Name: Reverse Gist Twee-hybride systeem voor het identificeren van zoogdieren Nuclear Receptor Residuen die interageren met liganden en / of antagonisten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-15T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Leer een yeast two-hybrid assay om interacties tussen PXR en ketoconazole te identificeren. Deze methode detecteert mutaties die resistentie tegen het antagonist veroorzaken en helpt bij het begrijpen van nucleaire receptor-ligand dynamica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies CA127231 en The Damon Runyon Stichting Clinical Investigator Award (CI 1502) (SM). Wij willen professor Zdenek Dvorak bedanken van Palacky Universiteit Olomouc, Tsjechië voor zijn nuttige inzichten in de bespreking van de overdraagbaarheid van deze techniek om hun instelling en standaardisatie van het protocol.

1. Bouw van PXR en SRC-1 Fusies in gistvectoren <ol><li> PCR-amplificatie van Human PXR LBD (107-434 aminozuren) en Human SRC-1 volledige lengte (1-1401 aminozuren). <ol><li> Gebruik pSG5-hPXR plasmide 8 als PXR LBD sjabloon, gebruiken pCMX-SRC1 plasmide als SRC-1-sjablonen. </li><li> Dooi PCR SuperMix, DNA templates en primers (zie materialen), bewaar ze op ijs. </li><li> Voeg 0,25 ug / ul DNA-matrijs 1 ui, 10 mM primerparen 2 pi elk PCR Supermix 45 ui en voeg H2O aan totale volume op 50 ui te brengen. </li><li> Stel PCR bij een cyclus van 94 ° C gedurende 2 min, 20 cycli van 94 ° C gedurende 30 seconden, 55 ° C gedurende 30 seconden en 72 ° C gedurende 2 minuten, daarna een cyclus van 72 ° C gedurende 10 minuten tot verlenging. Controleer PCR producten door lopen op 1% agarosegel. </li></ol></li><li> PCR producten klonering in Y2H vectoren. <ol><li> Zuiver PCR producten van 1% agarosegel. Digest PXR, LBD, PCR, en Y2H vector pSH2-1 metBamHI en Sali; verteren SRC-1 PCR en Y2H vector pGADNOT met NotΙ en SalΙ. Hiertoe voeg 1 ug DNA, 3 pl 10x reactiebuffer, 1 ui restrictie-enzymen, en tenslotte H2O aan totale volume op 30 ui te brengen. </li><li> Zet digestie monsters 37 ° C waterbad gedurende 1 uur. Controleer digestie door het uitvoeren op 1% agarosegel. </li><li> Zuiver digestie monsters van 1% agarosegel ligeren gedigereerde PCR-producten en Y2H vectoren en te transformeren om DH5a competente cellen. </li><li> Kies de koloniën en isoleren het plasmide DNA. </li></ol></li><li> Identificeer pSH2-1-PXR plasmide-DNA met BamHI / SalI digestie, identificeren pGADNOT-SRC-1 plasmide DNA door NotI / SalI digestie. Controleer of alle positieve plasmide-DNA door sequencing. </li></ol> 2. Gist twee-hybride assays <ol><li> Inoculeren de giststam in 5 ml YPAD en incubeer gedurende de nacht door constant roeren (220 tpm bij 30 ° C). Opmerking: De Saccharomyces cerevisiae stam was CTY10-5d(Mat A ade2 trp 1-901 leu2-3, 112 his3-200 ga l4 - GAL80 - URA3 :: lexA-lacZ) dat een geïntegreerde GAL1-lacZ gen met lexA operator 10 bevat. Om levensvatbare gistcellen resistent ketoconazol verkrijgen, maar die niet transporter veranderingen heeft dragen als een oorzaak van azoolresistentie 18-20, nieuwe stammen van CTY10-5d gist werden verkregen door eerst verwijderen ERG3 (erg3 Δ) en invoering van aanvullende deletie in ERG11 (erg3 Δ / ERG11 Δ) genen door homologe recombinatie. De constructie details zijn beschreven in een eerder gepubliceerde manuscript 6. </li><li> De volgende dag (&#39;s morgens), inoculeren gist (01:20) in 5 ml YAPD en incubeer een OD 600 ~ 0,2 verkrijgen door constant roeren (220 rpm bij 30 ° C). </li><li> Pellet de cellen bij 2000 rpm in een microcentrifuge gedurende 2 min en de bovenstaande vloeistof. Was daarna de pellet tweemaal met geautoclaveerd water en een keer met 0,1 M LiAc. </li><li> Na de laatste wasbeurt, gooi supernatant en voeg de volgende reagentia aan de celpellet: 240 pl PEG 3500 50% w / v, 36 gl 1 M LiAc, 50 ui 2 mg / ml gekookt zalmsperma ssDNA, H2O 34 pl. Vortex te mengen, voeg 1 ug PSH-PXR en 1 ug pGADNOT-SRC-1 DNA en meng. </li><li> Breng het mengsel op rondbodem polystyreen buizen, schud de transformatie mengen (220 rpm bij 30 ° C) gedurende 30 minuten. Zet de buis tot 42 ° C waterbad en incubeer gedurende 30 minuten. </li><li> Centrifugeer de buis bij 2000 rpm gedurende 2 minuten en verwijder het supernatant. Was de pellet een keer met geautoclaveerd water. </li><li> Pipetteer 100 ul steriel water in de buis, resuspendeer de cellen door zachte vinger te tikken en pipetteren, dan plaat op platen van -His/-Leu Dropout Medium (Formulering per een liter -His/-Leu Dropout Medium: 20 g dextrose, 1,7 g YNB, 0,67 g CSM-His/-Leu, 5 g ammoniumsulfaat, 1,5% agar) en meerderUbate bij 30 ° C gedurende 3-4 dagen om transformanten te isoleren. </li></ol> 3. X-gal Filter Assay <ol><li> Knip nitrocellulosemembraan de grootte van een deel van een petrischaal. Label de nitrocellulosemembraan om de oriëntatie te markeren. </li><li> Plaats voorgemarkeerde nitrocellulose membraan op gistkolonies, zorg ervoor dat het membraan in contact is met het oppervlak van de plaat medium. </li><li> Verwijder het membraan, plaats het kolonie kant naar boven op een 3 mm filtreerpapier en plaats het membraan en filtreerpapier bij -80 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Zorg X-gal oplossing. Voeg 50 ul 20 mg / ml X-gal en 15 ul β-mercapto-ethanol tot 5 ml Z-buffer (1 L buffer bevat 16,1 g Na 2 HPO 4 7H 2 O, 5,5 g NaH 2 PO 4 H2O, 0,75 g KCl, 0,25 g MgSO4 • 7H 2 O). Als Z buffer bij 4 ° C werd gehouden, breng het op kamertemperatuur voor het toevoegen van deze reagentia. </li><li> Plaats twee cirkels van 3 mm filterpapierin een petrischaal en week ze met 5 ml X-gal oplossing. Afvoer overtollige buffer van de petrischaal en plaats de nitrocellulose membraan met de kolonie kant naar boven. </li><li> Sluit het deksel, ervoor zorgen dat het membraan is het maken volledig contact met de filter papier en het is helemaal nat. Wikkel de petrischaal in folie en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten tot overnacht. </li></ol> 4. Vloeibare β-gal Assay <ol><li> Groeien Gist in -His/-Leu Dropout vloeibaar medium om OD 600 0.7. </li><li> Breng 1 ml medium in een 1,5 ml microcentrifugebuis en centrifugeer bij 3000 rpm gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant. </li><li> Voeg 1 ml buffer Z om de pellet te resuspenderen centrifuge bij 3000 rpm nogmaals 2 minuten. Verwijder het supernatant. </li><li> Voeg 150 pi van Z buffer met 2ME de celpellet opnieuw in suspensie, meng voeg 50 pl chloroform en 20 ul 0,1% SDS. Krachtdadig vortex het monster gedurende 15 sec. </li><li> Voeg 700 ul ONPG-oplossing (1 mg / ml in Z buffer). Stel de timer, incubeer bij 30 ° C toereikend is om de gele kleur aan totale reactietijd ontwikkelen en toelichting. </li><li> Voeg 500 ul van 1 M Na 2 CO 3 om de reactie te stoppen en bepalen de absorptie bij 420 nm. De blank is 700 pi ONPG oplossing plus 500 ul 1 M Na 2 CO 3. </li></ol> Bereken Miller Units als volgt: Miller Units = (A420 * 1000) / (A600 * min * ml) A420: absorptie-eenheden bij 420 nanometer; A600: absorptie-eenheden bij 600 nanometer, min: de reactietijd in minuten, ml: de reactie volume in ml

