled Release. 96, 123-134 (2004).</li>
<li>Desai, M. P., Labhasetwar, V., Walter, E., Levy, R. J., Amidon, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+uptake+of+biodegradable+microparticles+in+Caco-2+cells+is+size+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">The mechanism of uptake of biodegradable microparticles in Caco-2 cells is size dependent.</a> Pharm. Res. 14, 1568-1573 (1997).</li>
<li>Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+clearance+and+biodistribution+of+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles.</a> Mol. Pharm. 5, 505-515 (2008).</li>
<li>Barichello, J. M., Morishita, M., Takayama, K., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+hydrophilic+and+lipophilic+drugs+in+PLGA+nanoparticles+by+the+nanoprecipitation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Dev.+Ind.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of hydrophilic and lipophilic drugs in PLGA nanoparticles by the nanoprecipitation method.</a> Drug Dev. Ind. Pharm. 25, 471-476 (1999).</li>
<li>Mundargi, R. C., Babu, V. R., Rangaswamy, V., Patel, P., Aminabhavi, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano%2Fmicro+technologies+for+delivering+macromolecular+therapeutics+using+poly%28d%2Cl-lactide-co-glycolide%29+and+its+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">Nano/micro technologies for delivering macromolecular therapeutics using poly(d,l-lactide-co-glycolide) and its derivatives.</a> J. Control. Rel. 125, 193-209 (2008).</li>
<li>Niwa, T., Takeuchi, H., Hino, T., Kunou, N., Kawashima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparations+of+biodegradable+nanospheres+of+water-soluble+and+insoluble+drugs+with+D%2CL-lactide%2Fglycolide+copolymer+by+a+novel+spontaneous+emulsification+solvent+diffusion+method%2C+and+the+drug+release+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">Preparations of biodegradable nanospheres of water-soluble and insoluble drugs with D,L-lactide/glycolide copolymer by a novel spontaneous emulsification solvent diffusion method, and the drug release behavior.</a> J. Control. Rel. 25, 89-98 (1993).</li>
<li>Yang, Y. Y., Chia, H. H., Chung, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+preparation+temperature+on+the+characteristics+and+release+profiles+of+PLGA+microspheres+containing+protein+fabricated+by+double-emulsion+solvent+extraction%2Fevaporation+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">Effect of preparation temperature on the characteristics and release profiles of PLGA microspheres containing protein fabricated by double-emulsion solvent extraction/evaporation method.</a> J. Control. Rel. 69, 81-96 (2000).</li>
<li>Yang, Y. Y., Chung, T. S., Ping Ng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology%2C+drug+distribution%2C+and+in+vitro+release+profiles+of+biodegradable+polymeric+microspheres+containing+protein+fabricated+by+double-emulsion+solvent+extraction%2Fevaporation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Morphology, drug distribution, and in vitro release profiles of biodegradable polymeric microspheres containing protein fabricated by double-emulsion solvent extraction/evaporation method.</a> Biomaterials. 22, 231-241 (2001).</li>
<li>Zhang, Z., Feng, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+drug+encapsulation+efficiency%2C+in+vitro+drug+release%2C+cellular+uptake+and+cytotoxicity+of+paclitaxel-loaded+poly%28lactide%29-tocopheryl+polyethylene+glycol+succinate+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The drug encapsulation efficiency, in vitro drug release, cellular uptake and cytotoxicity of paclitaxel-loaded poly(lactide)-tocopheryl polyethylene glycol succinate nanoparticles.</a> Biomaterials. 27, 4025-4033 (2006).</li>
<li>Astete, C. E., Sabliov, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+PLGA+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomater.+Sci.+Polym.+Ed%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles.</a> J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 17, 247-289 (2006).</li>
<li>Gaumet, M., Gurny, R., Delie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+biodegradable+PLGA+particles+with+narrow+size+distributions%3A+Preparation+by+means+of+selective+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Fluorescent biodegradable PLGA particles with narrow size distributions: Preparation by means of selective centrifugation.</a> Int. J. Pharm. 342, 222-230 (2007).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

