Een methode om de impact van chemisch-geïnduceerde ovarieel falen op de inspanningscapaciteit en Cardiac Aanpassing studie bij muizen

Het algemene doel van deze procedure is om het natuurlijke proces van folliculaire atresie in de eierstokken te versnellen, wat resulteert in ovarieel falen, uitputting van oestrogeen en een niet-cyclusvrouw, een toestand die de menopauze nauwgezet nabootst. Dit wordt bereikt door eerst gedurende 15 tot 20 opeenvolgende dagen het beroepschemische middel vinylcyclooltweedioxide of VCD toe te dienen, waarvan is aangetoond dat het specifiek kleine primaire en primordiale ovariële follikels target en vernietigt door hun natuurlijke proces van atresie te versnellen. De tweede stap is het bepalen van de oestruscyclus en de ovariële cycliciteit via vaginale cytologie, beginnend ongeveer zes weken na de start van de VCD-injecties.

Om het verlies van de cyclus en ovarieel falen te bevestigen, moet via vaginale cytologie gedurende 15 tot 20 dagen aanhoudende dste of een afwezigheid van de cyclus worden vastgesteld. De laatste stap is het implementeren van een interventie die beïnvloed kan worden door de menopauze of de overgang naar de menopauze, zoals vrijwillige lichaamsbeweging in een kooiwiel en cardiale adaptatie. Uiteindelijk worden de vrijwillige kooiwielactiviteit en de cardiale adaptatie gebruikt om aan te tonen of de menopauze de kooiwielactiviteit vermindert.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals ectomie, is dat ectomie een chirurgische procedure is die leidt tot een plotselinge uitputting van oestrogeen, wat verschilt van het natuurlijke progressieve verlies van oestrogeen dat optreedt tijdens de overgang van de premenopauzale naar de postmenopauzale fase. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van metabole en cardiovasculaire aandoeningen bij postmenopauzale vrouwen, aangezien postmenopauzale vrouwen in vergelijking met premenopauzale vrouwen bijzonder vatbaarder zijn voor het metabool syndroom en de daarmee gepaard gaande comorbiditeiten, waaronder cardiovasculaire aandoeningen. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, omdat de stappen voor vaginale cytologie moeilijk aan te leren zijn; er moet namelijk zorgvuldig worden gewerkt om de juiste uitstrijktechniek toe te passen en de EST-cyclus correct te identificeren.

Vinylcyclioldioxide of VCD wordt bewaard bij -20 °C. Om VCD voor het injectieprotocol voor te bereiden, voegt u 0,87 ml VCD toe aan een schoon doseerflesje en vult u het uiteindelijke volume aan tot 10 ml met sesamolie; sluit het flesje af met een rubberen stop en meng door voorzichtig om te keren. Bewaar gedurende maximaal zeven dagen bij 4 °C.

Om het VCD-injectieprotocol te starten, weegt u twee muizen van twee maanden oud gedurende 20 opeenvolgende dagen en dient u dagelijks intraperitoneale injecties van VCD op kamertemperatuur toe in een dosis van 160 milligrams per kilogram, waarbij tijdens de injectieperiode een naald van 27 gauge wordt gebruikt. Probeer de injectieplaatsen af te wisselen om de kans op lokale infecties op een vergelijkbare manier te verkleinen. Injecteer controlemuizen met de vehikeloplossing sesamolie in een volume van 2,5 milliliters per kilogram nadat de injectieperiode is voltooid.

Controleer de estruscyclus dagelijks door vaginale uitstrijkingen te verkrijgen. Een van de cruciale factoren voor het succes van deze studie is het verkrijgen van vaginale uitstrijkingen van hoge kwaliteit voor cytologische bepaling. Fixeer de muizen met de dorsum scruff-methode.

Voer een oogdruppelaar met 0,2 milliliters steriele zoutoplossing in de vaginale opening in tot een diepte van 0,5 centimeters. Meng de geïnjecteerde zoutoplossing drie keer met de oogdruppelaar en plaats vervolgens één druppel op een objectglas. Evalueer elk monster onmiddellijk microscopisch met een standaard lichtmicroscoop bij een vergroting van 100 x om ovarieel falen vast te stellen.

Vervolgens worden de door VCD geïnduceerde menopauzale muizen gebruikt voor de bewegingsexperimenten. De kooiwielapparatuur bestaat uit een wiel met een diameter van 11,5 centimeter en een 5 centimeter breed loopoppervlak, uitgerust met een digitale magnetische teller die wordt geactiveerd door de rotatie van het wiel. Kalibreer vóór elke loopsessie het kooiwiel volgens de richtlijnen van de fabrikant.

