Name: In vitro cel-migratie en invasie assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Leer celmigratie- en invasieassays in vitro voor kankerbiologie en immunologie. Deze methoden met wondsluiting en transwell helpen onderzoekers celmotiliteit gedetailleerd bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Mike Myles, Sam Saunders en C.W. Elton van de ECU Multimedia & Technology Services voor hun hulp bij de videoproductie. We erkennen de subsidieondersteuning van North Carolina Biotechnology Center, Golfers against Cancer, Brody Brothers Endowment Fund, American Heart Association en ECU/Vidant Cancer Research and Education Fund (L.V.Y. en M.J.R.).

1. Cell Culture Wound Closure Assay <ol><li> Los cellen uit de weefselkweek plaat met behulp van 0,25% trypsine-EDTA-oplossing. Pellet cellen in een 15 ml conische buis door centrifugeren, het supernatans aspireren, en opnieuw te schorten cellen in cultuur media. Plate het juiste aantal cellen in een 6-wells plaat 100% confluentie in 24 uur. Opmerking: Tests nodig zijn om de tijd en aantal cellen 100% samenvloeiing bereiken door het celtype en de omvang van de put wordt gebruikt bepalen (bijvoorbeeld 1 x 10 6 B16F10 melanoma cellen worden gezaaid in een putje van een 6-well platen 24 uur voor de wond generatie). Alternatief kan 12 putjes of 24 putjes gebruikt. Opmerking: Indien beschikbaar, kunnen cellen in een cultuur-Insert (vanaf ibidi LLC) worden gezaaid op een behandeld weefselkweek plaat maken de wond pre-gegoten. Een cultuur-Insert kan het oppervlak van de weefselkweek plaat te beschermen tegen schade veroorzaakt door de pipet tip. Als een cultuur-Insert wordt gebruikt weglaten stap1.2. </li><li> In een steriele omgeving (meestal een bioveiligheid kap) maken gebruik van een 200 ul pipet tip om stevig tegen de bovenkant van de weefselkweek plaat en snel maken een verticale wond naar beneden door de cel monolaag. Een verschillende grootte pipetpunt kan worden gebruikt om de wond grootte die gewenst maken. Niet te veel kracht te gebruiken tegen de weefselkweek plaat met de pipet tip als het het oppervlak kunnen beschadigen. Als de wond vooraf gegoten, kan deze stap worden overgeslagen. </li><li> Aspireren de media en mobiele puin zorgvuldig. Genoeg kweekmedia Voeg langzaam tegen de putwand de bodem van de put te dekken en te voorkomen losmaken extra cellen. Na de generatie en de inspectie van de wond een eerste beeld moeten worden genomen. Plaats de weefselkweek plaat in een incubator ingesteld op de geschikte temperatuur en CO2-concentratie (gewoonlijk 37 ° C en 5% CO2). </li><li> Op verschillende tijdstippen, bijvoorbeeld elke 3 uur, verwijder de plaat uit de incubatof en plaats het onder een omgekeerde microscoop om een ​​momentopname foto te nemen en te controleren op wondsluiting. Indien een time-lapse microscopie beschikbaar is, neem een foto elke X aantal minuten (meestal beginnend met elke 5 minuten) voor een tijdsduur in een temperatuur-en CO 2-geregelde kamer. Afhankelijk van het celtype kan wondsluiting variëren. </li><li> Om de resultaten van snapshot foto&#39;s te analyseren, meet de afstand van de ene kant van de wond naar de andere met behulp van een schaal bar. Te analyseren en duidelijk aanwezig wondsluiting na verloop van tijd met behulp van een spreidingsdiagram of staafdiagram, bijv. figuur 1. </li><li> Om de time-lapse foto&#39;s te analyseren, importeert u de foto&#39;s in de ImageJ software (vrij verkrijgbaar bij http://rsb.info.nih.gov/ij/) om een ​​video te maken. Om deze open ImageJ doen, klikt u op Bestand, Importeren en Image Sequence. Zoek het bestand met foto&#39;s; Klik op de eerste foto in het bestand. Besparen video door Bestand, Opslaan als, en AVI. Single migrerende cellen kunnen worden waargenomen aan characterize gerichte beweging. Bovendien kunnen morfologische kenmerken zoals lamellipodia vorming en achterrand terugtrekking ook bestudeerd (Figuur 2 en de aanvullende video). </li></ol> 2. Transwell Cel Migratie en invasieanalyse <ol><li> In een steriele (gewoonlijk een bio kap) los cellen uit de weefselkweek plaat met een niet-enzymatische cel dissociatie buffer of 0,25% trypsine-EDTA, pellet cellen door centrifugeren, en zuig de bestaande media waardoor de gepelleteerde cellen. Re-schorten cellen in serum vrije media voor celkweek met 0,1% BSA (bovine serum albumine). Opmerking: Afhankelijk van de cellijn onderzocht 0.25% trypsine-EDTA celmigratie en invasie beïnvloeden door de splitsing van diverse receptoren op het