Name: Geoptimaliseerd Negatieve kleuring: een High-throughput protocol voor de behandeling Kleine en Asymmetric Protein Structure door Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Leer een geoptimaliseerd negatief kleuringsprotocol voor kleine en asymmetrische eiwitten met elektronenmicroscopie. Deze methode biedt hoge doorvoer en contrastrijke beelden voor structurele biologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Dr Mickey Yang voor het bewerken en commentaar, en Drs. Lei Zhang en Bo Peng voor hulp. Dit werk werd ondersteund door het Office of Science, Bureau van Basic Energy Sciences van het Amerikaanse ministerie van Energie (contract niet. DE-AC02-05CH11231), het National Heart, Lung, and Blood Institute van de National Institutes of Health (geen . R01HL115153), en het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health (geen. R01GM104427).

1 Bereiding van verse Negative kleuroplossing 1% (w / v) <ol><li> Zet 1 mg Uranyl Formiaat (UF) poeder in glazen fles met 100 gedeïoniseerd water in een donkere kamer of doos ml. </li><li> Roer de oplossing O / N bij RT in een donkere kamer / doos. Wikkel de oplossing fles met aluminiumfolie om te voorkomen dat licht van het raken van de oplossing. </li><li> Filtreer de oplossing zachtjes door 0,2 micrometer (poriegrootte) filter gemonteerd op een 5 ml spuit. De gefiltreerde oplossing werd verzameld in verschillende aluminiumfolie bedekt Falcon buizen. Het filter spuit moet worden omwikkeld met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. </li><li> Filtreer de oplossing weer door 0,02 micrometer (poriegrootte) filter gemonteerd op 1 ml spuit. De gefiltreerde oplossing werd verzameld en aliquot in 2 ml flesjes. De spuiten en flesjes wordt afgedekt met aluminiumfolie voor gebruik. </li><li> Bevries de hoeveelheid flesjes met lange steel pincet dompelen de flesjes in een vloeibare stikstof gevulde container onmiddellijknadat de oplossing werd gefiltreerd. </li><li> Breng de bevroren flesjes in een -80 ° C vriezer voor opslag en toekomstig gebruik. </li></ol> 2 Voorbereiding van negatieve kleuring Workstation en Incubation Workstation <ol><li> Ontdooi een flesje van 1% UF oplossing in een waterbad bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de aluminiumfolie blijft rond de flacon om blootstelling aan licht te voorkomen. </li><li> Filtreer de oplossing nadat het volledig is ontdooid met aluminiumfolie verpakt 1 ml injectiespuit gemonteerd met een 0,02 urn filter. Verzamel de gefilterde oplossing in een nieuwe aluminiumfolie verpakt flesje, en plaatste het op het ijs in een kap bedekt ice box wachten op gebruik. </li><li> Voeg oplossing platen door vinger duwen een ~ 8 inch lange Parafilm vel op het oppervlak van een lege eiwit kristallisatie. Het zal rijen van ronde platen genereren met een diameter van ~ 5 mm. Voeg 6 platen in elke rij de plaats Parafilm platen op een oppervlak afgeplatte ijs binnen een Ice bevattener deksel, als kleuring werkstation. </li><li> Pipetteer ~ 35 pi gedeïoniseerd water op elk van drie linker platen in elke rij, en pipetteer ~ 35 pi gefilterde UF oplossing naar rechts drie platen in elke rij. Bedek de kleuring werkstation met een deksel om blootstelling aan licht te vermijden vóór kleuring eiwitten. </li><li> Bereid een EM rooster incubatiestation door vullen van een lege box helft met ijs, en gehecht naast een hanger die op een ondersteunende basis kan worden gemonteerd. Het monster pincet in de hanger, waarin tips van de pincet zijn dichtbij het ijsoppervlak. De helft te dekken tips pincet &#39;door het vakje lip hoogte. Een ideale ice box om een ​​incubatie-station te maken is met behulp van een lege pipet tips container. </li></ol> 3 OPNS Operation <ol><li> Glow-ontladen van de dunne carbon filmomhulde 300 mesh koper EM roosters voor 10 sec. </li><li> Pick-up een raster met een pincet en haak de pincet in de hanger door het houden van het net op een 45 ° kantelen en 1 centimeter boven het ijsonderdelen in de incubatie station. </li><li> Verdun het eiwit monster met Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing (DBP) en uiteindelijke eiwitconcentratie van ~ 0,01 ~ 0,005 mg / ml. Aanbetaling ~ 4 pi verdunde monster onmiddellijk na de verdunning van het koolstofgehalte kant van EM rooster. (DPBS kan