<ol><li>Kliewer, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orphan+nuclear+receptor+activated+by+pregnanes+defines+a+novel+steroid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway.</a> Cell. 92 (1), 73-82 (1998).</li>
<li>Blumberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+steroid+and+xenobiotic-sensing+nuclear+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor.</a> Genes Dev. 12 (20), 3195-3205 (1998).</li>
<li>Biswas, A., Mani, S., Redinbo, M. R., Krasowski, M. D., Li, H., Ekins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+%27Jekyll+and+Hyde%27+Nature+of+PXR%3A+The+Case+for+Discovering+Antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Elucidating the 'Jekyll and Hyde' Nature of PXR: The Case for Discovering Antagonists.</a> Pharm. Res. 26 (8), 1807-1815 (2009).</li>
<li>Pondugula, S. R., Mani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnane+xenobiotic+receptor+in+cancer+pathogenesis+and+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Pregnane xenobiotic receptor in cancer pathogenesis and therapeutic response.</a> Cancer Lett. 328 (1), 1-9 (2013).</li>
<li>Mani, S., Dou, V., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PXR+antagonists+and+implications+for+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab.+Rev%22%5BJournal%5D)">PXR antagonists and implications for drug metabolism.</a> Drug Metab. Rev. 45 (1), 60-72 (2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Yeast-Based+Strategy+Unveils+Antagonist+Binding+Regions+on+the+Nuclear+Xenobiotic+Receptor+PXR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel Yeast-Based Strategy Unveils Antagonist Binding Regions on the Nuclear Xenobiotic Receptor PXR.</a> J. Biol. Chem. 288 (19), 13655-13668 (2013).</li>
<li>Hollenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+family+of+tissue-specific+basic+helix-loop-helix+proteins+with+a+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system.</a> Mol. Cell. Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).</li>
<li>Vojtek, A. B., Hollenberg, S. M., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Ras+interacts+directly+with+the+serine%2Fthreonine+kinase+Raf%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf.</a> Cell. 74 (1), 205-214 (1993).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phytoestrogen+coumestrol+is+a+naturally+occurring+antagonist+of+the+human+pregnane+X+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The phytoestrogen coumestrol is a naturally occurring antagonist of the human pregnane X receptor.</a> Mol. Endocrinol. 22 (4), 838-857 (2008).</li>
<li>Kalpana, G. V., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+homomeric+interactions+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+using+the+yeast+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of homomeric interactions of human immunodeficiency virus type 1 integrase using the yeast two-hybrid system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (22), 10593-10597 (1993).</li>
<li>Hamdi, A., Colas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+two-hybrid+methods+and+their+applications+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22TiPS%22%5BJournal%5D)">Yeast two-hybrid methods and their applications in drug discovery.</a> TiPS. 33 (2), 109-118 (2012).</li>
<li>Battesti, A., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+two-hybrid+system+based+on+adenylate+cyclase+reconstitution+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The bacterial two-hybrid system based on adenylate cyclase reconstitution in Escherichia coli.</a> Methods. 58 (4), 325-334 (2012).</li>
<li>Caufield, J. H., Sakhawalkar, N., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+and+optimization+of+yeast+two-hybrid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A comparison and optimization of yeast two-hybrid systems.</a> Methods. 58 (4), 317-324 (2012).</li>
<li>Albers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+yeast+two-hybrid+screening+for+nuclear+receptor-interacting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Automated yeast two-hybrid screening for nuclear receptor-interacting proteins.</a> Mol. Cell Proteomics. 4 (2), 205-213 (2005).</li>
<li>Takeshita, A., Taguchi, M., Koibuchi, N., Ozawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+role+of+the+orphan+nuclear+receptor+SXR+%28steroid+and+xenobiotic+receptor%29+in+the+mechanism+of+CYP3A4+inhibition+by+xenobiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Putative role of the orphan nuclear receptor SXR (steroid and xenobiotic receptor) in the mechanism of CYP3A4 inhibition by xenobiotics.</a> J. Biol. Chem. 277 (36), 32453-32458 (2002).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+drug+metabolism+by+blocking+the+activation+of+nuclear+receptors+by+ketoconazole%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Inhibition of drug metabolism by blocking the activation of nuclear receptors by ketoconazole.</a> Oncogene. 26 (2), 258-268 (2007).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+pregnenolone+X-+receptor+is+a+target+for+ketoconazole+and+Its+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Activated pregnenolone X- receptor is a target for ketoconazole and Its analogs.</a> Clin. Cancer Res. 13 (8), 2488-2495 (2007).</li>
<li>Ghannoum, M. A., Rice, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+agents%3A+mode+of+action%2C+mechanisms+of+resistance%2C+and+correlation+of+these+mechanisms+with+bacterial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance.</a> Clin. Microbiol. Rev. 12 (4), 501-517 (1999).</li>
<li>Kaur, R., Bachhawat, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+multidrug+resistance+pump%2C+Pdr5p%2C+confers+reduced+drug+resistance+in+erg+mutants+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The yeast multidrug resistance pump, Pdr5p, confers reduced drug resistance in erg mutants of Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology. 145, 809-818 (1999).</li>
<li>White, T. C., Marr, K. A., Bowden, R. A., cellular, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical%2C+cellular%2C+and+molecular+factors+that+contribute+to+antifungal+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance.</a> Clin. Microbiol. Rev. 11 (2), 382-402 (1998).</li>
<li>Serebriiskii, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+peptides%2C+proteins%2C+and+drugs+that+selectively+interact+with+protein+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of peptides, proteins, and drugs that selectively interact with protein targets.</a> Genome Res. 12, 1785-1791 (2002).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+PELP1+in+nonandrogenic+activation+of+the+androgen+receptor+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Central role for PELP1 in nonandrogenic activation of the androgen receptor in prostate cancer.</a> Mol Endocrinol. 26 (4), 550-561 (2012).</li>
<li>Zhan, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+Nur77+regulates+LKB1+localization+and+activates+AMPK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor Nur77 regulates LKB1 localization and activates AMPK.</a> Nat Chem Biol. 8 (11), 897-904 (2012).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In onze gewijzigde Y2H test, hebben we belangrijke residuen voor ketoconazol interacties op PXR 6 geïdentificeerd. Omdat SRC-1 een coactivator (en werd gekloneerd in de vector pGADNot), hebben we ook getest of SRC-1 lacZ expressie kan activeren wanneer gekloneerd in de PSH vectorsysteem en of de activatie profiel zou veranderen en / of beïnvloeden van leakiness de gist two-hybrid. Met onze vernieuwde plasmiden voerden we twee-hybride assays erg3 Δ / ERG11 Δ gist. Zoals wordt aangetoond dat l...