celoppervlak 17. Opmerking: Het aantal cellen per ml afhankelijk van de grootte van de cellen. Verdere tests kunnen nodig zijn om een ​​seeding dichtheid die pro vindenVides de beste resultaten. Meestal 1 x 10 6 cellen / ml is een goed uitgangspunt voor de meeste celtypen bij gebruik van de 24-well Transwell voegen. Er is een scala van Transwell insert afmetingen en het aantal toegevoegde cellen worden dienovereenkomstig aangepast. </li><li> Plaat 100 pl celoplossing bovenop het filtermembraan in een transwell inzetstuk en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C en 5% CO2 om de cellen te vestigen. Opmerking: het poriegrootte van de transwell gebruikte membraan is afhankelijk van de individuele grootte van de cellen in het monster. Bijvoorbeeld, als de cellen te klein ook passeren door de poriën zonder migratie te vergemakkelijken of als ze te groot zij past niet door de poriën. Er zijn verschillende Transwell inzetstukken poriegrootten die variëren van 3 urn, 5 um en 8 urn voor celmigratie testen. De transwell inserts zijn verkrijgbaar bij bedrijven zoals Corning. Opmerking: De transwell migratie test kan eenvoudig worden aangepast om de cel invasie assay. Hiertoe voeg extracellulaire matrix (ECM) materiaal bovenop de transwell membraan cellen en voeg vervolgens bovenop de ECM. Zo wordt Matrigel ontdooid en vloeibaar op ijs en vervolgens 30-50 gl Matrigel wordt toegevoegd aan een 24-well transwell invoegen en gestold in een 37 ° C incubator gedurende 15-30 minuten een dunne gellaag gevormd. Celoplossing toegevoegd bovenop de Matrigel coating te simuleren invasie door de extracellulaire matrix. Let op: Er zijn duidelijke verschillen tussen de transwell cel migratie en de transwell celinvasie assays. De transwell cel migratie assay meet de chemotactische vermogen van cellen in de richting van een chemo-lokstof. De Transwell invasie assay echter meet zowel chemotaxis en de invasie van cellen door extracellulaire matrix, een proces dat gewoonlijk wordt gevonden in kanker metastase of embryonale ontwikkeling. </li><li> Met behulp van een pipet, zeer carefully voeg 600 ul van het gewenste chemo-attractant in de bodem van de onderste kamer van een 24-wells plaat. Voeg de chemo-lokstof zonder het verplaatsen van de transwell insert en vermijd het genereren van bubbels. Controleer de chemo-attractant vloeistof in de bodem goed contact maakt met het membraan in de bovenste put een chemotactische gradiënt vormen. Incubatietijd is afhankelijk van celtype en chemo-attractant gebruikt. Opmerking: Verdere tests nodig zijn om de incubatietijd te bepalen. Opmerking: Voor hechtende cellen, zal de gemigreerde cellen hechten aan de andere zijde van het membraan 1,8. De kwantificering van gemigreerde cellen kunnen worden uitgevoerd als volgt 2,4-2,8 (2,4-2,8 stappen hoeven niet in een steriele omgeving worden uitgevoerd). Voor niet-hechtende cellen, zal de gemigreerde cellen vallen in de media in de onderste kamer. Het aantal gemigreerde cellen kunnen worden geteld met behulp van hemocytometer of stromingscytometer 5. </li><li> Verwijder de transwell insert van de plaat. Gebruik een wattenstaafje zo vaak als nodig is om de media en de resterende cellen die niet zijn gemigreerd van de bovenkant van het membraan zonder beschadiging zorgvuldig verwijderen. </li><li> Voeg 600-1000 ul van 70% ethanol in een putje van een 24-wells plaat. Plaats de transwell inzetstuk in de 70% ethanol gedurende 10 minuten naar cel fixatie mogelijk te maken. Verwijder Transwell insert uit de 24-wells plaat en gebruik een wattenstaafje om de resterende ethanol uit de bovenkant van het membraan te verwijderen. Laat de transwell membraan drogen (gewoonlijk 10-15 minuten). </li><li> Voeg 600-1000 ul van 0,2% kristalviolet in een putje van een 24-wells plaat en plaats het membraan in het voor kleuring. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten. </li><li> Verwijder voorzichtig de kristalvioletoplossing vanaf de bovenkant van het membraan met een pipet tip of wattenstaafje. Heel voorzichtig, om te voorkomen dat het wassen af ​​vaste cellen, dompel de membraan in gedistilleerd water zo vaak als nodig is om het overtollige kristal viole verwijderent. Laat de transwell membraan te drogen. </li><li> Alles onder een omgekeerde microscoop en tel het aantal cellen in verschillende gezichtsveld gemiddeld bedrag cellen dat gemigreerd door het membraan naar de chemo-attractant en bevestigd aan de onderzijde van het membraan (Figuur 3) krijgen. </li></ol>