worden op een ander buffer als het eiwit gevoelig is DPBS) </li><li> Incubeer het monster op de EM roosters voor ~ 1 min in de incubatie-station. </li><li> Verwijder de overtollige oplossing snel door het rooster rand met filtreerpapier te raken. </li><li> Raak het net snel naar de eerste druppel (~ 35 pl) van zuiver water oppervlak bovenop de Parafilm vel direct na de overtollige oplossing werd verwijderd op de EM rooster. En verwijder het overtollige water onmiddellijk met filtreerpapier. </li><li> Herhaal stap 3.6 nog twee keer door het wassen van de EM raster op de overige twee waterdruppels op de Parafilm (stap 3.6 en 3.7 kan worden overgeslagen indien het monster is zeer gevoelig voor water). </li><li> Drijven de EM grid direct op het oppervlak van de eerste druppel UF oplossing direct na het overtollige water van de EM raster verwijderd. En dan incubeer gedurende 10 sec. Zorg ervoor dat de procedures water wassen binnen 3 sec afmaken voordat drijven het raster op het oppervlak van de UF-oplossing. Hoe korter de wastijd, hoe beter de kwaliteit. </li><li> Reinig het pincet door het penetreren van de tips in een papieren filter voor ~ 2 - 3 keer. </li><li> Verwijder de overtollige oplossing op de grid door contact op te nemen het rooster rand met het filterpapier, en dan drijven de grid op de tweede druppel UF. </li><li> Verder bovenstaande stap 3.10 op de tweede druppel. </li><li> Drijven het rooster op de derde druppel UF-oplossing en hebben betrekking op de vlekken station voor ~ 1 min. </li><li> Optionele stap: wassen het rooster snel op een top van het water, zoals beschreven in 3.6. Deze aanvullende stap gebruikmaken monsters die overbelast vrije gouddeeltjes of vlekachtergrond. </li><li> Verwijder het overtollige oplossing door het aanraken van het filterpapier to the hele rooster achterzijde (tegenover de carbon kant). Droog het rooster onder een voorzichtige stroom stikstofgas bij KT direct na het observeren van de absorberende oplossing aan het filterpapier. </li><li> Leg het rooster op een vel filterpapier in een petrischaaltje, en dek de schaal gedeeltelijk met een pet te drogen gedurende minstens 30 minuten onder de RT. Voor sommige monsters, plaats het rooster in een 40 ° C incubator bakken voor een uur. </li><li> Bewaar het rooster in een EM rooster doos voor toekomstig EM onderzoeken. </li></ol> 4 EM onderzoeken <ol><li> Lijn de TEM goed voordat EM onderzoek van de kleine eiwitten op de grid. <ol><li> Controleer de resolutie van de hoogst zichtbare Thon-ring dat het vermogensspectrum van een amorfe koolstoffilm te bepalen of de TEM goed is uitgelijnd. Aangezien de TEM wordt gedeeld door veel verschillende gebruikers, de TEM werd vaak scheef. </li><li> Controleer het vermogensspectrum aan van de carbon folie gebied van het monster zorgvuldig om de uitlijning conditio passenn van de machine. De hoogste zichtbare Thon-ringen zijn beter dan de beoogde resolutie. OPMERKING: Als u een voorbeeld van een goede afstemming van een LaB6 filament TEM geëxploiteerd onder 120 kV hoogspanning, kunnen meer dan 20 Thon-ringen worden gevisualiseerd, waarin, kan de desbetreffende resolutie van beter dan 5,0 A zijn. Dit Thon-ring werd gerealiseerd door Fourier overgang van amorfe koolstoffilm afgebeeld onder een defocus van ~ 1,6 urn en een dosis van 20,4 e / Å2 (Figuur 5). OPMERKING: waarneming van de hoge resolutie Thon-ring is een noodzakelijke voorwaarde, maar geen voldoende voorwaarde voor een goede afstemming. Om daadwerkelijk bereiken van de hoge resolutie beelden, vele andere parameters van belang, zoals de kwaliteit van het monster, stralingsschade, opladen en drijven alsmede de verlichting dosering. </li></ol></li><li> Breng de defocus terug naar de buurt-Scherzer focus voor de beeldvorming van de kleine eiwitten op een ideaal gebrandschilderde gebied. </li><li> Zoeken naar &quot;bewolkt&quot; gebied om IMAGe. Een ideale vlek wordt meestal bij de rand van een dikkere effectieve oppervlakte, die lijkt op een &quot;helder&quot; gebied op het rooster, omdat de dikte van de vlek gewoonlijk niet gelijkmatig verdeeld koolstof beklede rooster (figuur 6). Typisch een lage vergroting (&lt;100x) was om te helpen om deze bewolkte gebieden vinden voordat inzoomen voor de beeldvorming. </li></ol>

We hebben niets te onthullen.