PLGA-deeltjes worden meestal bereid door middel van een enkele- of dubbele-emulsie, een methode die de mogelijkheid biedt om de deeltjekenmerken zoals grootte, inkapseling en oppervlakte-eigenschappen aan te passen7. Deze eigenschappen en andere zijn afhankelijk van vele variabelen, waaronder het type oplosmiddel, voerverhoudingen, emulgeringsmethode en type emulgator. In onze ervaring is het echter mogelijk voor een enkele experimentator om deeltjes met consistente eigenschappen te produceren. Met behulp van hetzelfde protocol produceerde een goed getrainde experimentator zeven afzonderlijke batches van nanodeeltjes met de volgende gemiddelde diameters: 317 nm±99, 342 nm±112, 298 nm±104, 361 nm±110, 339 nm±115, 360 nm±123 en 364 nm±110. Het gemiddelde van de batches van de goed getrainde experimentator levert een gemiddelde diameter van 340 nm±25 op en een gemiddelde standaarddeviatie binnen de batch van 110 nm±8. Een tweede experimentator, getraind door de eerste, gebruikte hetzelfde protocol om nanodeeltjes te produceren met een gemiddelde diameter van 328 nm±138. Echter, een derde experimentator, die al enkele maanden zelfstandig nanodeeltjes maakte, volgde hetzelfde protocol om nanodeeltjes te produceren met een gemiddelde diameter van 220 nm±70. Het is dus mogelijk om deeltjes te maken met een verwacht bereik van diameters, maar dit hangt af van exacte replicatie van subtiele experimentele technieken. Het poolen van batches kan de productie van grote hoeveelheden nanodeeltjes met identieke aggregaat-eigenschappen mogelijk maken. Bijvoorbeeld, wanneer we nanodeeltjes oppervlaktemodificeren voor in vitro of in vivo onderzoek, worden meerdere (tot 6) batches van 200 mg bereid, gewassen, verzameld, gemengd in een enkele buis en vervolgens verdeeld voor oppervlaktemodificatie. Dit zorgt ervoor dat nanodeeltjesgrootte, geneesmiddelbelasting, lading en fractie van oppervlakteplaatsen beschikbaar voor modificatie vergelijkbaar zullen zijn tussen twee behandelingsgroepen. In een ander voorbeeld, als de variabele van belang de geneesmiddelwerkzaamheid is met verschillende middelen die in verschillende batches nanodeeltjes worden geladen, is het belangrijk om de variabiliteit in geneesmiddelbelasting te meten en te beheersen. Het is van cruciaal belang dat de deeltjekenmerken voor elke batch van deeltjes worden gemeten en experimenten worden ontworpen en gerepliceerd om de variatie tussen de batches te beheersen.
Complete emulgering van de organische en waterige fasen is cruciaal voor het vormen van kleine deeltjes. Poly(vinylalcohol) (PVA) is misschien wel de meest gebruikte emulgator. Wij en anderen hebben een verscheidenheid aan emulgerende en stabiliserende middelen gebruikt, waaronder vitamine E-TPGS9, PVA14, spans15 en poloxamers16 (zie beoordeling door Wischke et al.17 voor een grondige bespreking van het brede scala aan middelen die worden gebruikt voor de productie van PLGA-deeltjes). Een goed geëmulgeerd polymeer zal verschijnen als een homogene, melkachtige/opaque oplossing. Een slechte (of 'gebroken') emulsie zal macroscopische heterogeniteit of korreligheid vertonen en het kan zelfs scheiden in twee visueel verschillende lagen in de buis. Dit duidt over het algemeen op een mislukte vorming van nanodeeltjes. De emulsie kan breken na stap 1.9 als deze niet onmiddellijk wordt overgebracht naar de ultrasone apparatuur. Als dit gebeurt, moet opnieuw worden gevormd tot een homogene oplossing en onmiddellijk naar de sonicator worden overgebracht. Scheiding mag niet optreden na de sonicatiestap (1.10). Zodra de deeltjes zijn verspreid in een groter watervolume (stap 1.11), moet de oplossing uniform ondoorzichtig tot licht transparant zijn. De transparante kwaliteit neemt toe naarmate de deeltjesgrootte afneemt, en een blauwe tint kan worden waargenomen voor zeer kleine nanodeeltjes. Deze tint kan niet worden waargenomen als deeltjes een geneesmiddel inkapselen. Als de emulsie niet uniform in het grote watervolume verspreidt of er korrelig uitziet, mag het experiment niet doorgaan. Het is normaal om enige variatie in het uiterlijk van het deeltjespelletje waar te nemen, evenals in de cohesie ervan. Sommige pellets kunnen hersuspenderen bij mild voortreden, terwijl andere enkele minuten waterbad-sonicatie nodig kunnen hebben. Hersuspenderen mag niet langer dan 5 minuten duren. Lyofilisaatdeeltjes kunnen een verscheidenheid aan texturen hebben, van katoenachtig tot vrij vloeibaar.
Een van de vele voordelen van PLGA als nanodeeltje-materiaal is de mogelijkheid om het fabricageproces te optimaliseren om de gewenste deeltjesgrootte voor de beoogde toepassing te creëren. Grotere nanodeeltjes zullen een hoger fractie van hydrofoob geneesmiddel (in verhouding tot het gewicht van polymeer) inkapselen dan kleine nanodeeltjes, echter kan ook de geneesmiddelafgiftekinetiek worden beïnvloed18-20. De grootte van nanodeeltjes heeft een direct effect op de mechanismen van internering van deeltjes door cellen, evenals hun verdeling in weefsel, wat kan resulteren in dramatische verschillen in de effectiviteit van de afgifte. Bijvoorbeeld, het mononucleaire fagocytsysteem zal agentia in de systemische circulatie die groter zijn dan 1 µm markeren en verwijderen. Kleine nanodeeltjes kunnen interessant zijn voor directe infusie in de hersenen, waar grotere nanodeeltjes in de strakke extracellulaire matrix zouden worden opgesloten; afgifte van kleine nanodeeltjes zou ook passieve targeting van tumoren via het verbeterde permeatie- en retentie-effect kunnen vergemakkelijken. Geneesmiddelinkapsuleringsefficiëntie varieert sterk, afhankelijk van de eigenschappen van het specifieke geneesmiddel, de grootte van het deeltje en de emulgator (dwz zijn oplosbaarheid in water versus oplosmiddel). Enkele versus dubbele emulsie zal ook de geneesmiddelbelasting en nanodeeltjegrootte beïnvloeden. Inkapselen van hydrofobe agentia via een enkele emulsie kan helpen bij de productie van ultrakleine nanode

