Name: Isolatie en karakterisering van chimerische menselijke fc-uitdrukkende eiwitten met behulp van eiwitten een membraanadsorbers en een gestroomlijnde workflow (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-08T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Leer chimerische humane Fc-eiwitten isoleren en karakteriseren met behulp van eiwit A membraanabsorbers en een gestroomlijnde workflow. Deze methode vermindert de verwerkingstijd aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de heer Luis F. Delgadillo (Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University), mr. Matthew H. Williams (Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University) en Dr. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School) bedanken voor deskundige technische bijstand. De auteurs willen ook de che 404/BME 504 van de winter 2011 en de studenten che 4830/BME 5830 (Department of Chemical and Biomolecular Engineering and Biomedical Engineering Program, Ohio University) bedanken voor technisch advies en discussie. Dit werk werd ondersteund door National Science Foundation (NSF) Major Research Instrumentation grant CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), National Institutes of Health (NIH) NCI grant 1R15CA1618 30-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Postdoctorale Fellowship F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD) en NIH NCCAM-beurs R01AT004628 (CJD).

1. Controleer de affiniteit voor eiwit A
<ol><li>Controleer of het Fc-uitdrukkende eiwit (recombinant fusie-eiwit of IgG-antilichaam, hierna "eiwit" genoemd) een aanvaardbare affiniteit heeft voor eiwit A14-17 voordat het eiwit A-membraanadsorber wordt gebruikt, en test op de aanwezigheid van het eiwit in de stamoplossing(bijv. celkweeksupernatant verduidelijkt door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 5 minuten naar pellets gesuspendeerde cellen). Gebruik flow cytometrie, Western blotting, ELISA, etc. om de eiwitfunctie en/of aanwezigheid van Fc te detecteren, op basis van laboratoriumvoorkeur. Kwantificeer idealiter het eiwit in het celkweeksupernatans (stap 6) om te voorkomen dat het eiwit de adsorbercapaciteit van het membraan overschrijdt. Ga verder als er eiwit wordt gedetecteerd.</li>
</ol>2. Bereid eiwit een membraanadsorber en celkweek supernatant
<ol><li>Volg de instructies van de fabrikant voor het bereiden van de membraanadsorber. Laat nooit lucht in de membraanadsorber komen. Alle oplossingen die door de membraanadsorber worden geperfuseerd, moeten op kamertemperatuur zijn en voorgefilterd met een filter van 0,22 μm. Vul een spuit van 10 ml met 0,22 μm gefilterde Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) of buffer naar keuze en ontlaad luchtbellen. Perfuse DPBS om de opslagoplossing te verwijderen en de membraanadsorber vlak voor gebruik te equilibreren.</li>
	<li>Filtreer het celkweeksupernaant onmiddellijk voor de perfusie door de membraanadsorber met behulp van een vacuümgestuurde steriele filtratie-eenheid van 0,22 μm.</li>
</ol>3. Laad de Protein A Membraanadsorber
<ol><li>Aspireer celkweeksupernatant in een Luer Lock spuit (30 ml of groter) en ontlaad eventuele luchtbellen.</li>
	<li>Monteer materialen en apparatuur zoals weergegeven in figuur 1. Sluit de spuit aan op de inlaat van de membraanadsorber. Bevestig flexibele slangen aan de membraanadsorberuitlaat. Plaats indien gewenst een spuitfilter van 0,22 μm tussen de spuit en de membraanadsorber. Gebruik een kolf of fles om de stroom (ook wel filtraat genoemd) uit de adsorber op te vangen.</li>
	<li>Stel de spuitpomp in op het gewenste volumetrische debiet, maar overschrijd het door de fabrikant aanbevolen debiet(bijv. 10 ml/min) niet. Doordrenkt de celkweek supernatans door de membraanadsorber en verzamel de stroom door in een bekerglas of andere container. Herlaad de spuit met supernatanten die nodig zijn.</li>
	<li>Test indien gewenst de doorstroming op de aanwezigheid van eiwitten met behulp van flowcytometrie, western blotting, ELISA, enz. op basis van labvoorkeur. Het is meestal niet nodig om de stroom er doorheen te halen.</li>
</ol>4. Elute-eiwit uit de membraanadsorber
<ol><li>Was de membraanadsorber met 10 ml DPBS om eventuele niet-gebonden eiwitten te verwijderen.</li>