De gist twee-hybride (Y2H) test wordt veel gebruikt om eiwit-eiwit interacties ontdekken en meer onlangs voor ontdekking van nieuwe kleine moleculen die eiwit-eiwit interactie complexen 7, 8, 9, 10, 11 verstoren. De conventionele benaderingen van deze test gebruikt voor drug discovery of &quot;hits&quot;, niet mogelijk voor de detectie van allosterische interactie residuen van chemische verbindingen in eiwit-eiwit oppervlak, dat bij nog veranderde interactie en zorgen voor ondervraging van de veranderde residuen 11 . Immers, een dergelijke methode (n), indien mogelijk ontwikkelen, zou een handelbaar gist voor hoge doorvoer beoordeling van allosterische interactie residuen essentieel voor eiwit-eiwit interactie verstoring mogelijk. In het kader van het geneesmiddelenonderzoek, zou de meest directe manier om wisselwerking van verbindingen vast eiwitten structuurbepaling (bv. kristallisatie eiwit-remmer complex) omvatten. Deze methoden zijn cumbersome, gebruik uitgebreide middelen en het technisch niet haalbaar is om structurele studies van elk eiwit uit te voeren. Tractable genetische drug screening systemen zijn in bacteriën 1, 2 en andere modelsystemen zoals zoogdier twee-hybride vastgesteld. Echter, deze systemen moeten optimalisatie en alternatieve systemen zoals Y2H zijn nog steeds de meest getest in drug discovery. Er zijn beperkingen die slechte gevoeligheid en betrouwbaarheid van interacties met bijzondere werkwijzen 13 omvatten echter een Y2H test kan worden aangepast aan specifieke vragen over interactie residuen beantwoorden. Op het gebied van nucleaire receptor onderzoek is Y2H gebruikt om interagerende eiwitten 14 definiëren, maar deze eiwitinteracties zelden gebruikt om de natuur waarin liganden / antagonisten interageren met nucleaire receptor-eiwitcomplexen definiëren. Aldus ons laboratorium gericht op pogingen het definiëren van een werkwijze, vooral voor receptoreiwitten die nietgemakkelijk vatbaar voor gebaseerde methoden proteomics, dat zou nieuwe ligand / antagonist interactie resten behulp van een omgekeerde Y2H gebaseerd discovery platform ontgraven. Op basis van onze eerdere bevinding dat ketoconazol verstoort PXR en de activator SRC-1, ontwikkelden we een nieuwe reverse Y2H systeem dat ons in staat stellen om ketoconazol interactie resten te definiëren en te ondervragen op PXR 6. Onze methode is gebaseerd op de eigenschappen van de gist GAL4 eiwit dat bestaat uit scheidbare domeinen die verantwoordelijk zijn voor DNA-binding en transcriptionele activatie. De PXR LBD proteïne wordt uitgedrukt als een fusie met het LexA DNA-bindingsdomein (DNA-BD), terwijl de volledige lengte co-activatoren SRC-1 (steroïdereceptor coactivator 1) zijn proteïnen tot expressie als fusies aan het GAL4 activeringsdomein (AD ). Interactie tussen PXR en SRC-1 fusie-eiwitten leidt tot de transcriptionele activering van GAL4-bindingsplaatsen bevattend reportergen β-Lac Z die is geïntegreerd in de gist genome. Ketoconazol, een PXR antagonist, verstoort PXR en SRC-1 interactie 15, 16, 17 en kunnen we de interactie van PXR detecteren en SRC-1 bij aanwezigheid of afwezigheid van ketoconazol na kleuren kolonies op filters voor X-gal activiteit. Het principe van Y2H wordt geïllustreerd in figuur 1 en de experimentele procedure wordt samengevat in figuur 2.

