PLGA-nanodeeltjes gevormd door enkelvoudige- of dubbele-emulsie met vitamine E-TPGS

Het algemene doel van deze procedure is het vormen van polymere nanodeeltjes met een instelbare grootte. Dit wordt bereikt door eerst het polymeer op te lossen in een organisch oplosmiddel en een geneesmiddel of fluorescerende encapsulant toe te voegen. De tweede stap bestaat uit het emulgeren van het polymeer met een waterfase die het emulgator bevat, waarna de deeltjes uitharden in een groter waterig volume naarmate het oplosmiddel verdampt.

Vervolgens worden de deeltjes gewassen, verzameld door middel van centrifugatie en gevriesdroogd voor langdurige bewaring. De laatste stap is het karakteriseren van de grootte en oppervlaktemorfologie van de nanodeeltjes met behulp van scanning elektronenmicroscopie of SEM-beeldvorming. Uiteindelijk wordt SEM gebruikt om aan te tonen dat de grootte van de nanodeeltjes kan worden gecontroleerd door de concentratie van het emulgator te variëren.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van diverse menselijke ziekten, omdat deeltjes kunnen worden aangepast om een breed scala aan therapeutische middelen in te kapselen en af te leveren voor een langdurige werking in het doelweefsel. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel.

De emulsificatiestappen zijn moeilijk aan te leren omdat subtiele aspecten van de manier waarop de emulsie wordt gevormd, een aanzienlijke impact kunnen hebben op de eigenschappen van de resulterende deeltjes. Om te beginnen met de preparatie van de nanodeeltjes, plaatst u ongeveer 100 mg polylactide-co-glycolide, ook bekend als PLGA, in een reageerbuis van 13 bij 100 mm. Breng vervolgens met een glazen serologische pipette 1 ml ethylacetaat over naar het monster, dek de bovenkant van de buis af met aluminiumfolie en zet de folie vervolgens stevig vast met Parafilm.

Zorg ervoor dat de parafilm strak over de bovenrand van het vial en de onderrand van de folie is gewikkeld om verdamping van het oplosmiddel te voorkomen. Markeer het niveau van het oplosmiddel op de reageerbuis en laat het polymeer gedurende de nacht oplossen. Voeg de volgende dag extra oplosmiddel toe als er verdamping heeft plaatsgevonden.

Bereid de volgende apparatuur en materialen voor in een zuurkast in de buurt van het ultrasone apparaat. Een vortexmixer, twee kleine glazen Pasteurpipetten met rubberen balletjes en een magnetische roerplaat. Plaats daarnaast een groot bekerglas gevuld met ijswater op een statief onder het ultrasone apparaat.

Voeg vervolgens 45 milliliters van 0.3% gewicht per volume vitamine E-T-P-G-S toe aan een glazen bekerglas van 200 milliliter en stel daarna de roersnelheid in op 360 RPM. Voeg vervolgens twee milliliters van de 0.3% gewicht per volume vitamine E-T-P-G-S toe aan een glazen reageerbuis van 13 bij 100 millimeter. Om hydrofobe stoffen te mengen, voegt u het encapsulant direct toe aan de polymeeroplossing, waarbij u er zorgvuldig op let dat de wanden van de reageerbuis niet worden geraakt, en vortex de buis totdat het encapsulant homogeen is verspreid.

Emulgeer voor hydrofiele middelen het inkapselingsmiddel met de polymeeroplossing. Voeg tot 50 µL van het geneesmiddel in buffer toe aan het oppervlak van de polymeeroplossing. Behandel het mengsel ultrasoon op ijs gedurende ongeveer 10 seconden of totdat de oplossing opaak en homogeen is.

Vortex vervolgens de reageerbuis met vitamin E-T-P-G-S op een hoge stand terwijl u de buis verticaal vasthoudt. Houd de glazen posture-pipet één tot twee centimeter boven de opening van de vortexbuis en voeg de polymeeroplossing langzaam druppelsgewijs toe aan het oppervlak van de vortexende vloeistof. Let erop dat de pipet de wanden van de buis niet raakt nadat de volledige polymeeroplossing is toegevoegd.

Blijf de oplossing vortexen. Nu een emulsie gedurende 15 seconden. Breng de geëmulgeerde polymeer onmiddellijk over naar de ultrasonicator.

Houd de reageerbuis ondergedompeld in ijswater en soniceer de emulsie in drie bursts van tien seconden. Beweeg de emulsie langs de probe om een gelijkmatige sonicatie te garanderen en voorkom dat de probe de wanden of de bodem van de reageerbuis raakt. Pauzeer vijf tot 10 seconden tussen elke sonicatie van tien seconden om de oplossing af te laten koelen voordat u verdergaat.

Voeg vervolgens één tot twee milliliter 0,3% vitamin E-T-P-G-S van de roeroplossing toe aan de emulsie. Dit verdunt het geëmulgeerde polymeer, waardoor het gemakkelijker kan worden gegoten; giet de emulsie in de roeroplossing. Spoel alle resterende oplossing uit de reageerbuis in de roeroplossing.