Polymeren zijn in de afgelopen decennia steeds populairder geworden als voertuigen voor medicijnafgifte voor toepassingen variërend van gerichte tumortherapie1 tot modulatie van het immuunsysteem2. Polymeer-geëncapsulateerde of geconjugeerde geneesmiddelen zijn vaak effectiever dan hun vrij afgegeven tegenhangers, omdat het polymeergebonden medicijn beschermd is tegen afbraak. Deze bescherming leidt tot een langere biologische halfwaardetijd en mogelijk verbeterde werkzaamheid met verminderde systemische bijwerkingen3-5.
Poly(melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) vertoont veel van de ideale eigenschappen van een nanoschalig afgiftesysteem, dat een langetermijnafgifte van het geëncapsulateerde middel biedt en afbreekt tot de biocompatibele producten van melkzuur en glycolzuur. Kleine moleculen, eiwitten en nucleïnezuren die in PLGA zijn geëncapsulateerd, hebben een verbeterde werkzaamheid aangetoond in een verscheidenheid van ziektetoepassingen8. Belangrijk is dat het materiaalplatform eenvoudige aanpassing van eigenschappen zoals grootte, lading en oppervlaktepresentatie van liganden mogelijk maakt voor het targeten van deeltjes naar specifiek weefsel of voor beeldvormingsdoeleinden. Omdat PLGA al in mensen wordt gebruikt in de vorm van biodegradeerbare hechtdraden (bijv. Purasorb, Purac Biomaterials en Vicryl, Ethicon Inc.), is de potentiële klinische toepasbaarheid groot.
Olie-water (enkelvoudige) of water-olie-water (dubbele) emulsie is een methode waarmee PLGA kan worden gebruikt om hydrofobe en hydrofiele geneesmiddelen in micro- of nanoschaal te binden. In het kort wordt PLGA opgelost in een organische fase (olie) die wordt geëmulgeerd met een oppervlakteactieve stof of stabilisator (water). Hydrofobe geneesmiddelen worden direct aan de oliefase toegevoegd, terwijl hydrofiele geneesmiddelen (water) eerst kunnen worden geëmulgeer met de polymeeroplossing voorafgaand aan de vorming van deeltjes. Burstoperende sonicatie vergemakkelijkt de vorming van kleine polymeerdruppeltjes. De resulterende emulsie wordt toegevoegd aan een grotere waterige fase en gedurende enkele uren geroerd, waardoor het oplosmiddel kan verdampen. Geharde nanodeeltjes worden verzameld en gewassen door middel van centrifugatie (Figuur 1).
Hier beschrijven we een techniek voor het maken van PLGA-nanodeeltjes met behulp van enkele en dubbele emulsies, met ethylacetaat (EtAc) als oplosmiddel en vitamine E-D-α-Tocoferol polyethyleenglycolsuccinaat (TPGS) als emulgerend middel. Het gebruik van vitamine E-TPGS biedt verschillende mogelijke voordelen ten opzichte van andere soorten stabilisatoren (bijv. poly(vinylalcohol), PVA), inclusief verbeterde emulgering en encapsulatie-efficiëntie. Andere groepen hebben voordelen van Vitamine E-TPGS gemeld, waaronder de remming van P-gp, een transmembraan effluxeiwit, dat vaak overexpressie vertoont op kankercellen en bekend is om zijn bijdrage aan geneesmiddelresistentie door geneesmiddelen uit doelcellen te verplaatsen. Daarnaast demonstreren we hoe de deeltjes te karakteriseren en te meten met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM) en geven we verdere begeleiding over groottemodificatie via wijziging van het protocol.

<table><tbody><tr><td>Poly(melkzuur-co-glycolzuur)&amp;nbsp; (PLGA)</td><td><a href="http://www.absorbables.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lactel</a></td><td>B6010-2P</td><td>Inherent viscositeit: 0.55-0.75 dl/g</td></tr><tr><td>Ethylacetaat (EtAc)</td><td>Sigma</td><td>270989</td><td></td></tr><tr><td>Methyleenchloride (DCM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitamine E TPGS</td><td>Sigma</td><td>57668</td><td></td></tr><tr><td>Poly(vinylalcohol)</td><td></td><td></td><td>87-89% gehydrolyseerd, 30,000-70,000 Da</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>Model 705</td><td>700 W (Ultrasonicator)</td></tr><tr><td>Sonicator tip</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>1/8 in</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Multipositieroerder</td><td>Corning</td><td>MP5I</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>Vaste hoekrotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>50.2TI</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS30</td><td></td></tr><tr><td>Lyofilisator</td><td>Millrock</td><td>BT85</td><td></td></tr></tbody></table>

plga-nanodeeltjes gevormd door enkelvoudige- of dubbele-emulsie met vitamine e-tpgs