	<li>Elute-eiwit uit de membraanadsorber bij het gewenste debiet(bijv. 1 ml/min) met 10-15 ml elutiebuffer(bv. elutiebuffer op basis van amine (pH 2,8)). Vang eluaat in een buis met neutraliserende buffer(bijv. 1 M Tris (pH 9,4)) bij 10% van het elutievolume (1,0-1,5 ml).</li>
	<li>Als alternatief wordt elute-eiwit in stappen van één ml in buizen met 100 μl neutralisatiebuffer gebracht, met een totaal volume van 10-15 ml elutiebuffer. Gebruik de voorkeurskarakteriseringsmethode om elke fractie te testen op de aanwezigheid van eiwitten.</li>
	<li>Regenereer de membraanadsorber volgens de instructies van de fabrikant. Perfuseer 10 ml 0,22 μm-gefilterde DPBS of buffer naar keuze, vervolgens 10 ml 0,22 μm gefilterde 50 mM NaOH in 1 N NaCl en ten slotte 10 ml 0,22 μm gefilterd DPBS. Vul de membraanadsorber met 20% ethanol in DPBS voor langdurige opslag bij 4 ºC.</li>
</ol>5. Concentraat en dialyse het eiwit
<ol><li>Deponeer alle eluaat (of elutied fracties die eiwit bevatten zoals bepaald in stap 4.3) in een 10 kDa moleculair gewicht afgesneden centrifugaal filtereenheid. Volg de instructies van de fabrikant voor centrifugeren.</li>
	<li>Dialyseer het retentaat in een kleine volumedialyse-eenheid (10 kDa moleculaire gewichtsafsnijding) tegen de buffer van keuze, volgens de instructies van de fabrikant. Buffer moet mogelijk worden toegevoegd aan gedialyseerd materiaal als eiwitprecipitatie een probleem is. Indien gewenst kan het gedialyseerde materiaal worden gekoeld tot stap 6 kan worden uitgevoerd, maar langdurige opslag zonder conserveringsmiddelen wordt niet aanbevolen.</li>
</ol>6. Kwantificeer en karakteriseer gezuiverd product in een versnelde westerse blotting-procedure
<ol><li>Los gezuiverde eiwit- en Fc-normen op de gel van keuze door SDS-PAGE op, onder reducerende of niet-reducerende omstandigheden zoals gewenst18-20. Gebruik een minigel in plaats van midi-gel om de looptijd te minimaliseren.<ol>
<li>Indien nog niet bekend, bepaal dan het Fc-normenbereik waarover het bandsignaal lineair varieert ten opzichte van de hoeveelheid geladen(bijv. 0,1-1 mg). Gebruik dezelfde gel, loopomstandigheden, overdrachtsomstandigheden en reagentia die zullen worden gebruikt om gezuiverd eiwit te kwantificeren en te karakteriseren.</li>
			<li>Laad meerdere monsterhoeveelheden gezuiverd eiwit, inclusief monsters verdund met DPBS, om ervoor te zorgen dat de gezuiverde eiwitbandsignalen binnen het lineaire signaalbereik van de Fc-normen in beeldanalyse liggen.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Breng eiwitten van de gel over naar een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan in een discontinu buffersysteem met behulp van een semidry blotter13, volgens de instructies van de fabrikant van de blotter. Transfertijd is meestal 5-10 min. Indien gewenst, Coomassie beits de gel na overdracht om overdrachtsefficiëntie te controleren21.</li>
	<li>Voer immunoblotting uit met anti-Fc of anti-IgG geconjugeerd tot alkalische fosfatase (AP) of paardenradijsperoxidase (HRP), op basis van laboratoriumvoorkeur, met behulp van een vacuümondersteund eiwitdetectiesysteem. Immunoblotting tijd is meestal minder dan 1 uur.</li>
	<li>Ontwikkel immunoblot met behulp van het substraat en de methode van keuze(bijv. AP-substraat en verbeterde chemiluminescentie).</li>
	<li>Kwantificeer gezuiverd eiwit door beeldanalyse. Voer een lineaire regressie uit op de bandsignalen van fc-normen. Als R2>0,90, gebruikt u de vergelijking voor de lijn om de eiwithoeveelheid te berekenen op basis van het bandsignaal(en). Houd zo nodig rekening met monsterverdunning. Aangezien de kwantificering van het eiwit wordt uitgevoerd op basis van Fc, past u de waarde voor moleculaire gewichtsverschillen tussen het eiwit en Fc aan. Als R2<0,90, herhaalt u stap 6 in zijn geheel.</li>
	<li>Valideer eiwitten met behulp van functionele testen of methoden om Fc te detecteren via flowcytometrie, western blotting, ELISA, enz. op basis van labvoorkeur.</li>
	<li>Verdun eiwitten tot de gewenste concentratie en/of voeg de gewenste conserveermiddelen of stabilisatoren toe aan de gezuiverde eiwitoplossing voordat u ze aliquoteert voor langdurige opslag, bevroren of anderszins.</li>
</ol>