Vergeleken met conventionele NS technieken kan OPNS rouleaux artefacten (figuur 1 en 9), die betrouwbare en redelijk hoge-resolutie (~ 1 nm) structurele details van kleine eiwitten (figuur 2) te voorkomen. Vergeleken met cryo-EM, OPNS biedt high throughput werkwijze en kan een grote verscheidenheid van eiwitten en eiwit-eiwit interacties 6 onderzocht. Echter, OPNS nog nadelen. Vergeleken met conventionele NS, OPNS houdt in: i) meer ingewikkelde stappen in prepareren; ii) met een radioactieve stof, UF; iii) waarbij de vlek vers door de kortere potentie van de UF vlek vanwege de lichtgevoeligheid; iv) te voorkomen dat de precipitatie UF oplossing moet worden opgeslagen in -80 ° C en vereist ontdooien voor gebruik; v) en ten slotte alle UF moet worden behandeld als gevaarlijk afval. Vergeleken met cryo-EM, OPNS biedt relatief lage resolutie, en geen garantie voor een nog niet ontdekt artefactin de toekomst. NS operatie procedurele effecten op de lipoproteïne rouleaux vorming NS-protocollen voor het bereiden van eiwitten voor onderzoek 16,29-36,55 kunnen worden ingedeeld in drie grote groepen van methoden 50: het mengen van 55, drop-by-drop 16, spoelprocedures 29. i) Het mengen protocol vereist de voorafgaande menging van de vlek en eiwit monster bij een bepaalde verhouding, en vervolgens het toepassen van de gemengde oplossing op carbon folie bedekt op een rooster, uiteindelijk het verwijderen van overtollige oplossing met papieren filter voor de lucht drogen voor EM onderzoek 55. ii) De drop-by-drop protocol geval wordt (~ 4 ui) sample onderstaande rechtstreeks naar een EM rooster bekleed carbon laten zitten ~ 1 min, vervolgens verwijderen van overtollige monsteroplossing voordat een druppel (~ 4 ui) vlek oplossing aan dezelfde kant van rooster. Na ~ 1 min incubatie, verwijder het excess vlek door het contact met schone papieren filter, eindelijk indienen voor de lucht drogen 16,56-58. iii) Het wassen protocol (figuur 7) ter monsteroplossing app een EM rooster bekleed met koolstof, voor 1 min, vervolgens wassen met gedeïoniseerd water drie keer direct na verwijderen van overtollige oplossing telkens met filtreerpapier 3,29,30. OPNS protocol werd gewijzigd van deze wassen procedure. NS vlek soorten en effecten op lipoproteïne rouleaux formatie In NS, sterkere elektron verstrooiing als gevolg van zware metalen vlekken bieden contrast van de eiwitten 17-20,59. NS monsters kunnen bovendien last hebben grotere stralingsdoses, en verbeteren eiwit kenmerken door een scherper negatief contrast 8,9,60. Vlekken van zware metalen kan worden aangemerkt als: anionische, inclusief fosfowolfraamzuur (PTA) 16, methylamine tungstaat 14 en silicium tungstaat 61; en kationenic, zoals uranylacetaat (UA) 62, UF 3,29,30, en Uranylnitraat (VN) 63. Een van de anionische NS vlekken die het meest wordt gebruikt, is PTA 33,64-67. PTA is een heteropolyzuur die gewoonlijk wordt toegepast bij een pH 7,0-7,5. PTA kan ook worden gebruikt voor positieve kleuring 3,16,68. De negatieve ladingen van PTA kan elektrostatische interacties bemiddelen met onverzadigde vetten positief geladen kopgroepen, zoals POPC, zowel op lipoproteïne en liposoom oppervlakken. PTA kan rouleaux vorming veroorzaken bij deze interactie 29,30 zelfs onder normale buffer zoutgehalte 29,30 (Figuur 1). Uranyl vlekken, zoals UA, UF en UN alternatieve keuzes voor kationogene zware metalen vlekken en UA name wordt vaak gebruikt voor NS van een verscheidenheid van biologische monsters 62,69,70. Experimenten gevonden UF veroorzaakt geen rouleaux van lipoproteïnen dat onverzadigd vet zuur lipiden, zoals POPC bevatten. Echter, UF nog roule inducerenaux vorming van lipoproteïne dat verzadigde vetzuren lipiden, zoals dimyristoylfosfatidylcholine (DMPC) en 1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (PSPC) bevatten. Het gedetailleerde mechanisme van