Isolatie en karakterisering van chimerische menselijke fc-uitdrukkende eiwitten met behulp van eiwitten een membraanadsorbers en een gestroomlijnde workflow

Het algemene doel van deze procedure is om chimeere menselijke FC-expresserende eiwitten efficiënt en effectief te isoleren en te karakteriseren met behulp van proteïne A-membraanabsorbers en een gestroomlijnde workflow. Dit wordt bereikt door eerst het supernatant van de celkweek te klaren met een 0,22 micron filter. De tweede stap is het assembleren van het flowsysteem en het starten van de perfusie van het supernatant van de celkweek door de proteïne A-membraanabsorber.

Vervolgens wordt het menselijke Fc-expresserende eiwit geëlueerd van de membraanabsorber, waarbij het resulterende EIT wordt geconcentreerd via ultrafiltratie, gevolgd door bufferuitwisseling via dialyse. De laatste stappen bestaan uit het gebruik van flowcytometrie en western blotting om de kwaliteit en kwantiteit van het geconcentreerde eiwit te bepalen. Uiteindelijk laten proteïne A-membraanabsorbers, samen met een gestroomlijnde workflow, een afname in verwerkingstijd en een potentiële toename in eiwitopbrengst zien in vergelijking met traditionele affiniteitschromatografie met proteïne A aro speed packed kolommen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals kolomaffiniteitschromatografie, is dat de membraanabsorber potentieel hogere eiwitopbrengsten mogelijk maakt met een kortere verwerkingstijd. De selectie van geschikte karakteriseringsmethoden kan de verwerkingstijd eveneens verkorten. Bereid de membraanabsorber voor volgens de instructies van de fabrikant, waarbij moet worden gewaarborgd dat alle geperfundeerde oplossingen op kamertemperatuur zijn en vooraf zijn gefiltreerd door een 0,22 micron filter. Vul eerst een spuit van 10 milliliter met 0,22 micron gefiltreerde KO's fosfaatgebufferde zoutoplossing of DPBS en verwijder eventuele luchtbellen.

Om te voorkomen dat er lucht in de membraanabsorber komt, moet de membraanabsorber onmiddellijk voor gebruik worden geperfuseerd met DPBS om de bewaaroplossing te verwijderen en de membraanabsorber te equilibreren. Filtreer het supernatant van de celkweek onmiddellijk voor perfusie door de membraanabsorber met een vacuümdriven steriele filtratie-eenheid van 0,22 micron om de proteïne A membraanabsorber te laden, zuig het supernatant van de celkweek op in een luer-lock spuit en verwijder eventuele luchtbellen om de materialen en apparatuur voor te bereiden. Sluit vervolgens de spuit aan op de inlaat van de membraanabsorber.

Bevestig indien gewenst een flexibele slang aan de uitlaat van de membraanabsorber. Plaats een spuitfilter van 0,22 micron tussen de spuit en de membraanabsorber. Gebruik een kolf of fles om het effluent uit de absorber op te vangen.

Stel de spuitenpomp in op de gewenste volumetrische stroomsnelheid, maar overschrijd niet de door de fabrikant aanbevolen stroomsnelheid. Perfundeer het supernatant van de celkweek door de membraanabsorber en verzamel de doorstroom. Vul de spuit indien nodig opnieuw met supernatant.

Indien gewenst kan, afhankelijk van de voorkeur van het laboratorium, de doorstroom op de aanwezigheid van eiwit worden getest met behulp van flowcytometrie, western blotting of ELISA; het is doorgaans niet nodig om de doorstroom opnieuw te perfuseren om het eiwit uit de membraanabsorber te elueren. Was eerst de membraanabsorber met 10 milliliters DPBS om alle niet-gebonden eiwitten te verwijderen. Elueer het eiwit uit de membraanabsorber met de gewenste stroomsnelheid.

Gebruik 10 tot 15 milliliter elutiebuffer. Vang de EIT op in een buis met neutralisatiebuffer op 10% van het elutievolume. Regenereer na het elueren van het eiwit de membraanabsorber volgens de instructies van de fabrikant.

Vul de membraanabsorber met 20% ethanol in DPBS voor langdurige bewaring bij vier graden Celsius. Zet alle EIT af in een centrifugale filtereenheid met een afsnijwaarde van 10 kilodalton.

Volg de instructies van de fabrikant voor centrifugatie-dialyse. De retentaat in een dialyse-unit met een klein volume en een moleculaire gewichtsafsnijding (cutoff) van 10 kilodalton tegen de gekozen buffer; er kan mogelijk buffer aan het gedialyseerde materiaal moeten worden toegevoegd.