<table><tbody><tr><td>Giststam CTY10-5d erg3&Delta;/erg11&Delta;</td><td>Ons lab</td><td></td><td>Giststam CTY10-5d was dubbel uitgeschakeld ERG3 en ERG11 (erg3&Delta;/erg11&Delta;) genen6 .</td></tr><tr><td>YPD-groeimedium</td><td>BD Biosciences</td><td>630409</td><td></td></tr><tr><td>Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) zonder aminozuren en ammoniumsulfaat</td><td>BD Biosciences</td><td>233520</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>CSM-His/-Leu Complete Supplement Mixture</td><td>MP Biomedicals</td><td>4250-412</td><td></td></tr><tr><td>ONPG (o-Nitrofenyl &Beta;-D- Galactopyranosid).</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth (LB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Fisher</td><td>BP-1615</td><td></td></tr><tr><td>Gesonikerd zalmsperma-DNA gekookt (10 mg/ml)</td><td>Life Technology</td><td>156-017</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Acros Organics</td><td>61177</td><td></td></tr><tr><td>Ketoconazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1003</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide</td><td>Acros Organics</td><td>326871000</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumacetaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>50% PEG-3350 oplossing, filtergesteriliseerde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose Membraan</td><td>Whatman</td><td>10402091</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri-schaal</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3'</td><td>onze lab</td><td></td><td>PXR LBD voorwaarts primer voor pSH2-1</td></tr><tr><td>5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'</td><td>onze lab</td><td></td><td>PXR LBD omgekeerde primer voor pSH2-1</td></tr><tr><td>5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3'</td><td>onze lab</td><td></td><td>SRC-1 voorwaartse primer voor pGADNOT</td></tr><tr><td>5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'</td><td>onze lab</td><td></td><td>SRC-1 omgekeerde primer voor pGADNOT</td></tr><tr><td>Platinum PCR Supermix</td><td>Invitrogen</td><td>11306-016</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>onze lab</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>onze lab</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>onze lab</td><td>R0189</td><td></td></tr></tbody></table>