deze interactie is niet bekend. UA / UF / UN kan alle werkzaamheden bij lagere pH waarden tussen 3,5-4,6. Deze lagere pH-waarden al niet geschikt voor bepaalde biologische macromoleculen die gevoelig pH 14,71 zijn. Interessant, kan RE / UF eiwit structuur binnen een paar milliseconden te repareren door middel van een onbekend mechanisme 72. Unlike PTA, UA / UF is vergelijkbaar met een zout dan een zuur. UF verluidt kan betere resultaten geven dan UA 73, waarin, UF en VN-vlekken hebben een kleinere korrelgrootte dan UA (UF: 0,3 nm, VN: ~ 0.5 nm) 3,74. Een interessant voorbeeld, secundaire structuur-achtige data van een klein eiwit (53 kDa CETP) direct zichtbaar uit de ruwe microfoto bij UF werd als negatieve vlek reagens door deeerder gemeld cryo-positieve-kleuring (cryo-PS)-methode (figuur 8) 6. In cryo-PS, de gebrandschilderde monster was flits door het volgen van cryo-EM monstervoorbereiding procedure in plaats van droging in OPNS protocol, dat de secundaire structurele instorting kan veroorzaken bevroren. De cryo-PS is een werkwijze voor hoog contrast en hoge resolutie beeldvorming van kleine eiwitten 75. Omdat de cryo-PS beelden hebben omgedraaid contrast in vergelijking met die van de gerapporteerde cryo-NS-protocol 22, maar hebben consistente image tegenstelling tot die van conventionele cryo-EM beelden, zo werd het genoemd de cryo-PS-methode. De cryo-PS-beelden laten zien dat de vlekken reagens, Uranyl formaat, dringt de moleculaire oppervlak, tegen de gangbare opvatting dat vlekken alleen de buitenste oppervlakte structuur kan visualiseren. Het mechanisme hoe Uranyl formaat penetreert het moleculaire oppervlak onbekend. Een mogelijkheid is dat de Uranyl kation bindt beschikbaar eiwit carboxylgroepen, en dus deomliggende glasachtige ijs lagere dichtheid dan de kleuring van de eiwitten en Uranyl groepen, waardoor een positieve kleuring optreedt. De cryo-PS-methode is vergelijkbaar met multiple-methode isomorfe vervanging (MIR), die een gemeenschappelijke aanpak van de fase probleem in X-ray kristallografie 76-78 te lossen was. In MIR, zijn kristallen monsters doorweekt met een zwaar atoom oplossing, waaronder uranium, een isomorfe vorm aan zijn natuurlijke vorm te krijgen. De toevoeging van de zware atoom heeft soms invloed op de kristalvorming of eenheidscel afmetingen maar geeft aanvullende informatie kristalstructuurbepaling 76-78. Door te profiteren van de kleine korrel UF kan cryo-PS een beeld met hoge resolutie en hoog contrast van een enkel eiwit, wat belangrijk is voor eiwitstructuur studies, vooral wanneer men bedenkt dat bijna alle eiwitten van nature dynamisch en heterogeen oplossing. Voor de validatie van dit cryo-PS methode openen we voor blind van de EM veld. </p&gt; Zoutconcentratie effecten op de rouleaux formatie in lipoproteïnen Met behulp van traditionele PTA negatieve van de kleurstof wordt waargenomen rouleaux vorming meer waarschijnlijk gerelateerd aan lipide interacties in plaats van eiwit interacties. Beeldvorming monsters van POPC liposomen vesicles bereid onder aanzienlijke zoutgehalte (0,5 M NaCl), matig zoutgehalte (0,25 M NaCl), relatief zwakke zoutgehalte (0,1 M NaCl) en zuiver water (figuur 9), de electronenmicroscoop tonen de rouleaux formatie gecorreleerd aan zoutconcentratie (Figuur 9A - D). Met UF negatief kleuring reagens werd geen rouleaux waargenomen POPC liposoom monster 30 (Figuur 2L) suggereert de wasprocedure snel de zoutconcentratie vlak voor kleuring is een noodzakelijk verminderen, maar niet zelfstandig enige voorwaarde voor het voorkomen rouleaux in POPC verwante monsters. TEM beeldvorming klein eiwit vereist een bijna-Scherzer nadruk conditie. Succesvolle TEM beeldvorming van kleine eiwitten met een hogere resolutie vereist twee kritische omstandigheden, een goede koplampen en een bijna-Scherzer nadruk overname conditie. i) Een