<ol><li>Gagnon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+trends+in+antibody+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Technology trends in antibody purification.</a> J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).</li>
<li>Gottschalk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioseparation+in+antibody+manufacturing%3A+The+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly.</a> Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).</li>
<li>Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+and+purification+process+development+for+monoclonal+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Recovery and purification process development for monoclonal antibody production.</a> MAbs. 2, 480-499 (2010).</li>
<li>Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+of+antibody+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Anal.+Technol.+Biomed.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">Future of antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).</li>
<li>Boi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+adsorbers+as+purification+tools+for+monoclonal+antibody+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Anal.+Technol.+Biomed.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).</li>
<li>Cuatrecasas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+by+affinity+chromatography.+Derivatizations+of+agarose+and+polyacrylamide+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads.</a> J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).</li>
<li>Shukla, A. A., Gottschalk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-use+disposable+technologies+for+biopharmaceutical+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing.</a> Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).</li>
<li>Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+a+new+protein+a+affinity+membrane+for+the+primary+recovery+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies.</a> Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).</li>
<li>Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+immunoglobulins+g+by+protein+a%2Fg+afinity+membrane+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography.</a> J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).</li>
<li>Thommes, J., Etzel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+chromatographic+separations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Alternatives to chromatographic separations.</a> Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).</li>
<li>Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+and+simulation+of+affinity+membrane+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Modelling and simulation of affinity membrane adsorption.</a> J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).</li>
<li>van Beijeren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-aided+process+design+of+affinity+membrane+adsorbers%3A+A+case+study+on+antibodies+capturing%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Pap%22%5BJournal%5D)">Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing.</a> Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).</li>
<li>Lauriere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semidry+electroblotting+system+efficiently+transfers+both+high-+and+low-molecular-weight+proteins+separated+by+sds-page%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page.</a> Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).</li>
<li>Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+antibodies+using+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of antibodies using affinity chromatography.</a> Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).</li>
<li>Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+a+from+staphylococcus+aureus.+Its+isolation+by+affinity+chromatography+and+its+use+as+an+immunosorbent+for+isolation+of+immunoglobulins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins.</a> FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).</li>
<li>Hober, S., Nord, K., Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+a+chromatography+for+antibody+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Analyt.+Technol.+Biomed.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein a chromatography for antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).</li>
<li>Kronvall, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surface+component+in+group+a%2C+c%2C+and+g+streptococci+with+non-immune+reactivity+for+immunoglobulin+g%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g.</a> J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).</li>
<li>Cedeno-Laurent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+nascent+galectin-1+chimeric+molecule+for+studying+the+role+of+leukocyte+galectin-1+ligands+and+immune+disease+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation.</a> J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+t4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+Procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Coomassie+brilliant+blue+g250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li>
<li>Cedeno-Laurent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+inhibition+of+galectin-1-binding+carbohydrates+accentuates+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity.</a> J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (33), (2009).</li>
<li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+Bradford+Protein+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Linearization of the Bradford Protein Assay.</a> J. Vis. Exp. (38), (2010).</li>
<li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analyses+of+all+Influenza+Type+A+Viral+Hemagglutinins+and+Neuraminidases+using+Universal+Antibodies+in+Simple+Slot+Blot+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays.</a> J. Vis. Exp. (50), (2011).</li>
</ol>

Er valt niets te onthullen.