reverse gist twee-hybride systeem voor het identificeren van zoogdieren nuclear receptor residuen die interageren met liganden en / of antagonisten

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

Als een kritische regulator van metabolisme en ontsteking, pregnaan X receptor (PXR), speelt een belangrijke rol bij de ziekte pathofysiologie koppelen metabolisme en ontsteking (bijvoorbeeld hepatische steatose) 1,2. Er is veel vooruitgang geboekt in het identificeren van agonist liganden voor PXR, echter, zijn er weinig beschrijvingen van drug-als antagonisten en hun bindingsplaatsen op PXR 3,4,5. Een kritische barrière het onvermogen om efficiënt te zuiveren eiwit van volledige lengte voor structurele studies met antagonisten hoewel PXR werd gekloneerd en gekarakteriseerd in 1998. Ons laboratorium ontwikkelde een nieuwe high throughput op basis van gist two-hybrid is een antagonist, ketoconazol definiëren, bindend residuen op PXR 6. De werkwijze omvat het creëren mutatiepatronen bibliotheken die het effect van afzonderlijke mutaties op de AF-2 oppervlak van PXR interactie verwacht tussen ketoconazol zou redden. Reddings-of &#39;gain-of-function &quot;second mutaties kunnen zodat conclusies over de genetische interactie van ketoconazol en het oppervlak residu (en) op PXR haalbaar worden gemaakt. Zo, een high throughput two-hybrid gist scherm van PXR mutanten interactie met haar coactivator, SRC-1 ontwikkelden we. Met deze aanpak, waarbij de gist werd gewijzigd om de studie van het antimycoticum ketoconazol tegemoet kunnen we aantonen specifieke mutaties op PXR verrijkt klonen niet binden aan ketoconazol. Door omgekeerde logica, concluderen we dat de oorspronkelijke resten zijn directe interactie residuen met ketoconazol. Deze test is een roman, handelbaar genetische test voor het screenen op antagonist bindingsplaatsen op nucleaire receptor oppervlakken. Deze test kan worden toegepast op elk geneesmiddel ongeacht de cytotoxische gist en cellulaire eiwit (ten) die niet kunnen worden onderzocht met behulp van standaard structurele biologie of proteomics gebaseerde methoden. Mogelijke valkuilen onder de interpretatie van gegevens (complementaire methoden bruikbaar), reliAnce op enkele Y2H methode, deskundigheid in het omgaan met gist of het uitvoeren van gist twee-hybride assays, en test optimalisatie.

We voerden een test om te zien of we een colorimetrische uitlezing van de vereniging van PXR en steroïde receptor coactivator-1 (SRC-1) kunnen detecteren. Omdat gist aanzienlijke sterol productie is eerder aangetoond dat lacZ expressie in gist kan worden opgewekt zonder extra exogeen ligand. We vonden dat lacZ expressie (blauwe kolonies) ook wordt geïnduceerd in de giststam getransformeerd met PXR en SRC-1, maar er is geen inductie van LacZ expressie (witte kolonies) in gist getransformeerd met lege vectoren, PXR of SRC...