Indien proteïneprecipitatie een zorg is, scheid dan de gezuiverde proteïne en de FC-standaarden op de gewenste gel middels SDS-PAGE onder reducerende of niet-reducerende omstandigheden, naar behoefte. Gebruik een mini-gel om de looptijd te minimaliseren en laad meerdere hoeveelheden van het gezuiverde proteïne, inclusief monsters verdund met DPBS, om ervoor te zorgen dat de signalen van de gezuiverde proteïnebanden binnen het lineaire signaalbereik van de FC-standaarden vallen. Bij de beeldanalyse na scheiding op de gel worden de proteïnen vanuit de gel overgebracht naar een polyvinylfluoride-membraan in een discontinu buffersysteem met gebruik van een semi-droge blotter volgens de instructies van de fabrikant; de overdrachtstijd bedraagt doorgaans vijf tot 10 minuten.

Kleur de gel met Coomassie na overdracht om de efficiëntie van de overdracht te verifiëren. Voer immunoblots uit met anti-FC of anti-IgG geconjugeerd aan alkalische fosfatase of mierikswortelperoxidase met behulp van vacuümondersteunde eiwitdetectie. De tijd voor immunobloting is doorgaans minder dan één uur.

Ontwikkel de immunoblot met het substraat en de methode naar keuze. Kwantificeer het gezuiverde eiwit via beeldanalyse. Voer een lineaire regressie uit op de bandsignalen van de FC-standaarden.

Als de R-kwadraatwaarde groter is dan 0,90, gebruik dan de vergelijking van de lijn om de eiwithoeveelheid te berekenen op basis van het bandsignaal, waarbij indien nodig rekening wordt gehouden met de verdunning van het monster. Aangezien de kwantificering van het eiwit wordt uitgevoerd op basis van fc, moet de waarde worden gecorrigeerd voor de verschillen in molecuulgewicht tussen het eiwit en fc. Als de R-kwadraatwaarde kleiner is dan 0,90, herhaal dan de versnelde western blotting-procedure.

Valideer ten slotte het eiwit met behulp van functionele assays of methoden om FC via flowcytometrie te detecteren. Western blotting of EISA-flowcytometrie werd gebruikt om de aanwezigheid van functionele GAL one HFC in het supernatant van de startcelcultuur te testen, zoals aangegeven door het blauwe histogram; vers celcultuurmedium, hier in rood weergegeven, diende als negatieve controle. Het histogram in groen, dat dit histogram overlapt, is de flow-through, wat aangeeft dat de membraanabsorber GAL one HFC efficiënt heeft opgevangen en vastgehouden. GAL one HFC werd geëlueerd van de membraanabsorber in stappen van 1 mL met een snelheid van 1 mL per minuut met behulp van een amine-gebaseerde zure buffer, en geneutraliseerde elutiefracties werden vervolgens getest op de aanwezigheid van functionele GG one HFC met behulp van flowcytometrie. Het GL one HFC-signaal nam sequentieel toe van elutie 1, wat ongeveer gelijk was aan de negatieve controle, tot een maximum bij EEU 3, en nam vervolgens af tot een bijna constant niveau bij eluties 9 en 10.

De uiteindelijke EEU 10 bereikte geen equivalentie met het signaal van de negatieve controle vanwege enige retentie door de adsorber van GL one HFC; de kwantificatie en karakterisering van het gezuiverde GL one HFC werd uitgevoerd via een western blotting-procedure, versneld door semi-droge transfer en vacuümgeassisteerde immunobloting. Door het GA one HFC-signaal te vergelijken met kwantificatiestandaarden voor HFC, werden zowel de kwantiteit als de kwaliteit van het gezuiverde materiaal bepaald.

GAL one HFC en gedegradeerde GAL one HFC-signalen bevonden zich binnen het standaardbereik. De signaalintensiteiten van de HFC-standaardbanden waren lineair gerelateerd aan de hoeveelheid aanwezige HFC. De concentratie van gezuiverde GAL one HFC op basis van HFC werd door middel van beeldverwerking bepaald op 450 micrograms per milliliter.

Correctie voor het molecuulgewicht van G one HFC. De concentratie van het gezuiverde materiaal was 720 µg/mL. In tegenstelling hiertoe was er in baan zes en zeven van de hier getoonde western blot te veel gezuiverd GAL one HFC geladen, wat signalen genereerde die het bereik van de HFC-standaarden verzadigden of overschreden, waardoor kwantificering onmogelijk was.

Als alternatief voor western blotting kan Coomassie-gelkleuring dienen als een snelle kwaliteitscontrole en/of kwantificeringsmethode. Let op dat er in het gedegradeerde GAL one HFC-monster, naast banden van ongeveer 25 kilodalton en 40 kilodalton, ook een band van ongeveer 10 kilodalton aanwezig was. Deze band is gedegradeerd GAL one HFC dat niet reageerde met het detectie-antilichaam dat werd gebruikt in de western blots.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht gekregen in hoe u chimere humane FC-expresserende eiwitten kunt isoleren met behulp van membraanabsorbers en hoe u deze eiwitten in slechts vier uur kunt karakteriseren.