Het hierin beschreven protocol is ontwikkeld om snel een chimerisch fusie-eiwit te isoleren en te karakteriseren dat menselijke Fc (Gal-1hFc) uitdrukt, zonder het herstel van het product of de opblaaskosten aanzienlijk in gevaar te brengen. De belangrijkste componenten van de gestroomlijnde workflow zijn een eiwit A membraanadsorber voor isolatie, en semidry transfer en vacuüm-ondersteunde immunoblotting voor karakterisering door western blotting.
De dramatische afname van de verwerkingstijd v...

Isolatie van antilichamen en recombinante eiwitten die immunoglobuline G (IgG) uitdrukken Fc-fragmenten van celkweeksupernatanten en verdunde lysed cell-oplossingen kan worden bereikt met behulp van eiwit A affiniteitschromatografie. In basiswetenschappen en technische laboratoria en industrie worden kolommen vol poreuze eiwitten met A-gecoate agarose, glas of polymere kralen het meest gebruikt voor affiniteitschromatografie, ondanks hoge financiële kosten en lange verwerkingstijden1-3. Het wordt zeer gewaardeerd dat affiniteitschromatografie het grootste kosten- en verwerkingsknelpunt vormt in zowel laboratorium- als industriële omgevingen2,4. Als gevolg hiervan zijn tal van verbeteringen ontwikkeld om de kosten en verwerkingstijd te verlagen zonder in te boeten aan algehele productterugwinning van de procestrein1,2,5-7. Bijzonder veelbelovend voor de isolatie van antilichamen en andere Fc-uitdrukkende eiwitten is affiniteitschromatografie met behulp van een eiwit A membraanadsorber2,5,7-10. Terwijl de fc-afvang in kolomchromatografie diffusiebeprijzingsbeïnvloeding is (d.w.z. het Fc-uitdrukkende eiwit moet diffuus zijn in en door interne poriën om het grootste deel van het eiwit A te bereiken) met een hoge drukval over de kolom, wordt massatransport in membraanadsorbers aangedreven door bulkconvectie, wat resulteert in het vermijden van diffusiebeperkingen8,9,11,12. Bovendien is de drukval over de membraanadsorber laag, waardoor snellere perfusiedebieten mogelijk zijn in vergelijking met met kralen gevulde kolommen8,9,11,12. Voor laboratoriumschaalisolatie wordt dus voorspeld dat membraanchromatografie de isolatietijd met enkele uren zal verkorten en de productopname zal verhogen in vergelijking met kolomchromatografie. Bovendien zijn wiskundige modellen voor IgG-adsorptie in membraanadsorbers voorgesteld8,9,11,12, waardoor eindgebruikers de prestaties in het lab kunnen voorspellen.
Een ander knelpunt in basiswetenschappelijke en technische laboratoria is de karakterisering van het Fc-uitdrukkende eiwit. De selectie van geschikte methoden om karakteriseringstests, zoals westerse vlekken, te voltooien, kan de tijd die aan producttests wordt besteed echter aanzienlijk verminderen. Semidry-overdracht in een discontinu buffersysteem kan bijvoorbeeld elektroforetische overdracht van eiwitten van een SDS-PAGE-gel naar een polyvinyldifluoridine (PVDF) membraan in een kwestie van minuten bereiken, in tegenstelling tot 1-2 uur in tank (natte) overdracht in een continu buffersysteem13.
Een snel, goedkoop en effectief protocol om een chimerisch fusie-eiwit te isoleren en te karakteriseren dat een Fc-fragment van menselijke IgG uitdrukt, wordt hierin beschreven. De meeste apparatuur is direct beschikbaar in standaard basis biomedische wetenschap, biologie, chemie en (bio)chemische engineering labs, en alle reagentia zijn in de handel verkrijgbaar. Hoewel representatieve resultaten werden gegenereerd uit de isolatie en karakterisering van een murien galectine-1/menselijk Fc chimerisch fusie-eiwit (Gal-1hFc), kan het gestroomlijnde protocol worden toegepast op de isolatie van andere moleculen die een Fc-fragment bezitten, zoals antilichamen, Fc-fragmenten zelf of andere Fc-fusie-eiwitten. Onze verbeteringen verminderden de verwerkingstijd drastisch (slechts 4 uur maar meer typisch ~ 9 uur, vergeleken met 20 + werkuren) terwijl we vergelijkbare of verbeterde productherstel bereikten in vergelijking met standaardmethoden.