Ketoconazol bindt aan en antagoniseert pregnaan X Receptor (PXR) activering. Gist high throughput screens van PXR mutanten definiëren een unieke regio voor ketoconazol bindend. Dit op basis van gist genetische methode ontdekt nieuwe nucleaire receptor interacties met liganden die associëren met oppervlakte bindingsplaatsen.

Reverse Gist Twee-hybride systeem voor het identificeren van zoogdieren Nuclear Receptor Residuen die interageren met liganden en / of antagonisten

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Het algemene doel van deze procedure is het beschrijven van een yeast high throughput two-hybrid assay die interacties onthult tussen de Pregnan X-receptor of PXR en de kleine moleculaire inhibitor ketoconazol. Dit wordt bereikt door eerst de yeast two-hybrid plasmiden te construeren, waarbij de ene het ligandbindende domein van de menselijke PXR tot expressie brengt en de andere de steroid receptor COACTIVATOR 1 of SRC-1. De aanwezigheid van ketoconazol verstoort de interactie van menselijke PXR met SRC-1, zoals aangetoond door vloeibare bèta-galacto assays.Samen met colorimetrische screening van kolonies op een filter maakt de screening van PXR-mutanten in de aanwezigheid van ketoconazol de identificatie mogelijk van mutaties die de receptor ongevoelig maken voor de werking van het geneesmiddel, wat uiteindelijk leidt tot een lage expressie door visuele inspectie en resultaten van de vloeibare bèta-galactoside-assays. SASE-assays worden gebruikt om veranderingen in de PXR-activatie in de aanwezigheid van ketoconazol aan te tonen, wat de identificatie van oorspronkelijke residuen die betrokken zijn bij de interactie mogelijk maakt. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode in het laboratorium van Dr. Manny, waar ik verbonden ben als associate.Toen we geconfronteerd werden met onvolledige gestructureerde gegevens over PXR, maakten de biochemische technieken identificatie onmogelijk, vooral voor interacties met een zeer geringe diepte die niet gemakkelijk aanpasbaar waren. Voor de structurele karakterisering, gebaseerd op het principe van het detecteren van kiton-resistente PXR-mutanten, hebben we een methode ontwikkeld die hanteerbaar en haalbaar is en binnen enkele dagen op zeer hoogdoorvoerige wijze kan worden uitgevoerd.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de bindingsaffiniteit van kleine moleculen op receptorproteïnen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals elk proteïne dat een pathogene rol speelt bij ziekten; in het bijzonder om een beperking in structurele biologische benaderingen op te heffen bij de initiële identificatie van bindingsresidu's om interactors van kleine moleculaire targets beter te begrijpen en te ontwerpen. Begin met het amplificeren van het menselijke PXR ligand-bindingsdomein en het volledige menselijke SRC-1, zoals beschreven in het tekstprotocol. Controleer de PCR-producten door ze op een 1% agarosegel te draaien.Purifice vervolgens de PCR-producten uit de AROS-gel. Digereer de PCR-producten in twee hybride vectoren zoals beschreven in het tekstprotocol en plaats de digestie-monsters gedurende één uur in een waterbad van 37 °C. Purificeer de gedigereerde monsters uit een 1% agrose-gel, ligeer vervolgens de gedigereerde en gepurificeerde PCR-producten en de twee hybride vectoren en transformeer deze in DH5α competente cellen na een overnacht-incubatie bij 37 °C.Selecteer de kolonies en isoleer het plasmide-DNA; gebruik restrictie-enzymdigestie om de aanwezigheid van de vector enHet insert te bevestigen en verifieer alle positieve plasmide-DNA via sequencing. Inoculeer de giststam in vijf milliliter YAPD en incubeer dit gedurende de nacht onder constante agitatie bij 220 RPM en 30 °C. Inoculeer de volgende ochtend de gist in een verhouding van 1:20 in vijf milliliter YAPD en incubeer tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,2 is bereikt onder constante agitatie.Centrifugeer de cellen 2 minuten bij 2000 RPM in een microcentrifuge om een pellet te vormen en verwijder het supernatant. Was de pellet vervolgens tweemaal met autoclaafwater en eenmaal met 0,1 molair lithiumacetaat. Verwijder na de laatste wasstap het supernatant, voeg de in het tekstprotocol vermelde transformatiereagentia toe aan de celpellet en vortexeer om te mengen.Voeg vervolgens de voorbereide vectoren die PXR en SRC bevatten toe vóór het mengen. Pipetteer het transformatiemengsel opnieuw in een polystyreen buis met ronde bodem en agiteer dit gedurende 30 minuten. Verplaats de buis naar een waterbad van 42 °C en incubeer nogmaals 30 minuten.Centrifugeer