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) is een biocompatibel lid van de aliphatische polyesterfamilie van biologisch afbreekbare polymeren. PLGA is al lang een populaire keuze voor toepassingen in medicijnafgifte, vooral omdat het al door de FDA is goedgekeurd voor gebruik bij mensen in de vorm van resorbeerbare hechtingen. Hydrofobe en hydrofiele geneesmiddelen worden ingekapseld in PLGA-deeltjes via een enkele- of dubbele emulsie. Kort gezegd, wordt het medicijn opgelost met polymeer of geëmulsifieerd met polymeer in een organische fase die vervolgens wordt geëmulsifieerd met de waterige fase. Nadat het oplosmiddel is verdampt, worden de deeltjes gewassen en verzameld via centrifugatie voor lyofilisatie en langdurige opslag. PLGA breekt langzaam af via hydrolyse in waterige omgevingen, en de ingekapselde middelen worden vrijgegeven over een periode van weken tot maanden. Hoewel PLGA een materiaal is dat veel voordelen biedt voor medicijnafgifte, kan de reproduceerbare vorming van nanodeeltjes een uitdaging zijn; er wordt aanzienlijke variabiliteit geïntroduceerd door het gebruik van verschillende apparatuur, reagentia-batch en precieze methode van emulgering. Hier beschrijven we in detail de vorming en karakterisering van microdeeltjes en nanodeeltjes gevormd door een enkele- of dubbele emulsie met behulp van het emulgerende middel vitamine E-TPGS. Deeltjesmorfologie en -grootte worden bepaald met behulp van rasterelektronenmicroscopie (SEM). We bieden representatieve SEM-beelden voor nanodeeltjes geproduceerd met variërende emulgatorconcentraties, evenals voorbeelden van beeldartefacten en mislukte emulgeringen. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik van alternatieve emulgatoren (bijv. poly(vinylalcohol), PVA) of oplosmiddelen (bijv. dichlooromethaan, DCM).