goede koplampen kan worden beoordeeld door het aantal zichtbare Thon ringen (vermogensspectrum) de Fourier overdracht koolstoffilm beeld onder een relatief hoge defocus verwierf een van. Hoe beter de afstemming conditie van de balk, hoe meer Thon ringen worden gevisualiseerd en meetbare .. ii) Het verwerven van het onder een bijna-Scherzer focus ligt nog een kritieke toestand. Een traditionele standaard strategie voor het afbeelden van biologische monsters gebruikt over het algemeen hoog defocus (1 - 2 urn en zelfs meer), waarbij het ​​biologische monster beeldcontrast 79 kan verbeteren. Deze strategie is significant verschillend van de typische strategie voor het afbeelden atomaire resolutie structuur van harde materialen, die vaakmaakt gebruik van een in de buurt van Scherzer scherpstelling (~ 50 nm defocus). Hoewel, een hoger defocus biologisch monster contrast te versterken, zou hoge resolutie signalen gedeeltelijk worden geëlimineerd. Daardoor zou de medewerking van hoge resolutie signaal lager bij hogere defocus imaging conditie. De reden is dat het TEM beeld is de convolutie van steekproef structuur en het instrument CTF. De CTF een oscillerende curve tegen de frequentie, waarin de curve vaak schommelt kruising nul amplitude bij hoge frequenties. Iedere keer wanneer CTF over nul, het monster structurele signaal op deze specifieke frequentie zullen worden geëlimineerd (nul keer een willekeurig aantal zal nul). De geëlimineerd signaal op deze frequentie kan nooit worden herwonnen door elke CTF algoritme (nul gedeeld door nul kan een willekeurig nummer in plaats van het oorspronkelijke structurele signaal). Onder hogere defocus beeldvorming zal de CTF oscilleren agressiever waardoor de CTF door nul amplitude vaker als gevolg,de structurele signalen op een groter aantal specifieke frequenties worden geëlimineerd. Hoe meer signalen die worden uitgescheiden, hoe minder medeplichtigheid het beeld zal hebben. Met name kan de medeplichtigheid van het beeld niet worden hersteld of gecorrigeerd door een CTF correctie. Echter, een aantal Onvolledige beelden onder verschillende onscherp verkregen worden gebruikt om hun tekortkomingen via middelingsmethode, waarbij zelfs een atomaire resolutie kan worden bereikt 9-12 vullen elkaar obtained een voltooide structurele signaal van het monster structuur. De middelingsmethode is een krachtige aanpak om de structuur van bepaalde zeer symmetrische eiwitten en structureel verwante eiwitten stijf bereiken. Toch blijft een uitdaging in de structurele studie van kleine en asymmetrische eiwitten, vooral voor structuurdynamica en flexibele eiwitten, zoals antilichamen en HDL. Middeling is gebaseerd op de veronderstelling dat eiwitdeeltjes identiek in structuur en conformatie maar different in oriëntaties hoeveel eiwitten bekend thermodynamische schommelingen ondergaan oplossing. Door het toepassen van de middelingsmethode zonder vooraf te weten het eiwit fluctuatie schommelingen thermodynamische, kan de gemiddelde structuur vaak ontbreekt domeinen 10,80 of lokale variatie in resolutie 81 in cryo-EM reconstructies veroorzaken. Het succes in het bereiken van de 3D reconstructie van kleine eiwitten, zoals 53 kDa CETP en 3D-structuur van een eiwit, zoals 160 kDa IgG1 antilichaam voordelen van het gebruik van korte-Scherzer aandacht imaging voorwaarde van een juiste uitlijning aandoening. Hoewel het beeldcontrast lijkt laag in het nabij-Scherzer scherpstelling beelden kan het contrast worden verbeterd gemakkelijk door gewoon een laagdoorlaatfilter aan de hoogfrequente ruis op de achtergrond te verminderen. Wij zijn van mening, de buurt-Scherzer richten beelden dragen de maximale structurele signalen, en kan de nauwkeurigheid van deeltje afstemming verhogen en efficiëntie in single-deeltje 3D reconstructie en individueel deeltje elektron tomografie reconstructie.