Laat de nanodeeltjes uitharden door ze drie uur te roeren. Als het inkapselingsmiddel lichtgevoelig is, wikkel het bekerglas dan in aluminiumfolie en laat de bovenkant open om de verdamping van het oplosmiddel te vergemakkelijken. Om de nanodeeltjes te verzamelen, begint u met het verdelen van de nanodeeltjes over twee Oak Ridge centrifugebuizen met een nominaal volume van 30 milliliter en balanceert u deze binnen 0,1 gram van elkaar. Centrifugeer de nanodeeltjes vervolgens in een vaste-hoekrotor gedurende 15 minuten bij 17.000.

RC f. Langere centrifugatietijden leiden tot het verzamelen van een hoger fractie van kleinere nanodeeltjes. Verwijder het supernatant, waarbij u er zorg voor draagt dat het pellet met nanodeeltjes niet wordt verstoord.

Voeg vijf milliliters gedestilleerd water toe en gebruik een waterbad, sonicator en vortex om de nanodeeltjes volledig te suspenderen. Combineer de inhoud van de twee centrifugebuisjes in één buisje en voeg 20 milliliters gedestilleerd water toe voor een totaalvolume van 30 milliliters. Herhaal vervolgens de centrifugatie- en wasstappen nog twee keer, voor een totaal van drie wasbeurten.

Het vloeistofvolume van de laatste pellet Resus-suspensie moet vier tot vijf milliliters zijn. Vries een kleine aliquot van telos-vrije nanodeeltjes voor SEM-beeldvorming apart van de rest. Voeg een gewichtsverhouding van één tot twee TLO ten opzichte van polymeer toe als cryoprotectant voor een uniforme en volledige resus-suspensie van PLGA-nanodeeltjes.

Dit voorkomt de vorming van ijskristallen, die het oppervlak van de deeltjes kunnen beschadigen en aggregatie kunnen induceren. Draag de nanodeeltjes over naar een vooraf gewogen centrifugebuis van vijf milliliter en vries deze vervolgens gedurende ten minste 30 minuten in bij -80 °C. Open daarna de buis en bedek de bovenkant door een stuk laboratoriumpapier met een elastiekje te bevestigen.

Werk snel om te voorkomen dat de inhoud smelt, mocht er smelting optreden. Vries het monster opnieuw in voordat het in de lyofilisator wordt geplaatst en lyofiliseer het monster van 5 mL gedurende 72 uur. Plaats vervolgens de dop terug, wikkel de buis in en bewaar de gelyofiliseerde deeltjes bij -80 °C.

Plaats op de dag van de beeldvorming een strip dubbelzijdige koolstoftape op een SEM-stub. Label het metalen gedeelte van de stub met een permanente marker voor latere referentie. Gebruik een metalen spatel om een kleine hoeveelheid gelyofiliseerde nanodeeltjes te verzamelen en verspreid deze voorzichtig over het oppervlak van de tape.

Borstel het oppervlak van de stub af met laboratoriumtissue of gebruik perslucht om losse nanodeeltjes te verwijderen. Visualiseer de deeltjes met een werkafstand van 5 tot 15 millimeter van de bundel, een versnellingsspanning van 5 tot 12 kilovolt en een spotgrootte van 1 tot 3; hogere bundelsterktes kunnen leiden tot regionale opwarming van het monster, wat de oppervlaktemorfologie van de deeltjes zal veranderen. Microdeeltjes worden geobserveerd bij een vergroting van 100 keer en nanodeeltjes zijn herkenbaar bij 3000 keer.

Focus de vergroting op de bovenkant van een bol om deeltjes te lokaliseren die gemakkelijk met SEM gevisualiseerd kunnen worden; verzamel ten minste drie afbeeldingen per batch om een representatieve steekproef van de deeltjesgrootte en morfologie te verkrijgen. Met deze methode kunnen deeltjes worden gecreëerd door een enkele emulsie die verschijnen als individuele, niet-gefuseerde bollen met een gladde oppervlaktemorfologie en een breed scala aan groottes die over het monster zijn verdeeld. De microdeeltjes die hier worden getoond, hebben een gemiddelde diameter van 730 nanometers.

Hier worden nanodeeltjes getoond die zijn gecreëerd door een enkele emulsie en die het hydrofobe geneesmiddel campine inkapselen. Deze deeltjes bleken nog kleiner te zijn, met een gemiddelde diameter van 340 nanometer. Hogere concentraties emulsiemiddel resulteerden in kleinere deeltjes, waarbij de gemiddelde diameters afnamen van 2000 naar 200 nanometer.

Naarmate de concentratie van de emulgator toenam van 0,01 naar 0,3%, zoals te zien is op de SEM-opnamen hier. Wanneer de concentratie van vitamine E-T-P-G-S echter te hoog was, vormden zich geen discrete deeltjes; bij gebruik van 1% vitamine E-T-P-G-S werden zware versmeltingen en plaatvormige structuren in de gehele structuur aangetroffen. Correct. Zodra u heeft geleerd hoe u PLG-nanodeeltjes door emulsificatie kunt vervaardigen, kunnen andere methoden, zoals oppervlaktemodificatie, worden toegepast om nanodeeltjes te ontwikkelen voor interactie met specifieke celtypen of regio's in het lichaam.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u deeltjes met een reproduceerbare en instelbare grootte kunt vormen door middel van emulsificatie.