Representatieve SEM-beelden van PLGA-micropartikels en nanodeeltjes die met dit protocol zijn geprepareerd, worden getoond in Figuren 2a en 2b. Partikels zullen verschijnen als individuele, niet-gefuseerde sferen, met een gladde oppervlaktemorfologie en een breed scala aan maten die over het monster zijn verdeeld.
Om de gemiddelde diameter van elke batch te bepalen, worden metingen direct uit de SEM-beelden gedaan met de "measure"-functie in ImageJ. Er moeten minimaal 150 metingen van de diameter van willekeurig uit het gezichtsveld geselecteerde deeltjes worden verricht om een representatieve grootteverdeling te verkrijgen. De gemiddelde grootte van een batch deeltjes is afhankelijk van de formulatieparameters. In Figuur 2a zijn bijvoorbeeld microdeeltjes (gemiddelde diameter van 730 nm±370) gevormd met 1 ml oplosmiddel per 100 mg PLGA, waarbij 0,05% Vitamin E-TPGS in de emulgeerfase is gebruikt, terwijl in Figuur 2b nanodeeltjes (gemiddelde diameter van 340 nm±70) zijn gevormd met 4 ml oplosmiddel per 200 mg PLGA, waarbij het hydrofobe geneesmiddel camptothecine is ingekapseld en 0,3% Vitamin E-TPGS in de emulgeerfase is gebruikt (de volledige formulatieparameters worden beschreven in het bijschrift van de figuur). Over het algemeen zal een hogere concentratie emulgator kleinere deeltjes produceren, waarbij gemiddelde diameters tussen 220-2.000 nm haalbaar zijn door de emulgatorconcentratie te variëren van 0,3-0,01% (Figuur 3).
Onze opbrengsten variëren van 74-98% (22 batches nanodeeltjes met verschillende oplosmiddelen, emulgatoren en emulsificatiecondities, geprepareerd door één experimentator). Hogere opbrengsten kunnen worden waargenomen voor grotere (&gt;150 nm) batches, aangezien kleine nanodeeltjes gemakkelijk verloren gaan tijdens de centrifugatie- en wasstap, vooral wanneer het supernatant van de wasstap van het pellet wordt afgegoten. Voorzichtig pipetteren van de vloeistof kan helpen dit probleem te vermijden. Hogere snelheden en/of langere centrifugatie kunnen de opbrengst ook verbeteren, zowel door de collectie van de ultrafijne fractie nanodeeltjes te optimaliseren als door het pellet compacter te maken, zodat er minder verloren gaat in de wasstap. Het hier beschreven protocol is gericht op het produceren van deeltjes met TPGS als emulgator en EtAc als oplosmiddel, hoewel alternatieve oplosmiddelen en/of emulgatoren mogelijk zijn. In het algemeen stellen we vast dat EtAc kleinere en uniformer gevormde nanodeeltjes produceert dan DCM (bijv. diameters van 540 nm±190 versus 2.160 nm±1.530 voor EtAc versus DCM, 100 mg/ml PLGA in oplosmiddel, geëmulgeerd in 2 ml 0,1% TPGS), vermoedelijk omdat EtAc mengbaar is met water, terwijl DCM dat niet is. PVA is een veelgebruikte emulgator die uitgebreid is toegepast door ons en andere groepen. We hebben variabiliteit waargenomen in nanodeeltjes geprepareerd uit verschillende batches commercieel beschikbare PVA. Het is daarom raadzaam om, indien mogelijk, dezelfde voorraad PVA te gebruiken om de reproduceerbaarheid te verbeteren. In onze ervaring blijkt dat PVA een effectievere emulgator is bij veel hogere concentraties dan TPGS (bijv. diameter van 140 nm±48, 100 mg/ml PLGA in DCM, geëmulgeerd in 2 ml 5% PVA).
Het karakteriseren van nanodeeltjes met SEM kan uitdagend zijn vanwege verschillen in apparatuur en het beeldvormingsproces. Het is daarom belangrijk om morfologische kenmerken die duiden op problemen bij de vorming van deeltjes te onderscheiden van artefacten die onbedoeld tijdens de beeldvorming worden geïntroduceerd. Versmelting (Figuur 4a en 4b), putvorming (Figuur 4c) of barsten (Figuur 4f) van deeltjes worden soms waargenomen in de SEM-beelden. Deze artefacten kunnen soms wijzen op slecht gevormde deeltjes (bijv. in Figuur 4a was de emulgatorconcentratie te hoog om discrete deeltjes te vormen), maar kunnen ook het resultaat zijn van artefacten die door de karakteriseringsmethode zijn geïntroduceerd (bijv. in Figuur 4b is het monster verhit tijdens het sputter-coaten, en in Figuur 4c heeft lokale verhitting door de SEM-bundel de oppervlaktemorfologie van de deeltjes tijdens de beeldvorming veranderd). Om beeldvormingsartefacten te voorkomen, moet de sputter-coattijd worden geminimaliseerd en het bundelvermogen laag worden gehouden. Bij langere sputtertijden worden gladdere morfologieën waargenomen, maar dit kan leiden tot versmelting van deeltjes. Sputtertijden die te kort zijn, kunnen de beeldvorming bemoeilijken, omdat deeltjes elektrisch geladen raken en bewegen tijdens het vastleggen van het beeld. Het snel maken van opnamen helpt om langdurige blootstelling aan de bundel en vervorming van beelden te voorkomen (Figuur 4d en 4e). Hoge blootstelling aan de bundel kan ook leiden tot uitzetting en barsten van het oppervlak van de nanodeeltjes (Figuur 4f). Als morfologische artefacten niet kunnen worden geminimaliseerd door de karakteriseringsparameters aan te passen, is het mogelijk dat ze wijzen op werkelijke problemen met de nanodeeltjes zelf. Tijdens het fabricageproces kan versmelting het gevolg zijn van oververhitting door een hoog ultrasonisatievermogen, onvolledige verdamping van het oplosmiddel, onvolledige resuspensie tijdens de wasfase of mislukte lyofilisatie.
<img alt="Schematische weergave van het olie-water-scheidingsproces; sonicatie, verdamping, opvang; lyofilisatiediagram." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1. Schema van de fabricage van nanodeeltjes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om de afbeelding in een groter formaat te bekijken</a>.
<img alt="Nanodeeltjesstructuur (SEM) en grootteverdeling (μm, nm), vergelijkende analysegrafiek." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 2"> 
Figuur 2. SEM-beelden en overeenkomstige grootteverdelingen van PLGA-microdeeltjes en nanodeeltjes geproduceerd via de enkelvoudige emulsie-methode. In (A) werden deeltjes gevormd door 100 mg PLGA opgelost in 1ml ethylacetaat te emulgeren in 2 ml 0,05% Vitamin E-TPGS, en uitharden in 45 ml 0,01% Vitamin E-TPGS. De overeenkomstige grootteverdeling wordt getoond in (C). In (B) werden deeltjes gevormd door 200 mg PLGA en 40mg camptothecine opgelost in 4mL ethylacetaat te emulgeren in 4 ml 0,3% Vitamin E-TPGS, en uitharden in 90 ml 0,3% Vitamin E-TPGS. De overeenkomstige grootteverdeling wordt getoond in (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a>.
<img alt="Deeltjesgrootteanalyse; staafdiagram en SEM-beelden tonen het effect van TPGS % op de grootte van de microsferen." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 3"> 
Figuur 3. Deeltjesgrootte is afhankelijk van de emulgatorconcentratie. Een toenemende concentratie Vitamine E-TPGS resulteerde in kleinere nanodeeltjes. Gemiddelde diameters en bijbehorende SEM-beelden worden getoond van deeltjes die zijn geprepareerd door 100 mg PLGA opgelost in 1 ml ethylacetaat te emulgeren in (A) 0,01%, (B) 0,05%, (C) 0,1%, of (D) 0,3% Vitamine E-TPGS en gestold in 45 ml 0,3% Vitamine E-TPGS. Foutenbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van 200 diameter-metingen uitgevoerd op 2 beelden van één batch. De schaalbalk vertegenwoordigt 5 μm (A-C) en 200 nm (D).<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a>.
<img alt="SEM-micrografie die de partikelmorfologie en aggregatie weergeeft. Analyse van de microstructuur van het poeder." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 4"> 
Figuur 4. Artefacten van de oppervlaktemorfologie waargenomen met SEM. In (A) was er sprake van sterke versmelting en bladachtige structuren in het gehele monster. De concentratie Vitamine E-TPGS was te hoog (1%) om discrete partikels te vormen. In (B) waren sommige regio's van het monster versmolten, maar er waren grote pockets van discrete nanodeeltjes aanwezig, met name waar openingen in de sputtercoat zaten. Wij vermoeden dat deze versmeltingsartefacten het gevolg zijn van verhitting tijdens het sputtercoatproces. In (C) leken de partikels aanvankelijk glad, maar aanhoudende blootstelling van het monster aan de SEM-bundel leidde tot putjes en rimpeling. (D) toont een afbeelding met een lage resolutie die is vastgelegd met minimale blootstelling van het monster aan de SEM-bundel; de partikels lijken glad met een ronde morfologie. In (E) is hetzelfde monster gedurende een langere periode blootgesteld, waarbij een duidelijke vervorming van de oorspronkelijke morfologie wordt waargenomen. In (F) zorgde een lange blootstelling aan de bundel bij een hoge spanningsinstelling (12 kV) voor verhitting en barsten van de partikels. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om de afbeelding in een groter formaat te bekijken</a>.