<table><tbody><tr><td>Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml)&nbsp;</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>93PRAP06HB-12--A</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td>Gebruik 15 ml volume indien nodig</td></tr><tr><td>Steriele vacuümfiltereenheid, 0,22 &micro;m, 500 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Spuiten met Luer Lock tips</td><td>BD</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Spuiten met Luer Lock tips</td><td>BD</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>Tygon lab slang (1/16 inch x 1/8 inch x 50 ft)</td><td>Cole Parmer</td><td>WU-95903-16</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI dialyse-apparaten (10K MWCO)</td><td>Thermo Scientific</td><td>69576</td><td></td></tr><tr><td>Snap i.d. antilichaamopvangbakje</td><td>EMD Millipore</td><td>WBAVDABTR</td><td></td></tr><tr><td>Snap i.d. single well blot houder</td><td>EMD Millipore</td><td>WBAVDBH01</td><td></td></tr><tr><td>Elutiebuffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Tris, ultra puur</td><td>Fisher Scientific</td><td>819623</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>DPBS met Ca2+/Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Human Fc</td><td>Bethyl Research Laboratories</td><td>P80-104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human Fc-APC</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>109136170</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human Fc-AP</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5018</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline fosfataas substraat</td><td>Promega</td><td>S3841</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry buizen (5 ml polystyreen of polypropyleen)</td><td>BD</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-2226</td><td>Een peristaltiek pomp is ook acceptabel</td></tr><tr><td>Eiwitgelelektroforesesysteem</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>552BR094876</td><td>Elk gelelektroforesesysteem is acceptabel, maar mini gel systemen lopen het snelst</td></tr><tr><td>Semidry blotter</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>690BR006163</td><td>Elk overdrachtssysteem is acceptabel, maar discontinue overdrachtssystemen voeren de elektroforese overdracht het snelst uit</td></tr><tr><td>SNAP i.d. vacuüm-ondersteund eiwitdetectiesysteem</td><td>EMD Millipore</td><td>WBAVDBASE</td><td>Een verbeterd model heeft dit specifieke instrument vervangen, maar beide zouden net zo goed moeten werken</td></tr></tbody></table>

isolatie en karakterisering van chimerische menselijke fc-uitdrukkende eiwitten met behulp van eiwitten een membraanadsorbers en een gestroomlijnde workflow

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Laboratoriumschaal tot industriële schaalzuivering van biomoleculen uit celkweeksupernatanten en lysed cell-oplossingen kan worden bereikt met behulp van affiniteitschromatografie. Hoewel affiniteitschromatografie met poreus eiwit A-agarose kralen verpakt in kolommen misschien wel de meest voorkomende methode is voor laboratoriumschaalisolatie van antilichamen en recombinante eiwitten die Fc-fragmenten van IgG uitdrukken, kan het een tijdrovend en duur proces zijn. Tijds- en financiële beperkingen zijn vooral ontmoedigend in kleine basiswetenschappelijke laboratoria die honderden microgrammen tot milligram eiwit moeten terugwinnen uit verdunde oplossingen, maar geen toegang hebben tot hogedruksystemen voor vloeistofafgifte en/of personeel met expertise in bioseparaties. Bovendien kan productkwantificering en karakterisering ook de verwerkingstijd over meerdere werkdagen te lang verlengen en de kosten (verbruiksgoederen, lonen, enz.)opblazen. Daarom is een snel, goedkoop, maar effectief protocol nodig voor laboratoriumschaalisolatie en karakterisering van antilichamen en andere eiwitten die een Fc-fragment bezitten. Hiervoor hebben we een protocol opgesteld dat kan worden ingevuld door technisch personeel met beperkte ervaring in minder dan 9 uur (ongeveer één werkdag) en zo snel als 4 uur, in tegenstelling tot traditionele methoden die meer dan 20 werkuren vereisen. De meeste benodigde apparatuur is direct beschikbaar in standaard biomedische wetenschap, biochemie en (bio)chemische engineering labs, en alle reagentia zijn in de handel verkrijgbaar. Om dit protocol aan te tonen, worden representatieve resultaten gepresenteerd waarin chimerische muriene galectine-1 gesmolten tot menselijke Fc (Gal-1hFc) uit celkweek supernatant werd geïsoleerd met behulp van een eiwit A membraanadsorber. Gezuiverde Gal-1hFc werd gekwantificeerd met behulp van een versnelde westerse blotting analyse procedure en gekenmerkt met behulp van flow cytometrie. De gestroomlijnde workflow kan worden aangepast voor andere Fc-uitdrukkende eiwitten, zoals antilichamen, en/of worden gewijzigd om alternatieve kwantificerings- en karakteriseringsmethoden op te nemen.