<ol><li>Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+tumor+cell+migration+and+metastasis+by+the+proton-sensing+GPR4+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor.</a> Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).</li>
<li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoskeleton+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The cytoskeleton and cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).</li>
<li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+a+physically+integrated+molecular+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li>
<li>Peter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+to+apoptotic+%26%2334%3Bfind-me%26%2334%3B+signals+is+mediated+via+the+phagocyte+receptor+G2A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Migration to apoptotic &#34;find-me&#34; signals is mediated via the phagocyte receptor G2A.</a> J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).</li>
<li>Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+chemotaxis+to+lysophosphatidylcholine+through+the+G2A+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).</li>
<li>Buul, J. D., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+in+leukocyte+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling in leukocyte transendothelial migration.</a> Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).</li>
<li>Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+promoters+and+polyadenylation+regulate+tissue-specific+expression+of+Hemogen+isoforms+during+hematopoiesis+and+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis.</a> 228 (4), 606-616 (2003).</li>
<li>Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gi-independent+macrophage+chemotaxis+to+lysophosphatidylcholine+via+the+immunoregulatory+GPCR+G2A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A.</a> Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).</li>
<li>Yoshida, M., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis+and+regulation+of+flagellar+movement+by+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+.</a> Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).</li>
<li>Albini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+and+endothelial+cell+invasion+of+basement+membranes.+The+matrigel+chemoinvasion+assay+as+a+tool+for+dissecting+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol.+Oncol.+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms.</a> Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+determinants+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Critical determinants of metastasis.</a> Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).</li>
<li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+mechanistic+insights+and+clinical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).</li>
<li>Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+3D+morphology+and+functions+on+genetically+engineered+mouse+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%22%5BJournal%5D)">Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells.</a> Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).</li>
<li>Junger, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+regulation+of+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).</li>
<li>Lazennec, G., Richmond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+chemokine+receptors%3A+new+insights+into+cancer-related+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation.</a> Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).</li>
<li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J. Biomed. Sci. 17, (2010).</li>
<li>Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-mediated+proteolysis+of+paxillin+negatively+regulates+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration.</a> J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).</li>
<li>Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+microtubules+and+focal+adhesion+dynamics+during+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Celmigratie is een belangrijk aspect voor een studie in kankeronderzoek en het kan ook worden toegepast voor ontwikkeling, immunologische en wondgenezing studies. De celkweek wondsluiting assay en de transwell celmigratie en invasie assays tonen details cel migrerende gedrag en kan worden gebruikt om de moleculaire mechanismen van celmigratie 1,2,10,14 onderzoeken. Onze studie gebruikte deze cel beweeglijkheid assays om de migratie snelheid en invasie mogelijkheden van een B16F10 melanoomcellijn bepalen. ...