We beschrijven de productie en karakterisering van nanodeeltjes en microdeeltjes samengesteld uit poly(melkzuur-co-glycolzuur) met behulp van vitamine E-TPGS als emulgator. Door formuleringsparameters zoals de concentratie van emulgator te variëren, is het mogelijk om nanodeeltjes te produceren met gemiddelde diameters variërend van 220 nm tot 1,98 µm.

PLGA-nanodeeltjes gevormd door enkelvoudige- of dubbele-emulsie met vitamine E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Het algemene doel van deze procedure is het vormen van polymere nanodeeltjes met een instelbare grootte. Dit wordt bereikt door eerst het polymeer op te lossen in een organisch oplosmiddel en een geneesmiddel of fluorescerende encapsulant toe te voegen. De tweede stap bestaat uit het emulgeren van het polymeer met een waterfase die het emulgator bevat, waarna de deeltjes uitharden in een groter waterig volume naarmate het oplosmiddel verdampt.Vervolgens worden de deeltjes gewassen, verzameld door middel van centrifugatie en gevriesdroogd voor langdurige bewaring. De laatste stap is het karakteriseren van de grootte en oppervlaktemorfologie van de nanodeeltjes met behulp van scanning elektronenmicroscopie of SEM-beeldvorming. Uiteindelijk wordt SEM gebruikt om aan te tonen dat de grootte van de nanodeeltjes kan worden gecontroleerd door de concentratie van het emulgator te variëren.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van diverse menselijke ziekten, omdat deeltjes kunnen worden aangepast om een breed scala aan therapeutische middelen in te kapselen en af te leveren voor een langdurige werking in het doelweefsel. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel.De emulsificatiestappen zijn moeilijk aan te leren omdat subtiele aspecten van de manier waarop de emulsie wordt gevormd, een aanzienlijke impact kunnen hebben op de eigenschappen van de resulterende deeltjes. Om te beginnen met de preparatie van de nanodeeltjes, plaatst u ongeveer 100 mg polylactide-co-glycolide, ook bekend als PLGA, in een reageerbuis van 13 bij 100 mm. Breng vervolgens met een glazen serologische pipette 1 ml ethylacetaat over naar het monster, dek de bovenkant van de buis af met aluminiumfolie en zet de folie vervolgens stevig vast met Parafilm.Zorg ervoor dat de parafilm strak over de bovenrand van het vial en de onderrand van de folie is gewikkeld om verdamping van het oplosmiddel te voorkomen. Markeer het niveau van het oplosmiddel op de reageerbuis en laat het polymeer gedurende de nacht oplossen. Voeg de volgende dag extra oplosmiddel toe als er verdamping heeft plaatsgevonden.Bereid de volgende apparatuur en materialen voor in een zuurkast in de buurt van het ultrasone apparaat. Een vortexmixer, twee kleine glazen Pasteurpipetten met rubberen balletjes en een magnetische roerplaat. Plaats daarnaast een groot bekerglas gevuld met ijswater op een statief onder het ultrasone apparaat.Voeg vervolgens 45 milliliters van 0.3% gewicht per volume vitamine E-T-P-G-S toe aan een glazen bekerglas van 200 milliliter en stel daarna de roersnelheid in op 360 RPM. Voeg vervolgens twee milliliters van de 0.3% gewicht per volume vitamine E-T-P-G-S toe aan een glazen reageerbuis van 13 bij 100 millimeter. Om hydrofobe stoffen te mengen, voegt u het encapsulant direct toe aan de polymeeroplossing, waarbij u er zorgvuldig op let dat de wanden van de reageerbuis niet worden geraakt, en vortex de buis totdat het encapsulant homogeen is verspreid.Emulgeer voor hydrofiele middelen het inkapselingsmiddel met de polymeeroplossing. Voeg tot 50 µL van het geneesmiddel in buffer toe aan het oppervlak van de polymeeroplossing. Behandel het mengsel ultrasoon op ijs gedurende ongeveer 10 seconden of totdat de oplossing opaak en homogeen is.Vortex vervolgens de reageerbuis met vitamin E-T-P-G-S op een hoge stand terwijl u de buis verticaal vasthoudt. Houd de glazen posture-pipet één tot twee centimeter boven de opening van de vortexbuis en voeg de polymeeroplossing langzaam druppelsgewijs toe aan het oppervlak van de vortexende vloeistof. Let erop dat de pipet de wanden van de buis niet raakt nadat de volledige polymeeroplossing is toegevoegd.Blijf de oplossing vortexen. Nu een emulsie gedurende 15 seconden. Breng de geëmulgeerde polymeer onmiddellijk over naar de ultrasonicator.Houd de reageerbuis ondergedompeld in ijswater en soniceer de emulsie in drie bursts van tien seconden. Beweeg de emulsie langs de probe om een gelijkmatige sonicatie te garanderen en voorkom dat de probe de wanden of de bodem van de reageerbuis raakt. Pauzeer vijf tot 10 seconden tussen elke sonicatie van tien seconden om de oplossing af te laten koelen voordat u verdergaat.Voeg vervolgens één tot twee milliliter 0,3% vitamin E-T-P-G-S van de roeroplossing toe aan de emulsie. Dit verdunt het geëmulgeerde polymeer, waardoor het gemakkelijker kan worden gegoten; giet