Meet de binnendiameter van het loopwiel. Bereken de omtrek en voer deze waarde in de digitale teller in als wielgrootte. Om het wiel aan de kooi te bevestigen, schuift u het wiel door het bovenste draadwerk van de dierenkooi.

Bevestig het loopradstatief aan het gaas van de kooi met binder clips. De clips moeten aan de bovenkant van het gaas worden geplaatst, uit de buurt van het dier. Leid het computergedeelte en eventuele overtollige kabels door het gaas van de kooi.

Plaats de computer en de overtollige kabel buiten het bereik van het dier. Dit kan worden gedaan door een middelgrote plastic weegschaalschaal bovenop de bedrading van de kooi te plaatsen om de computer en de overtollige kabel vast te houden. Bevestig vervolgens het computergedeelte van de digitale magnetische teller aan het wielstatief.

Bevestig met ducttape de losse magneet van de digitale magnetische teller aan de centrale stang, aan dezelfde zijde als de magneetkabel naar de computer. Gebruik opnieuw voldoende tape om de magneet te beschermen tegen kauwschade. De magneet moet zodanig worden gepositioneerd dat elke omwenteling van het wiel door de computer wordt geregistreerd, zonder enige interferentie of weerstand die de volledige rotatie van het wiel belemmert.

Bevestig het looprad aan het wiel. Plaats de standaard door de steunpalen van de wielstandaard in de montagegaten van de centrale stangen van het wiel te steken. Zorg ervoor dat het wiel vrij kan draaien.

De opstelling moet dagelijks worden gecontroleerd op kauwschade en indien nodig worden gerepareerd voor het experiment. Intelfokte zeven maanden oude C 57, black six en B six C3 F1 vrouwelijke muizen uit eenzelfde nest worden willekeurig toegewezen aan het bewegingsregime of de sedentaire controlegroep. De experimentele dieren worden individueel gehuisvest in een kooi van 47 bij 26 bij 14,5 centimeter met ongehinderde toegang tot een loopwiel gedurende 28 dagen; controledieren worden samen gehuisvest in een kooi zonder wiel.

Voorzie alle dieren van water en standaard hard knaagdiervoer. Voeg lido toe en noteer dagelijks handmatig de waarden voor de afgelegde afstand en de totale looptijd zoals aangegeven door de magnetische teller. Registreer de afstand- en tijdwaarden elke dag binnen hetzelfde tijdsvak van één uur voor nauwkeurige en consistente waarden gedurende de 28 dagen van de oefenperiode. Reset na elke dagelijkse registratie de magnetische teller om nauwkeurige metingen op de volgende dag te waarborgen.

Aan het einde van de specifieke oefenperiode worden de lichaamsgewichten van de geëuthanaseerde dieren genoteerd voorafgaand aan de weefselafname. Om het hart bloot te leggen, wordt een mediale incisie gemaakt aan de ventrale zijde, waarna het diafragma wordt geopend om het hart snel te visualiseren. Exciteer het hart aan de basis en plaats het in koud fosfaatgebufferde zoutoplossing om resterend ventriculair bloed voldoende uit te spoelen. Verwijder overtollig weefsel van het hart, weeg het gehele hart en vries het indien gewenst direct in in vloeibare stikstof.

Verzamel aanvullende weefselmonsters, was deze met een gemodificeerde ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing en vries ze direct in met isopentaan gekoeld in vloeibare stikstof. In deze studie werd ovarieel falen geïnduceerd door behandeling met VCD en bevestigd door microscopisch onderzoek van vaginale uitstrijkjes. De fase in de estruscyclus wordt bepaald door de proportie epitheelcellen, gekwantificeerde epitheelcellen en leukocyten; in PROE's overheersen de gekernde epitheelcellen.

Hier geven de pijlen genucleerde cellen aan; tijdens de oestrus zijn de cellen voornamelijk ongenucleerde, gekwantificeerde plaveiselepitheelcellen. De metrus wordt gekenmerkt door een mix van celtypen met een overwicht aan leukocyten. De diestrus wordt gedomineerd door leukocyten.

De oestruscyclus bij muizen duurt doorgaans vier dagen vóór de VCD-injectie. Dieren werden als acylisch beschouwd na 15 dagen aanhoudend diestrus. Deze figuur toont de gemiddelde lengte in dagen van de oestruscyclus van de vehikelgroep en de VCD-geïnjecteerde groepen.