Beweeglijkheid is een essentieel kenmerk van levende cellen. Celmigratie wordt betrokken bij het ​​ontwerp van het leven, embryonale ontwikkeling, immuunrespons en vele pathologische processen zoals kanker metastase en ontsteking 1-9. Daarom methoden naar cel trekkende gedrag te bestuderen zijn zeer nuttig research tools voor een breed scala van disciplines in de biomedische wetenschappen, biologie, biotechnologie en aanverwante gebieden. De studie van celmigratie in kankeronderzoek is van bijzonder belang als de belangrijkste doodsoorzaak bij kankerpatiënten is gerelateerd aan metastatische progressie. Om voor kanker door het hele lichaam te verspreiden en te verspreiden, moet kankercellen migreren en bedreigen via extracellulaire matrix (ECM), intravasate in de bloedcirculatie, hechten aan een verre plaats, en uiteindelijk extravaseren naar verre brandpunten 1,10-12 vormen. Verschillende biologische methoden kunnen worden toegepast om deze gebeurtenissen in detail te onderzoeken. De celkweek wond-sluiting eend de transwell migratie en invasie assays worden veel gebruikt in de wetenschappelijke gemeenschap 1,10. Deze tests kunnen de noodzakelijke gegevens die kunnen zorgen voor een goed begrip van hoe goed een bepaald celtype spontaan kunnen migreren of te reageren op een chemo-lokstof en directioneel migreren richting daarin te voorzien. Verschillende trekkende fenotypes beschreven. Cellen kunnen migreren in een enkele cel vorm, zoals te zien in mesenchymale of amoeboid-achtige beweging of door meercellige beweging bestempeld collectieve migratie of mobiele streaming 13. Werkwijze beweging in beweeglijke cellen kunnen gemakkelijk worden waargenomen met de celcultuur wondsluiting assay. Onder de talrijke manieren om celmigratie te bestuderen, de cel wondsluiting assay is een van de eenvoudigste. Deze werkwijze is nuttig om de migratie vermogen van gehele cellen massa bepalen. Wanneer genomen een stap verder kan worden gebruikt om de morfologische kenmerken individuele cel te observeren tijdens de migratie 14. Na de analyse van de wondsluiting vele fenotypes kan worden geopenbaard. Het meten van de gesloten afstand in de tijd bij het vergelijken met een controlegroep kan specifieke migratie verandert of een verminderde trekkende fenotype die voorheen onbekend was onthullen. Bovendien kunnen enkele cel lamellipodium vorming, staart intrekken en gerichte beweging aanwijzingen voor wat kan verminderd of versterkt in de cellen van belang 14 geven. De transwell migratie en invasie assays kunnen worden gebruikt om het vermogen van enkelvoudige cellen tot directioneel reageren op de verschillende chemo-aantrekkende of zij chemokines, groeifactoren, lipiden, of nucleotiden 4,5,8,15,16 analyseren. Het kan ook differentiële vermogen tot migratie te beoordelen als gevolg van de over-expressie van een receptor 1,14. Deze testen kunnen ook worden gebruikt om de belangrijkste regulatoren van celmigratie zoals de Rho familie van kleine GTPases 2 te identificeren en karakteriseren. Na deze korte en gemakkelijk acceslijk proeven en de wijze van celmigratie en het vermogen van een cel binnen te dringen in een 3-D-matrix kan ook worden vastgesteld.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&rsquo;s modified Eagle medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gemini</td><td>100106</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0.25%</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Crystal violet</td><td>Sigma</td><td>C0775-100G</td><td>Opgelost in water bij 0,2%</td></tr><tr><td>Cell disassociation buffer</td><td>Gibco</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3145</td></tr><tr><td>SterilGARD biosafety hood</td><td>The Baker Company, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Model # VBM-600</td></tr><tr><td>EVOS Fl inverted microscope</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # AMF-4302-US</td></tr><tr><td>Tissue culture plate</td><td>Becton Dickinson</td><td>353046</td><td>Catalognummer varieert afhankelijk van het type kweekplaat</td></tr><tr><td>Corning Transwell insert</td><td>Fisher</td><td>07-200-150</td><td>Catalognummer varieert afhankelijk van de poriegrootte van de membraan</td></tr></tbody></table>

in vitro cel-migratie en invasie assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migratieverschijnselen zijn een belangrijk kenmerk van levende cellen en essentieel voor normale ontwikkeling, immuunrespons en ziekteprocessen zoals kankermetastase en ontsteking. Methoden om celmigratie te onderzoeken zijn zeer nuttig en belangrijk voor een breed scala aan biomedisch onderzoek zoals kankerbiologie, immunologie, vasculaire biologie, celbiologie en ontwikkelingsbiologie. Hier gebruiken we tumorcelmigratie en -invasie als voorbeeld en beschrijven twee verwante assays om de meest gebruikte, gemakkelijk toegankelijke methoden te illustreren om deze processen te meten. De eerste methode is de wondsluitingstest in celcultuur waarbij een kras wordt gemaakt op een confluent celmonolayer. De snelheid van wondsluiting en celmigratie kan worden gekwantificeerd door met een regelmatige inversiemicroscoop op verschillende tijdsintervallen momentopnamen te maken. Gedetailleerder celmigratiegedrag kan worden gedocumenteerd met behulp van het time-lapse microscopiesysteem. De tweede methode die in dit artikel wordt beschreven, is de transwell celmigratie- en invasie-assay die het vermogen van celbeweeglijkheid en invasiviteit richting een chemo-attractant gradiënt meet. Het is ons doel om deze methoden op een zeer toegankelijke manier te beschrijven, zodat de procedures met succes kunnen worden uitgevoerd in onderzoekslaboratoria, zelfs alleen met een basisopstelling voor celbiologie.