de emulsie in de roeroplossing. Spoel alle resterende oplossing uit de reageerbuis in de roeroplossing.Laat de nanodeeltjes uitharden door ze drie uur te roeren. Als het inkapselingsmiddel lichtgevoelig is, wikkel het bekerglas dan in aluminiumfolie en laat de bovenkant open om de verdamping van het oplosmiddel te vergemakkelijken. Om de nanodeeltjes te verzamelen, begint u met het verdelen van de nanodeeltjes over twee Oak Ridge centrifugebuizen met een nominaal volume van 30 milliliter en balanceert u deze binnen 0,1 gram van elkaar. Centrifugeer de nanodeeltjes vervolgens in een vaste-hoekrotor gedurende 15 minuten bij 17.000.RC f. Langere centrifugatietijden leiden tot het verzamelen van een hoger fractie van kleinere nanodeeltjes. Verwijder het supernatant, waarbij u er zorg voor draagt dat het pellet met nanodeeltjes niet wordt verstoord.Voeg vijf milliliters gedestilleerd water toe en gebruik een waterbad, sonicator en vortex om de nanodeeltjes volledig te suspenderen. Combineer de inhoud van de twee centrifugebuisjes in één buisje en voeg 20 milliliters gedestilleerd water toe voor een totaalvolume van 30 milliliters. Herhaal vervolgens de centrifugatie- en wasstappen nog twee keer, voor een totaal van drie wasbeurten.Het vloeistofvolume van de laatste pellet Resus-suspensie moet vier tot vijf milliliters zijn. Vries een kleine aliquot van telos-vrije nanodeeltjes voor SEM-beeldvorming apart van de rest. Voeg een gewichtsverhouding van één tot twee TLO ten opzichte van polymeer toe als cryoprotectant voor een uniforme en volledige resus-suspensie van PLGA-nanodeeltjes.Dit voorkomt de vorming van ijskristallen, die het oppervlak van de deeltjes kunnen beschadigen en aggregatie kunnen induceren. Draag de nanodeeltjes over naar een vooraf gewogen centrifugebuis van vijf milliliter en vries deze vervolgens gedurende ten minste 30 minuten in bij -80 °C. Open daarna de buis en bedek de bovenkant door een stuk laboratoriumpapier met een elastiekje te bevestigen.Werk snel om te voorkomen dat de inhoud smelt, mocht er smelting optreden. Vries het monster opnieuw in voordat het in de lyofilisator wordt geplaatst en lyofiliseer het monster van 5 mL gedurende 72 uur. Plaats vervolgens de dop terug, wikkel de buis in en bewaar de gelyofiliseerde deeltjes bij -80 °C.Plaats op de dag van de beeldvorming een strip dubbelzijdige koolstoftape op een SEM-stub. Label het metalen gedeelte van de stub met een permanente marker voor latere referentie. Gebruik een metalen spatel om een kleine hoeveelheid gelyofiliseerde nanodeeltjes te verzamelen en verspreid deze voorzichtig over het oppervlak van de tape.Borstel het oppervlak van de stub af met laboratoriumtissue of gebruik perslucht om losse nanodeeltjes te verwijderen. Visualiseer de deeltjes met een werkafstand van 5 tot 15 millimeter van de bundel, een versnellingsspanning van 5 tot 12 kilovolt en een spotgrootte van 1 tot 3; hogere bundelsterktes kunnen leiden tot regionale opwarming van het monster, wat de oppervlaktemorfologie van de deeltjes zal veranderen. Microdeeltjes worden geobserveerd bij een vergroting van 100 keer en nanodeeltjes zijn herkenbaar bij 3000 keer.Focus de vergroting op de bovenkant van een bol om deeltjes te lokaliseren die gemakkelijk met SEM gevisualiseerd kunnen worden; verzamel ten minste drie afbeeldingen per batch om een representatieve steekproef van de deeltjesgrootte en morfologie te verkrijgen. Met deze methode kunnen deeltjes worden gecreëerd door een enkele emulsie die verschijnen als individuele, niet-gefuseerde bollen met een gladde oppervlaktemorfologie en een breed scala aan groottes die over het monster zijn verdeeld. De microdeeltjes die hier worden getoond, hebben een gemiddelde diameter van 730 nanometers.Hier worden nanodeeltjes getoond die zijn gecreëerd door een enkele emulsie en die het hydrofobe geneesmiddel campine inkapselen. Deze deeltjes bleken nog kleiner te zijn, met een gemiddelde diameter van 340 nanometer. Hogere concentraties emulsiemiddel resulteerden in kleinere deeltjes, waarbij de gemiddelde diameters afnamen van 2000 naar 200 nanometer.Naarmate de concentratie van de emulgator toenam van 0,01 naar 0,3%, zoals te zien is op de SEM-opnamen hier. Wanneer de concentratie van vitamine E-T-P-G-S echter te hoog was, vormden zich geen discrete deeltjes; bij gebruik van 1% vitamine E-T-P-G-S werden zware versmeltingen en plaatvormige structuren in de gehele structuur aangetroffen. Correct. Zodra u heeft geleerd hoe u PLG-nanodeeltjes door emulsificatie kunt vervaardigen, kunnen andere methoden, zoals oppervlaktemodificatie, worden toegepast om nanodeeltjes te ontwikkelen voor interactie met specifieke celtypen of regio's in het lichaam.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u deeltjes met een reproduceerbare en instelbare grootte kunt vormen door middel van emulsificatie.