Het gestroomlijnde protocol voor isolatie en karakterisering van Fc-uitdrukkende eiwitten wordt routinematig gebruikt om chimerische muriene galectine-1 gesmolten tot menselijke Fc (Gal-1hFc) te verwerken uit verdunde celkweeksupernatanten. Het stroomdiagram in figuur 2 illustreert de workflow en tijd voor elke stap in het protocol. Voor een typische partij van 300 ml supernatans is de totale verwerkingstijd ongeveer 9 uur wanneer de optionele flowcytometrietests van elutiefracties worden uitgevoerd. Als...

In vergelijking met traditionele affiniteitschromatografie met behulp van eiwit A agarose kraal-verpakte kolommen, eiwit A membraan adsorbers kunnen aanzienlijk versnellen laboratorium-schaal isolatie van antilichamen en andere Fc fragment-expresserende eiwitten. Geschikte analyse- en kwantificeringsmethoden kunnen de eiwitverwerking verder versnellen, waardoor isolatie/karakterisering in één werkdag kan worden voltooid, in plaats van 20+ werkuren.

Isolatie en karakterisering van chimerische menselijke fc-uitdrukkende eiwitten met behulp van eiwitten een membraanadsorbers en een gestroomlijnde workflow

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

Het algemene doel van deze procedure is om chimeere menselijke FC-expresserende eiwitten efficiënt en effectief te isoleren en te karakteriseren met behulp van proteïne A-membraanabsorbers en een gestroomlijnde workflow. Dit wordt bereikt door eerst het supernatant van de celkweek te klaren met een 0,22 micron filter. De tweede stap is het assembleren van het flowsysteem en het starten van de perfusie van het supernatant van de celkweek door de proteïne A-membraanabsorber.Vervolgens wordt het menselijke Fc-expresserende eiwit geëlueerd van de membraanabsorber, waarbij het resulterende EIT wordt geconcentreerd via ultrafiltratie, gevolgd door bufferuitwisseling via dialyse. De laatste stappen bestaan uit het gebruik van flowcytometrie en western blotting om de kwaliteit en kwantiteit van het geconcentreerde eiwit te bepalen. Uiteindelijk laten proteïne A-membraanabsorbers, samen met een gestroomlijnde workflow, een afname in verwerkingstijd en een potentiële toename in eiwitopbrengst zien in vergelijking met traditionele affiniteitschromatografie met proteïne A aro speed packed kolommen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals kolomaffi

isolation-characterization-chimeric-human-fc-expressing-proteins

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De cel permeabele crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionaat)] stabiliseert van voorbijgaande aard en labiele...

Isolatie van labiele Multi-eiwit-complexen door In vivo Gecontroleerde Cellulaire Cross-Linking and Immuno-magnetische affiniteitschromatografie

Een roman en zeer efficiënte twee-staps affiniteitschromatografie protocol is ontwikkeld en wordt in detail beschreven. De methode is gebaseerd op een kleine zuivering tag met twee inherente affiniteit en is van toepassing op een breed scala van target eiwitten met verschillende eigenschappen.