De wondsluiting assay en de transwell celmigratie test hier gepresenteerd werden uitgevoerd met muizen B16F10 melanoma cellen als modelsysteem. In de wondsluiting test werden B16F10 cellen uitgezaaid in 6-well weefselkweek plaat en gekweekt tot 100% confluentie in 24 uur. Een wond van ongeveer 700 micrometer breed werd gegenereerd met behulp van een pipet en de sluiting van de wond (cel migratie) werd opgenomen met de time-lapse microscopie. Als alternatief kan wondsluiting ook bestudeerd worden door het nemen van momen...

Vaak gebruikt, zijn zeer toegankelijk methoden voor de behandeling van cel migratie en invasie in vitro beschreven. De eerste methode is de cel wondsluiting assay die celmotiliteit meet. De tweede methode is de transwell migratie en invasie assay die de chemotactische en invasieve vermogen van cellen beoordeelt.

In vitro cel-migratie en invasie assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Celmigratie is een zeer dynamisch proces. Het is van belang voor diverse fysiologische functies, zoals een normale embryonale ontwikkeling, de immuunrespons en ziekteprocessen, zoals kankermetastase en inflammatie.De studie van celmigratie is belangrijk voor een breed scala aan biomedische wetenschappen, zoals de kankerbiologie, immunologie, celbiologie en ontwikkelingsbiologie. Celmigratie kan worden onderverdeeld in vier mechanisch afzonderlijke stappen: extensie, vorming van nieuwe adhesies, contractie van het cellichaam en tot slot loslating van de staart. Hier beschrijven we twee eenvoudige methoden om de dynamische aard van celmigratie in vitro zorgvuldig te bestuderen.De eerste methode is een cellulair sluitingsassay. Deze assay wordt veelvuldig gebruikt en is zeer toegankelijk voor laboratoria met de meest basale laboratoriumopstellingen. De cellulair sluitingsassay is een assay waarbij, door middel van een pipetpunt en krassen die worden aangebracht in een confluente monocouche cellen, de confluente cellenmonocouche na verloop van tijd de eerder gemaakte wond zal sluiten.De dynamiek van celmigratie kan in detail worden bestudeerd met behulp van time-lapse fotografie of door middel van momentopnamen. De afstand kan worden gemeten, waarna de snelheid waarmee de cellen bewogen over een bepaalde tijd kan worden berekend. De tweede gerelateerde methode, de transwell-celmigratie- en invasie-assay, is eveneens zeer toegankelijk bij het volgen van het uitplaten van cellen op een transwell-membraan.Ook algemeen bekend als een Boyden-kamer. Hun migratievermogen naar een chemo-attractante gradiënt kan hiermee worden gemeten. Beide zeer toegankelijke experimentele procedures zijn uiterst waardevol in vele onderzoeksgebieden.Hoofdstuk twee, celkweekomgeving, assay. Hallo, mijn naam is Calvin Justice. Ik ben een promovendus in het laboratorium van Dr. Yang van de afdeling Oncologie aan de Brody School of Medicine aan de East Carolina University.Vandaag demonstreer ik twee procedures waarmee de migratie- en invasiecapaciteiten van cellen in vitro werden gemeten. Laten we nu beginnen met de celcultuur-opstelling. Essay De cellen die werden gebruikt in de celcultuur-opstelling.De assay kan worden gekweekt in weefselkweekplaten met behulp van conventionele celkweektechnieken. Begin met het aspireren van het groeimedium dat is gebruikt voor de celkweek, was één keer met PBS, voeg vervolgens twee milliliters 0.25% tripsin EDTA toe aan de plaat en plaats deze drie minuten in de incubator. Haal de plaat uit de incubator en voeg drie milliliters DMM toe, aangevuld met 10% FES.Verwijder het medium uit de plaat en breng dit over in een conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1500 RPMs. Resuspendeer de cellen na centrifugatie in twee milliliters DMM aangevuld met 10%FES.Tel vervolgens de cellen met een hemocytometer. Plaat na het tellen een aantal cellen dat binnen 24 uur confluent zal worden. Plaats de plaat gedurende 24 uur in de incubator om celhechting en spreiding mogelijk te maken.Haal de plaat uit de incubator en bekijk deze onder de microscoop om te controleren of de plaat 100% confluent is. Maak vervolgens in de biosafety cabinet, met een pipetpunt en voorzichtig om de weefkweekplaat niet te beschadigen, een wondstreek van de bovenkant naar de onderkant van