Eén cyclus wordt gemeten vanaf de eerste dag van de oestrus (ES) tot de eerste dag van de volgende periode. In ES begon de vaginale cytologie ongeveer zes weken na het begin van de injecties. Er werd waargenomen dat de ESTRO-cycli van de met VCD geïnjecteerde dieren onregelmatig werden in vergelijking met de met vehicle geïnjecteerde dieren; na 12 estro-cycli wees de cytologie van alle VCD-geïnjecteerde dieren aan het einde van het VCD-injectieprotocol niet langer op cycli. H&E-kleuring van dwarsdoorsneden van eierstukweefsel onthulde significante atrofie in het met VCD behandelde eierstukweefsel in vergelijking met de controles.

Bij observatie onder een vergroting van 20x en 200x werd een volledige uitputting van primaire en primordiale follikels waargenomen in het met VCD behandelde weefsel. In tegenstelling tot het met vehicle behandelde weefsel, werd het effect van VCD-geïnduceerd ovarieel falen op de fysieke prestaties getest bij zeven maanden oude VCD- en vehicle-behandelde muizen van twee stammen; de dagelijkse waarden voor het looprad in de kooi werden geregistreerd voor tijd en afstand voor elk bewegend dier gedurende een trainingsperiode van vier weken. Deze figuur toont de wekelijkse gemiddelden van de dagelijkse loopwaarden voor afstand, tijd en snelheid.

Voor C 57, black six muizen behandeld met ofwel het vehikel of VCD, werden geen significante verschillen waargenomen in de inspanningsprestaties, gemeten aan de hand van de gemiddelde dagelijkse loopafstand en de tijd doorgebracht op het wiel, tussen de VCD- en vehikelbehandelde groepen in zowel de C 57, black six als de B six C3 F1 muizenstam. Dit geeft aan dat de impact van VCD-geïnduceerd eierstokfalen op vrijwillige kooiwielbeweging overstijgt naar minstens twee muizenstammen na de duur van het protocol voor vrijwillige kooioefening. De lichaamsmorphometrie werd geregistreerd en de harten werden snel uitgesneden en gewogen, in overeenstemming met eerdere waarnemingen.

Er werd harthypertrofie waargenomen als reactie op het gebruik van een looprad in de kooi, gemeten aan de hand van het absolute hartgewicht en het hartgewicht genormaliseerd naar de scheenlengte. Hoewel de absolute hartmassa en de ratio van hartgewicht ten opzichte van de scheenlengte significant hoger waren bij met vehicle en VCD behandelde muizen in vergelijking met hun sedentaire tegenhangers, waren er geen meetbare verschillen in harthypertrofie tussen de controlegroep en de groep met VCD-geïnduceerd eierstokfalen. Na de vrijwillige oefening op het looprad in de kooi werden de met VCD en vehicle behandelde muizen uiteindelijk onderworpen aan geforceerd lopen op een loopband om zowel de capaciteit voor intensieve als minder intensieve lichaamsbeweging te bepalen.

In het protocol met hoge intensiteit werd de gemiddelde bandsnelheid elke 10 minuten stapsgewijs verhoogd totdat de muizen tekenen van uitputting vertoonden. Gemiddeld was de maximale snelheid van de met vehicle behandelde muizen 26,7 plus of min 0,95 meters per minuut, en de maximale snelheid van de met VCD behandelde muizen was 28 plus of min 1,4 meters per minuut vóór uitputting. Lopen met een lagere intensiteit bij 20 meters per minuut werd gebruikt om de uithoudingscapaciteit te bepalen.

Gemiddeld was de maximale tijd van de met vehicle behandelde muizen 28,3 plus of min 1,3 minuten, en de maximale tijd van de met VCD behandelde muizen 29,7 plus of min 1,4 minuten vóór uitputting. Er werden geen significante verschillen in inspanningscapaciteit bij hoge of lage intensiteit gevonden tussen de vehicle- en VCD-behandelde groepen, wat aangeeft dat VCD-geïnduceerd ovarieel falen geen effect had op de inspanningscapaciteit van de muizen. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in de cellulaire, moleculaire en fysiologische wetenschappen om de rol van de menopauze bij knaagdieren te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de juiste VCD-injecties uitvoert, de vaginale cytologie verricht en een fysiologische interventie implementeert.