vervolgens de buis gedurende twee minuten bij 2000 RPM na het verwijderen van het supernatant. Was het pellet één keer met autoclaafwater door 100 µL steriel water in de buis te pipetteren en resuspendeer de cellen door voorzichtig op de buis te tikken en door te pipetteren. Zaai de cellen vervolgens uit op dropout-medium zonder histidine en leucine en incubeer deze drie tot vier dagen bij 30 °C om transformanten te isoleren.Om de Xga-filterassay te starten, snijdt u een driehoek uit een nitrocellulosemembraan die past in een gedeelte van 10 millimeter van een petrischaal. Label het nitrocellulosemembraan om de oriëntatie aan te geven. Plaats het vooraf gemarkeerde nitrocellulosemembraan op de gistkolonies, waarbij u er zeker van bent dat het membraan in contact staat met het oppervlak van het plaatmedium.Verwijder het membraan. Plaats het met de kant van de kolonies naar boven op een filterpapier van drie millimeter en plaats het membraan en het filterpapier 15 minuten lang bij minus 80 graden Celsius. Plaats vervolgens twee cirkels filterpapier van drie millimeter in een Petrischaal en week deze met vijf milliliter XAL-oplossing.Giet het overtollige buffer uit de Petrischaal en plaats het nitrocellulosemembraan in de schaal met de zijde van de kolonies naar boven. Sluit het deksel en zorg ervoor dat het membraan volledig contact maakt met het filterpapier en geheel nat is. Wikkel de Petrischaal in folie en incubeer gedurende 30 minuten tot overnight bij 37 °C om gist te laten groeien in vloeibaar medium zonder histidine en leucine tot een optische dichtheid bij 600 nm van 0,7.Breng één milliliter medium over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje en centrifugeer gedurende twee minuten bij 3000 RPM. Verwijder het supernatant en voeg één milliliter Z-buffer toe aan de pellet, waarna opnieuw wordt gecentrifugeerd. Voeg vervolgens 150 microliters Z-buffer met tumor capto ethanol toe om de celpellet te resuspenderen.Voeg vervolgens 50 µL chloroform en 20 µL 0,1% SDS krachtig toe. Vortex het monster gedurende 15 seconden. Voeg daarna 700 µL ONPG-oplossing toe, start de timer en incubeer bij 30 °C lang genoeg om de ontwikkeling van de gele kleur mogelijk te maken.Noteer de totale reactietijd zodra de kleur is ontwikkeld. Voeg 500 µL van één molair natriumcarbonaat toe om de reactie te stoppen. Bepaal vervolgens de absorbentie bij 420 nm.Bereken als laatste stap de Miller-eenheden zoals beschreven in het tekstprotocol. Omdat gist een aanzienlijke steriele productie heeft, kan laxy-expressie in gist worden geïnduceerd zonder dat een extra exogeen ligand nodig is. De xal lift-assay toonde aan dat laxy-expressie, gevisualiseerd door de blauwe koloniën, wordt geïnduceerd in de giststam die is getransformeerd met PXR en SRC one.Dit wordt ook aangetoond in de vloeibare bèta-galactosidase-assay. Er is echter geen inductie van LacZ-expressie in gist die is getransformeerd met lege vectoren, PXR alleen of SRC-1 alleen. Ketoconazol verstoort de interacties tussen PXR en SRC-1 in gist, aangezien alle kolonies van het replicatiefilter wit waren, wat ook werd aangetoond door de significant verminderde bèta-galactosidase-activiteit in vloeibare enzymatische assays.Wanneer gisttransformaties werden uitgevoerd met S rrc one op de P XR dubbele mutant, bleek dat de kolonies die waren blootgesteld aan ketoconazol nog steeds een lakse expressie vertoonden. Dit is vergelijkbaar met eerdere studies in dit laboratorium waaruit bleek dat dezelfde PXR kan worden geactiveerd door een sterk ligand, maar immuun is voor de antagonistische effecten van ketoconazol in zoogdier-assays. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een zorgvuldige hybrid AC uitvoert en waar dit mogelijk is, evenals de noodzakelijke modificaties die vereist zijn voor de studie van kleine moleculaire bindingsresiduen op eiwitten.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een zeer diverse bibliotheek van mutanten van uw receptor te verkrijgen, een goede transformatie-efficiëntie van elke 200 plussen te bereiken, nagenoeg identieke replica's van het filter ter plaatse te maken met of zonder geneesmiddelen, en ten slotte een nauwkeurige visuele en chemische inspectie uit te voeren voor nase-detectie. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals Ian 200 a Acids proteïne pro als zuren en de iCal-docking van homologe modellen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of ten minste bend uc toepasbaar is op menselijke eiwitcellen. En indien dit zo is, kan er een model worden gemaakt dat deze residuen als een farmaco voor verdedigt.