het well. Nadat de wond met de pipetpunt is aangebracht, wordt het medium geaspireerd en wordt de plaat voorzichtig gewassen met twee milliliters groeimedium.Gebruik in dit geval DMEM aangevuld met 10% FES om eventueel aanwezige resten weg te spoelen en aspireer vervolgens opnieuw het medium. Voeg tot slot twee milliliter groeimedium toe en plaats, indien beschikbaar, de plaat in een temperatuur- en CO2-gecontroleerde kamer onder de microscoop. De opstelling beschikt over een time-lapse fotografiefunctie.De time-lapse-functie is niet beschikbaar. Maak een beginfoto van de markeerlocatie en de well en plaats de plaat in de incubator. Als time-lapse-fotografie wel beschikbaar is, configureer dan de time-lapse-functies op de microscoop.We stellen de time-lapse in op 16 uur. Nadat er gedurende 16 uur elke vijf minuten een foto is genomen, kan de plaat uit de kamer worden gehaald en kunnen de foto's die tijdens het experiment zijn gemaakt, op een flashdrive worden opgeslagen. Sluit de USB-stick aan op de computer en open het Image J-programma.Klik op bestand. Importeer een beeldsequentie. Zoek de beelden die tijdens het experiment zijn genomen.Klik op het eerste bestand en klik op openen. Vervolgens verschijnen de opties voor de reeks. Selecteer de eerste afbeelding in uw fotolijst en voeg de incrementen toe die nodig zijn voor de video.Nu ziet u de opties voor de AVI-reader. Kies de optie die het beste past bij uw experiment en klik erop. Het ImageJ-programma maakt nu een video. Om de video op te slaan, klikt u op 'File', vervolgens 'Save as' en kiest u AVI of een andere optie die geschikt is voor uw experiment.De video kan vervolgens in de celstudie worden geanalyseerd op migratiekenmerken die van belang kunnen zijn. Mogelijke kenmerken die bestudeerd kunnen worden, zijn de extensie van de lamellipodia, contractie van het cellichaam en loslating van de staart. Indien er geen gebruik wordt gemaakt van time-lapsefotografie, kan de plaat die na de eerste foto gedurende 12 tot 16 uur in de incubator is geplaatst, worden verwijderd.Het gebied dat aanvankelijk is gefotografeerd, moet opnieuw worden gefotografeerd en er moet een schaalbalk worden toegevoegd voor verdere metingen. Nadat de initiële breedte van de wond die in de eerste foto is vastgelegd is gemeten, moet de in pixels gemeten breedte worden omgezet in micrometers met behulp van de schaalbalk. Vervolgens moet de wondbreedte in de laatste foto's in pixels worden gemeten in hetzelfde gebied als voorheen, en opnieuw moet dit worden omgezet in micrometers met behulp van de schaalbalk.De laatste stap is het aftrekken van de uiteindelijke breedte van de initiële breedte om de totale breedte te bepalen waarover de wond binnen de toegewezen tijdsperiode is gesloten. De gemeten uiteindelijke migratieafstand moet worden gedeeld door de toegewezen tijd om de sluitingssnelheid in micrometers per uur te verkrijgen. De snapshot-methode kan worden herhaald in talrijke wells met variërende groottes voor een meer kwantitatieve analyse van celmigratie, zie hoofdstuk drie, TransWell Cell Migration and Invasion Assay.Om te beginnen moeten de betreffende cellen eerst worden gekweekt in een weefselkweekplaat voor de procedure. Was daarna één keer met PBS en detachment de betreffende cellen van de weefselkweekplaat met een celdisassociatiebuffer of trypsine. Daarnaast raden we aan de literatuur te raadplegen over hoe trypsine de cellen die u bestudeert kan beïnvloeden, aangezien het gebruik ervan uw resultaten kan beïnvloeden.Na centrifugatie van 1500 RPM gedurende vijf minuten voor loskoppeling, verwijdert u het bestaande medium via aspiratie en resuspendeert u de cellen in 0,1% BSA. Open de verpakking van de Transwell-insert en plaats deze in de well die is ontworpen voor de betreffende maat. Indien u eerst de Transwell-invasieassay uitvoert, voegt u matrigel toe aan de bovenkant van de insert en laat u dit 30 minuten incuberen voordat u doorgaat naar de volgende stap.Pipetteer 100 µL van de celoplossing op het transwell-membraan. Incubeer gedurende 10 minuten om de cellen te laten bezinken. Het aantal uitgeplaatste cellen is afhankelijk van het celtype en vervolgexperimenten kunnen noodzakelijk zijn.Om dit aantal te bepalen, gebruikt u een pipet