Inzicht in eiwit functie vereist kennis van de eiwitstructuur. Structurele bepaling is een uitdaging voor de eiwitten waarvan het moleculaire massa&#39;s zijn binnen 40-200 kDa. X-ray kristallografie beperkt door proteïne kristallisatie; nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie is ondermeer moleculaire massa van minder dan 40 kDa, terwijl cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) is moeilijk zowel beeldvorming als driedimensionale (3D) reconstructie van kleine eiwitten die molecuulgewichten minder dan 200 kDa. Met name meer dan 50% eiwitten hebben een moleculair gewicht binnen het bereik van 40-200 kDa 1,2, de huidige werkwijzen uitdagen bestuderen eiwitten van deze grootte, wordt een nieuwe methode nodig. Hoewel de meeste transmissie elektronenmicroscopen (TEM) in staat zijn atomaire resolutie, dat wil zeggen, beter dan 3 een resolutie bereiken zelfs een buurt nanometer resolutie structuur van een biologische monsters is nogal challenGing 7. Stralingsschade, laag contrast, structurele afwijkingen evenals artefacten zoals uitdroging alle hinderen hoge-resolutie TEM beeldvorming 3,8. Tussen de verschillende benaderingen van TEM, cryo-EM is een geavanceerde en geavanceerde methode om atomaire resolutie structuren van zeer symmetrische grote macromoleculen te bereiken onder fysiologische omstandigheden in de buurt van 9-12. De cryo-EM monster wordt bereid Snelkoelen de monsteroplossing, verankeren macromoleculen in glasachtige ijs, dat vervolgens wordt afgebeeld bij cryogene temperaturen zoals vloeibare stikstof of helium temperaturen 13. Cryo-EM is voordelig doordat deze geen monsters artefacten en bijna natieve structuur 8-12. Cryo-EM heeft wel zijn nadelen: i) extra apparaten nodig zijn om te worden geïnstalleerd of eerst naar een standaard TEM-instrument voor een cryo-EM vaardigheid te verbeteren. Apparaten zijn: anti-Contaminator, cryo-houder, een lage dosis mode-software en een lage dosis sensitieve CCD camera, maar de prijzen van deze apparaten zijn veel lager dan de prijs van de TEM instrument zelf; ii) cryo-EM operatie nodig heeft langere tijd dan NS operatie. De behandeling van een cryo-EM specimen vereist vaak langere tijd om de specimens te bereiden en de TEM-instrument dan die van NS werken omdat cryo-EM vereist adressering extra moeilijkheden, zoals: temperatuur van vloeibare stikstof operatie, sample laden, imaging drift, temperatuurverschillen, een lage dosis model operatie, monster straling gevoeligheden en dosering beperkingen. Deze extra stappen vertraagt ​​de snelheid van stroom nuttige gegevens vergeleken NS data acquisitie, hoewel enkele cryo-EM foto zeker in 1 uur of minder kunnen worden verkregen door cryo-EM deskundigen de bereide met een evenwichtige temperatuurgradiënt instrument; iii) gebruikers nodig aanvullende opleiding, zoals het hanteren van vloeibaar stikstof, bevriezen cryo-EM roosters, een lage dosis operatie, dosismeting, de behandeling van de lading, driften en kennis in imaging processing; iv) het ontbreken van herhaalbare beeldvorming voor hetzelfde cryo-exemplaar tijdens verschillende TEM sessies. Cryo-EM exemplaren kunnen gemakkelijk beschadigd raken door ijs besmetting tijdens specimen laden en lossen van / naar de TEM-instrument. Deze schade is vooral een punt van zorg, wanneer de monsters zijn moeilijk te isoleren / gezuiverd 14; v) kleine eiwitten (&lt;200 kDa moleculaire massa) zijn uitdagend om te worden afgebeeld als gevolg van lage contrast; vi) het lage