plga-nanoparticles-formed-single-or-double-emulsion-with-vitamin-e

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

PLGA-nanodeeltjes gevormd door enkel- of dubbele emulsie met vitamine E-TPGS

Insonation van microbellen is een veelbelovende strategie voor tumor ablatie op kortere gemiddelde akoestische bevoegdheden, alsmede voor de gerichte toediening van geneesmiddelen. Het doel van deze studie is het ontwikkelen van low duty cycle echografie pulserende strategieën en nanocarriers aan niet-thermische microvasculair ablatie en laadvermogen levering aan subcutane C6 glioma te maximaliseren.

Contrast Echografie doelgerichte behandeling van gliomen in Muizen via Drug-Bearing Nanodeeltje Levering en microvasculaire Ablation

Dit artikel beschrijft een methode om nanoprecipitation op basis van polymeren nanodeeltjes door middel van diblok co-polymeren te synthetiseren. Bespreken we de synthese van diblok co-polymeren, de nanoprecipitation techniek en mogelijke toepassingen.

Formulering van diblok polymere nanodeeltjes door middel van Nanoprecipitation Techniek

Source: Zhu, J., et. al., Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the stepwise assembly of NGF-loaded HDL-mimicking nanoparticles using protamine-assisted encapsulation and lipid-based self-assembly for potential neurotrophic delivery applications.

Encapsulating Nerve Growth Factor in High-Density Lipoprotein-Mimicking Nanoparticles

Het doel van dit protocol is om de bereiding en karakterisering van fysiek opgesloten, slecht oplosbare geneesmiddelen in micellaire geneesmiddelafgiftesystemen, samengesteld uit amfifiele blokcopolymeren, te beschrijven.

Bereiding en karakterisering van de individuele en multi-geneesmiddel beladen Fysiek Ingesloten Polymeer Micellen

Hier presenteren we een protocol voor de synthese van placenta chondroitin sulfaat A bindend peptide (plCSA-BP)-geconjugeerd lipide-polymeer nanodeeltjes via -voor-stapmodus ultrasoonapparaat en bioconjugate technieken. Deze deeltjes een roman hulpmiddel vormen voor de gerichte levering van therapeutics aan de meeste menselijke tumoren en placenta trophoblasts voor de behandeling van kanker en placenta aandoeningen.

Synthese en karakterisering van placenta Chondroitin sulfaat een (plCSA) - Targeting lipide - polymeer nanodeeltjes

Flash NanoPrecipitation (FNP) is een schaalbare benadering voor de productie van polymere core-shell nanodeeltjes. Lab-schaal formuleringen voor de inkapseling van hydrofobe of hydrofiele therapeutics worden beschreven.

NanoPrecipitation Flash voor de inkapseling van hydrofobe en hydrofiele stoffen in polymere nanodeeltjes

Dit artikel beschrijft de inkapseling van falcarindiol in lipide-gecoate 74 nm nanodeeltjes. De mobiele opname van de nanodeeltjes door menselijke stamcellen in lipide druppels wordt gecontroleerd door fluorescerende en confocal beeldvorming. Nanodeeltjes worden vervaardigd door de snelle injectie methode van oplosmiddel verschuiven, en hun grootte wordt gemeten met de Dynamische lichtverstrooiing techniek.

Opname van nieuwe lipide-gecoate nanodeeltjes met Falcarindiol door menselijke mesenchymale stamcellen

Deze studie beschrijft klassieke hydratatie met behulp van de dunne lipide-film methode voor de bereiding van nanoliposome gevolgd door nanodeeltjes karakterisatie. Een 47 kDa-hydrofiele en bolvormige proteïne, Tarin, is met succes ingekapseld als een strategie om de stabiliteit te verbeteren, snelle klaring te voorkomen en gecontroleerde afgifte te bevorderen. De methode kan worden aangepast aan hydrofobe moleculen inkaping.

Voorbereiding en karakterisering van Nanoliposomes voor de Entrapment van bioactieve hydrofiele bolvormige eiwitten

Lipide nanodeeltjes worden ontwikkeld met behulp van een microfluïdische mengplatformbenadering voor mRNA- en DNA-inkapseling.

Het formuleren en karakteriseren van lipide nanodeeltjes voor genafgifte met behulp van een microfluïdisch mengplatform

Dit protocol beschrijft de synthese en formulering van injecteerbare, supramoleculaire polymeer-nanodeeltjes (PNP) hydrogel biomaterialen. Toepassingen van deze materialen voor medicijnafgifte, biofarmaceutische stabilisatie en celencapsulatie en -levering worden gedemonstreerd.

Injecteerbare supramoleculaire polymeer-nanodeeltjes hydrogels voor cel- en medicijnafgiftetoepassingen

Om efficiënt adjuvantia rationeel te ontwerpen, ontwikkelden we poly-melkzuur-co-glycolzuur nanodeeltjes-gestabiliseerde Pickering-emulsie (PNPE). De PNPE bezat unieke zachtheid en een hydrofobe interface voor krachtig cellulair contact en bood antigeenbelasting met een hoog gehalte, waardoor de cellulaire affiniteit van het afgiftesysteem voor antigeen-presenterende cellen werd verbeterd en efficiënte internalisatie van antigenen werd geïnduceerd.

Cellulaire affiniteit van deeltjesgestabiliseerde emulsie om antigeenintern internalisatie te stimuleren

Leer PLGA-nanodeeltjes produceren met regelbare grootte door enkelvoudige- of dubbele-emulsie met vitamine E-TPGS als emulgator. Deze methode optimaliseert aangepaste geneesmiddelafgifte voor therapeutische toepassingen.

PLGA-nanodeeltjes gevormd door enkelvoudige- of dubbele-emulsie met vitamine E-TPGS

Meer video's verkennen