om het gewenste chemo-attractant voorzichtig onder de insert op de bodem van de well toe te voegen. Probeer de insert niet te verwijderen. De incubatietijd is afhankelijk van het celtype.Verwijder het transwell-inzetstuk na de incubatie en gebruik een wattenstaafje zo vaak als nodig om voorzichtig het overtollige medium en de cellen die niet door het membraan zijn gemigreerd van de bovenkant van het membraan te verwijderen. Wees voorzichtig om het membraan niet te beschadigen. Voeg 600 tot 1000 µL 70% ethanol toe aan de onderste kamer van een lege.Plaats de insert in een well met 70% ethanol en laat dit 10 minuten incuberen om de cellen te fixeren. Gebruik opnieuw een wattenstaafje zo vaak als nodig om de resterende ethanol te verwijderen uit de cellen die niet in het membraan zijn gemigreerd, vanaf de bovenzijde van het membraan. Voeg 600 tot 1000 µL 0,2% Crystal violet toe aan een well en positioneer de insert hierin voor de celkleuring.Incubeer gedurende 10 minuten. Verwijder over het algemeen de overtollige kristalvioletkleurstof van de bovenkant van het membraan. Dompel het membraan vervolgens heel voorzichtig in gedistilleerd water, zo vaak als nodig, om het resterende kristalviolet te verwijderen, waarbij u erop lets dat gemigreerde cellen niet worden weggespoeld.Laat het membraan drogen om de cellen onder een microscoop te kunnen bekijken. Het membraan kan voorzichtig met het scalpel worden verwijderd en op een dekglas worden geplaatst, of u kunt de cellen bekijken terwijl de inserts nog in de well zitten. Met behulp van een omgekeerde microscoop dienen er foto's van verschillende gezichtsvelden te worden gemaakt.Om een goede representatie van het aantal gemigreerde cellen te verkrijgen, kan het aantal cellen worden geteld met de teltool van Adobe Photoshop. De verzamelde gegevens kunnen in een staafdiagram worden geplaatst voor de beste weergave van uw resultaten. Hoofdstuk vier, representatieve resultaten.Vervolgens nemen we u mee door enkele representatieve resultaten van de cellculture-inclosure-assay en de transwell-celmigratie-assay. Twee verwante methoden om celmotiliteit te onderzoeken zoals beschreven in deze video; we beginnen met de cellculture-inclosure-assay. Hier tonen we snapshot-foto's die zijn genomen na 0, 4, 8 en 12 uur.Zoals u kunt zien, kunnen er na het ontstaan van de wond foto's worden gemaakt, waarna de afstand van de wondsluiting in de loop van de tijd kan worden gemeten. We presenteren onze gegevens met behulp van een spreidingsdiagram en bepalen, met de eerder besproken methode, de snelheid van de wondsluiting over de tijd. Bovendien kan de migratie van individuele cellen in detail worden bestudeerd met behulp van time-lapsefotografie.In dit geval zoomen we in op individuele cellen tijdens wondsluiting, volgen we hun migratie in de tijd en observeren we hun beweging. Kenmerken zoals de uitrekking van de voorrand, staartretractie en de algemene beweging kunnen in detail worden onderzocht. We zullen nu enkele resultaten van de transversale celmigratie-assay bespreken. Hier tonen we twee afbeeldingen die van het membraan zijn genomen na afloop van de transwell-celmigratie-assay.De eerste afbeelding toont de resultaten zonder chemoattractant, waarbij er weinig tot geen celmigratie door het membraan plaatsvond. De tweede afbeelding toont de resultaten met chemoattractant, waarbij een toegenomen celmigratie naar het membraan zichtbaar is. Rechts tonen we de kwantificeringsresultaten van ons experiment in een staafdiagram met foutenbalken die de standaardfout vertegenwoordigen.Hoofdstuk vijf, conclusie: de gegevens die zijn verzameld na de cellcultuur-insluitingsassay in de transversale celmigratie- of invasieassay onthullen de migratiecapaciteiten van cellen in een 2D-omgeving of een 3D-omgeving. Deze resultaten kunnen worden vergeleken met andere resultaten om potentieel gegevens aan het licht te brengen die voorheen onbekend waren, en ze kunnen bovendien correleren met andere biochemische tests. Deze twee verwante, veelgebruikte tests zijn waardevol en gemakkelijk toegankelijk voor de meest basisopstellingen van cellbiologische laboratoria.We danken u voor uw deelname vandaag en wensen u veel succes met uw toekomstige wetenschappelijke inspanningen.