reverse-yeast-two-hybrid-system-to-identify-mammalian-nuclear

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

MYTHE kan de gevoelige detectie van voorbijgaande aard en stabiele interacties tussen eiwitten die worden uitgedrukt in het model organisme Saccharomyces cerevisiae. Het is met succes toegepast op exogene en gist integrale membraaneiwitten bestuderen om hun interagerende partners in een high throughput manier te identificeren.

Split-Ubiquitine membraanfilters op Yeast Two-Hybrid (mythe) Systeem: een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van eiwit-eiwit interacties

We hebben gewijzigd de conventionele gist twee-hybride screening, een effectief middel bij het identificeren van genetische eiwit interactie. Deze wijziging verkort aanzienlijk het proces, vermindert de werkdruk, en het belangrijkst, vermindert het aantal false positives. Daarnaast is deze aanpak is reproduceerbaar en betrouwbaar.

Gemodificeerde gist-twee-hybride systeem aan eiwitten Interactie met de groeifactor progranuline identificeren

In this video, we demonstrate the modified yeast one-hybrid assay, which detects multiple proteins interacting with target DNA. The transformed yeast cells contain the target DNA sequence upstream of the reporter gene. Additionally, they express transcription factor proteins. When the proteins form complexes and bind to the target DNA, the reporter gene is expressed and can be detected enzymatically.

Modified Yeast-One Hybrid Assay to Detect Heteromeric Protein Complex-DNA Interactions

Oligomerisatie van de ryanodine receptor, een homo-tetramer ionkanaal dat Ca2+ vrijmaakt uit intracellulaire opslag, is cruciaal voor skeletspier- en hartspiercontractie. Hier presenteren we complementaire in vivo en in vitro methoden om eiwit-zelfassociatie te detecteren en homo-oligomeer stoichiometrie te bepalen.

Genetische en biochemische benaderingen voor<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; In Vitro</em&gt; Evaluatie van Protein Oligomerisatie: De ryanodinereceptor Case Study

Bacteriële effector eiwitten zijn belangrijk voor het vaststellen succesvolle infecties. Dit protocol beschrijft de experimentele identificatie van proteïne bindingspartners van een bacteriële effector eiwit in zijn natuurlijke plantaardige gastheer. Het identificeren van deze effector interacties via gist-twee-hybride-schermen is uitgegroeid tot een belangrijk instrument in het ontrafelen van de moleculaire pathogeniteit strategieën.

Het ontrafelen van de functie van een bacteriële Effector uit een niet-landbouw Plant Pathogeen Met behulp van een gist two-hybrid screen

De gemodificeerde gist-een-hybride analyse die hier wordt beschreven is een uitbreiding van de klassieke gist-hybride (Y1H) -assay om de heteromeer eiwitcomplex-DNA-interactie te onderzoeken en valideren in een heterologe systeem voor elke functionele genomica-studie.

Een gemodificeerd Yeast-One Hybrid System voor Heteromere Proteïne Complex-DNA Interactie Studies

Dit protocol wordt beschreven hoe een verslaggever systeem dat kan worden gebruikt voor het identificeren en kwantificeren van receptor-ligand interacties te stellen.

Een systeem van de BW verslaggever voor het bestuderen van de Receptor-Ligand interacties

Presenteren we een methode voor het analyseren van de 4-hydroxy-tamoxifen-afhankelijke oestrogeen receptor Alfa ligand-bindend domein dimerisatie activiteit met behulp van de zoogdieren twee-hybride assay.

Opsporen van de Ligand-bindend domein dimerisatie activiteit van oestrogeen Receptor-Alpha met behulp van de zoogdieren twee-hybride Assay

De interacties van biomoleculen, zoals eiwit-eiwitinteracties, vormen de moleculaire basis van biologische functies. Als interactie-nulle/gestoorde mutanten die specifiek de relevante interactie missen, kunnen worden geïsoleerd, zullen ze enorm helpen om de functie(s) van deze interactie te begrijpen. Dit artikel presenteert een efficiënte manier om interactie-null/verminderde mutanten te isoleren.

Isoleren van interactie-null/aangetaste mutanten met behulp van de gist-twee-hybride test

Eiwitontwerp omvat de constructie van aminozuursequenties en de opname van specifieke motieven om functionele varianten te creëren. Deze aanpak is van cruciaal belang voor de ontwikkeling van antimicrobiële peptiden (AMP's) om antibioticaresistente ziekteverwekkers te bestrijden. Dit artikel presenteert een procedure voor eiwitconstructie met behulp van verschillende bio-informaticahulpmiddelen.

Toepassing van I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, HADDOCK-server en HEX-loria voor De Novo en In Silico Design of Proteins

Leer een yeast two-hybrid assay om interacties tussen PXR en ketoconazole te identificeren. Deze methode detecteert mutaties die resistentie tegen het antagonist veroorzaken en helpt bij het begrijpen van nucleaire receptor-ligand dynamica.

Reverse Gist Twee-hybride systeem voor het identificeren van zoogdieren Nuclear Receptor Residuen die interageren met liganden en / of antagonisten (Video) | JoVE Journal

Reverse Gist Twee-hybride systeem voor het identificeren van zoogdieren Nuclear Receptor Residuen die interageren met liganden en / of antagonisten

Meer video's verkennen