contrast en hoge geluidsbelasting van cryo-EM beelden reduceert het kruis-correlatiewaarde tussen afbeeldingen derhalve afnemende algehele nauwkeurigheid bij de bepaling van eiwit oriëntaties conformaties en classificaties, in het bijzonder voor eiwitten die structureel flexibel en natuurlijk af in oplossing 4,5. Negatieve kleuring (NS) is een relatief &quot;oude&quot; en de historische methode die elk laboratorium, met elk type EM, kunt gebruiken om eiwitstructuur te onderzoeken. Brenner en Horne eerste het concept o ontwikkeldf negatieve kleuring van een halve eeuw geleden voor de behandeling van virussen 15. NS wordt bereikt door het coaten van het monster met geladen zouten van zware metalen. Dit concept oorspronkelijk afkomstig uit lichtmicroscopie en de praktijk van het inbedden van bacteriën in een vlek oplossing die duisternis rond de modellen, waardoor hogere beeldcontrast tijdens het bekijken van het negatieve beeld 16. Aangezien zware metaalionen een groter vermogen om elektronen tegenover minder dichte atomen dispergeren in de eiwitten 17-20 en coating heavy metal vlek laat een hogere dosering beperking met verbeterd contrast. NS specimen kunnen leveren hoge contrast beelden 8 voor eenvoudiger deeltje oriëntatie vastberadenheid en 3D reconstructie dan beelden van cryo-EM. Traditionele NS, helaas, kunnen artefacten veroorzaakt door vlek-eiwit interacties, zoals algemene aggregatie, moleculaire dissociatie, het vlakken en stapelen 8,21,22 produceren. Voor lipide-gerelateerde proteins, zoals lipoproteïnen 16,23-30 een gemeenschappelijk artefact resulteert in deeltjes die zijn gestapeld en verpakt samen in een rouleaux (figuur 1) 31-36. Vele studies lipoproteïne, zoals denaturerende polyacrylamide gradiënt gel elektroforese, cryo-EM studies 13,29,37-40, massaspectrometrie 39,41 en kleine hoek röntgendiffractie gegevens 42 alles weergeven lipoproteïne deeltjes geïsoleerde deeltjes in plaats van natuurlijk gestapeld samen een rouleaux 21,29,30,35,42-45. De waarneming van rouleaux vorming door gebruikelijke NS wordt mogelijk veroorzaakt door dynamische interacties tussen lipoproteïnen samengesteld als apolipoproteïnen (Apo) en fosfolipiden die structureel flexibel in oplossing 13,29,30,46-49 en gevoeligheid voor de standaard NS protocol. Om dit artefact te identificeren, werden apolipoproteïne E4 (apoE4) palmitoyl-oleoylphosphatidylcholine (POPC) high-density lipoproteïne (HDL) sample gebruikt als een test sample en cryo-EM beelden voor een artefact gratis standaard 29, het screenen van de monsters NS opgesteld onder een reeks voorwaarden. Door vergelijking van de deeltjesgrootte en vorm verkregen uit NS en cryo-EM, het specifieke type van de kleurstof en zoutconcentratie bleken twee belangrijke parameters waardoor de bekende rouleaux verschijnselen. Aldus werd een geoptimaliseerde negatieve kleuring (OPN) protocol gerapporteerd. Door OPNS, de bekende rouleaux fenomeen apoE4 HDL werd uitgeschakeld door OPNS (Figuur 2A). Statistische analyse toonde OPNS opbrengsten vergelijkbaar afbeeldingen (minder dan 5% afwijking) in grootte en vorm in vergelijking met die van cryo-EM, is echter het contrast geëlimineerd. De validatie van OPN werden uitgevoerd door het onderzoeken van de eliminatie van de rouleaux artefact van bijna alle klassen of subklassen van lipoproteïnen monsters 6,29,30,50,51, waaronder apoA-I 7,8 nm (figuur 2B), 8,4 nm (figuur 2C) , 9.6 nm discoidal gereconstitueerd HDL (rHDL) (Figuur 2D), 9,3 nm bolvormige rHDL (figuur 