in-vitro-cell-migration-and-invasion-assays

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Modellen van de tumorcel invasie in drie-dimensionale extracellulaire matrix beter aansluiten bij...

Modeling and Imaging 3-Dimensionale Collectief Cell Invasion

Dit videoartikel beschrijft een gewijzigde in vitro methode om de rol van hormonen, cytokinen en/of groeifactoren bij het aanjagen van kankercelinvasie te onderzoeken.

Gemodificeerd<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion Assay naar de mogelijke rol van hormonen, cytokines en / of groeifactoren in Bemiddelen Cancer Cell Invasion Bepaal

Deze studie meldt twee verschillende methoden voor de analyse van de invasie van de cel en migratie: de bepaling van Boyden kamer en de in vitro video Microscoop gebaseerde wondgenezing bepaling. De protocollen voor deze twee experimenten worden beschreven, en hun voor- en nadelen worden vergeleken.

Evaluatie van de invasie van de cel en het migratieproces: een vergelijking van de Video Microscoop gebaseerde kras wond Assay en de bepaling van Boyden kamer

Dit protocol beschrijft een omgekeerde verticale invasie-bepaling die kan worden gebruikt om het kwantificeren van de mogelijkheden voor migratie en invasie van cellen in een driedimensionale omgeving met behoud van de cel-communicatie. Deze test is geschikt voor zeldzame en/of gevoelige cellen.

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

Hier presenteren we een protocol om te evalueren van het effect van peptiden op de migratie van bronchiale epitheliale cellen. Deze methode zorgt voor de snelle en zeer reproduceerbaar accumulatie van kwantitatieve gegevens over de snelheid van cel migratie en wond sluiting.

Een roman In Vitro wond genezing Assay om te evalueren van de cel migratie

Hier beschrijven we live-cel beeldvormingstechnieken voor het kwantitatief meten van de migratie en invasie van de cellen van de stam van tumor van de hersenen van glioblastoma na verloop van tijd en onder meerdere behandeling voorwaarden.

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Hier presenteren we een zeer toegankelijke protocol voor de evaluatie van de beweging van de cel in menselijke trofoblast cellen met behulp van drie in-vitrotests: de kras assay, de transwell invasie assay en de cel proliferatie assay.

In Vitro testen om te evalueren van de migratie, invasie en proliferatie van vereeuwigd menselijke eerste-trimester Trophoblast cellijnen

Het huidige protocol beschrijft een geïntegreerde methode onderzoek naar kanker cel migratie en invasie op één platform in real-time, het verstrekken van een gemakkelijk reproduceerbaar zijn en tijd-efficiënte optie te bestuderen van de cel mobiliteit en morfologie.

Een eenvoudige migratie/invasie Workflow met behulp van een geautomatiseerde Live-cel Imager

De in vitro Cell Invasion assay wordt gebruikt om het potentieel van kanker metastasen te meten door het cellulaire potentieel voor invasie en migratie te kwantificeren met behulp van celkweek inserts met eiwit matrix. Cellen worden uitgedaagd om te migreren door de eiwit matrix en een poreus membraan, naar een chemoaantretant, en vervolgens gekwantificeerd door lichte microscopie.

Het gebruik van muizen-borstkanker tumor cellen in een in vitro invasie assay als een maat voor oncogene Celgedrag

Veel opgereguleerde genen stimuleren de migratie en invasie van tumorcellen, wat leidt tot een slechte prognose. Het is van cruciaal belang om te bepalen welke genen de migratie en invasie van tumorcellen reguleren. Dit protocol presenteert een methode om de effecten van de verhoogde expressie van een gen op de migratie en invasie van tumorcellen in realtime te onderzoeken.

Real-time kwantitatieve meting van tumorcelmigratie en -invasie na synthetische mRNA-transfectie

Dit protocol biedt een methode voor primaire muizen T-celisolatie en time-lapse-microscopie van T-celmigratie onder specifieke omgevingsomstandigheden met kwantitatieve analyse.

Real-time in-vitromigratietest voor primaire muizen CD8+ T-cellen

Leer celmigratie- en invasieassays in vitro voor kankerbiologie en immunologie. Deze methoden met wondsluiting en transwell helpen onderzoekers celmotiliteit gedetailleerd bestuderen.

In vitro cel-migratie en invasie assays

Meer video's verkennen