Orthogonale Protein Purification Gesteund door een Small Bispecifieke Affiniteit Tag

In de post-humane genomics-tijdperk, de beschikbaarheid van recombinante eiwitten in de moedertaal van conformaties is cruciaal voor structurele, functionele en therapeutisch onderzoek en ontwikkeling. Hier beschrijven we een test-en grootschalige eiwitexpressie systeem humane embryonale nier 293T cellen die kunnen worden gebruikt om een ​​verscheidenheid van recombinante eiwitten.

Een handig en algemene uitdrukking platform voor de productie van de uitgescheiden eiwitten uit menselijke cellen

This video demonstrates an assay for purifying monoclonal antibodies from cell culture fluid harvested from Chinese Hamster Ovarian cells. It employs a porous glass resin with immobilized protein A, which binds to the Fc region of the antibodies in the sample, effectively separating them from contaminants. The use of a low-pH elution buffer weakens the interaction, facilitating the retrieval of purified antibodies.

A Technique to Purify Monoclonal Antibodies Produced by Chinese Hamster Ovary Cells

This video demonstrates a technique for purifying monoclonal antibodies from the culture supernatant obtained from an antibody-producing cell culture. The process involves using a matrix of crosslinked agarose beads with conjugated Protein A, which immobilizes the antibodies in the supernatant on the beads, allowing for effective separation from contaminants. By applying an elution buffer with low pH, the protein A-antibody interaction is loosened, facilitating the collection of...

An Affinity Chromatography Technique for the Purification of Monoclonal Antibodies

Benaderingen voor de biofysische en structurele karakterisatie van glycoproteïnen presenteren wij met de immunoglobuline vouw door biolayer interferometrie, isothermische titratie calorimetrie en röntgendiffractie.

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

Structureel verwante proteïnen oefenen vaak verschillende biologische functies. De uitwisseling van gelijkwaardige gebieden van deze proteïnen te creëren chimeer eiwitten vormt een innovatieve aanpak ter identificatie van de kritische eiwit-regio's die verantwoordelijk voor hun functionele verschillen zijn.

Identificatie van functionele eiwit regio's via chimeer eiwit bouw

Een gedetailleerd protocol voor de zuivering en daaropvolgende analyse van een monoklonaal antilichaam uit geoogste celkweek vloeistof (HCCF) van geautomatiseerde microbioreactoren is beschreven. Het gebruik van analyses om kritische kwaliteitskenmerken (CQAs) te bepalen en beperkt sample volume te maximaliseren om vitale informatie te extraheren wordt ook gepresenteerd.

Zuivering en analyse van een monoklonaal antilichaam van Chinese Hamster Ovariumcellen met behulp van een geautomatiseerd Microbioreactor systeem

De BSelex-methode om individuele antigeen-specifieke antilichamen van humane perifere bloed mononucleaire cellen te identificeren en te herstellen combineert Flowcytometrie met eencellige PCR en klonen.

Eencellige screening methode voor de selectie en terugwinning van antilichamen met de gewenste specifieke kenmerken van verrijkte menselijke geheugen B-celpopulaties

In deze procedure, een dsred gebaseerde epitoop ligand is geïmmobiliseerd om een zeer selectieve affiniteit hars voor de inname van monoklonale antilichamen van ruwe plantenextracten of celkweek supernatants produceren, als een alternatief voor eiwit a.

Geactiveerde kruisgebonden agarose voor de snelle ontwikkeling van Affiniteits chromatografie harsen-antilichamen vangen als een casestudy

Leer chimerische humane Fc-eiwitten isoleren en karakteriseren met behulp van eiwit A membraanabsorbers en een gestroomlijnde workflow. Deze methode vermindert de verwerkingstijd aanzienlijk.

Isolatie en karakterisering van chimerische menselijke fc-uitdrukkende eiwitten met behulp van eiwitten een membraanadsorbers en een gestroomlijnde workflow (Video) | JoVE Journal

Isolatie en karakterisering van chimerische menselijke fc-uitdrukkende eiwitten met behulp van eiwitten een membraanadsorbers en een gestroomlijnde workflow

Meer video's verkennen