2E), humaan plasma HDL (figuur 2F), lipidevrij apoA-I (Figuur 2G), plasma HDL (Figuur 2H), low density lipoprotein (LDL ) (figuur 2I), intermediair-density lipoproteïne (IDL) (Figuur 2J), zeer lage dichtheid lipoproteïne (VLDL) (figuur 2K), en POPC liposoom (figuur 2L) 30. Aanvullende validaties werden uitgevoerd door het beeldelement klein en asymmetrische eiwitten, waaronder de 53 kDa cholesteryl ester transfer proteïne (CETP) (Figuur 3A - C) 6,29, en zeer flexibele 160 kDa IgG-antilichaam (Figuur 4A en B) 4,5,29 , 52, en twee structureel bekende eiwitten, GroEL en proteasoom (figuur 2 M en N). Voor dat hiervoor een extra validatie van colleagues, we staan ​​open voor alle blinde tests op deze OPNS methode. OPNS als high-throughput protocol is ook gebruikt om eiwitten mechanisme onderzoeken aan behandeling honderden monsters van kleine eiwitten zoals CETP die werd binding aan verscheidene eiwitten onder een aantal omstandigheden (inclusief CETP interactie tot 4 klassen lipoproteïnen, gerecombineerde HDL, plasma HDL, LDL en VLDL, met / zonder 2 antilichamen, H300 en N13, onder 9 incubatietijd, waaronder 3 min, 20 min, 1 uur, 2 uur, 4 uur, 8 uur, 24 uur, 48 uur en 72 uur, tot 4 molaire verhoudingen, dwz 1: 0,5, 1: 1, 1: 2, 1: 4 en 3 verdunningen, namelijk 0,1 mg / ml, 0,01 mg / ml en 0,001 mg / ml, plus extra controlemonsters, waaronder CETP alleen, alleen LDL en VLDL alleen met drievoudige proeven van bovenstaande experimenten door verschillende personen) 6,29. OPNS beelden van CETP voorzien contrastrijke beelden met redelijk fijne structurele details; zodat we met succes te reconstrueren van een 3D-dichtheid kaart van de 53 kDa small eiwit CETP (Figuur 3D - F) door enkel deeltje reconstructie. Bovendien, het hoge contrast OPNS beelden geven ons een voldoende signaal van een individueel eiwit (Figuur 4A - C), die ons toeliet om de tussenliggende resolutie (~ 1.5 nm) van een enkel (een voorwerp, geen gemiddelde) IgG antilichaam 3D-structuur te krijgen via de methode (Figuur 4E - J) individuele-deeltje electron tomography (IPET) 5. De gedetailleerde beschrijving van IPET reconstructie strategie, methodiek, stap-voor-stap processen en structurele variatie analyse werden eerder gemeld 4. Een film over IPET antilichaam reconstructie procedures, inclusief de ruwe beelden en de tussentijdse resultaten, 3D-dichtheid kaart en structurele docking was ook beschikbaar voor het publiek door naar YouTube geüpload 5. Vergelijking van de 3D-reconstructies van verschillende individuele antilichaam deeltjes kunnen de eiwit dynamiek en c onthullenonformational veranderingen tijdens chemische reacties 4,5. Gezien het feit dat meer dan 50% van de eiwitten hebben moleculaire massa variërend 40-200 kDa 1,2, het succes in de beeldvorming van deze kleine eiwitten blijkt dat OPNS methode is een handig hulpmiddel om de conventionele EM grens in de richting van de kleine en asymmetrische structurele vaststellingen en het mechanisme ontdekkingen duwen . Aldus wordt het gedetailleerd protocol zoals hieronder aangegeven.

<table><tbody><tr><td>Stain: Uranyl Formate</td><td>The SPI Supplies Division of Structure Probe, Inc.</td><td>02545-AA</td><td>http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml</td></tr><tr><td>Syringe: 1 ml NORM-JECT</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491</td></tr><tr><td>Syringe filter: 0.2 &mu;m&nbsp;</td><td>VWR</td><td>28145-487</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487</td></tr><tr><td>Syringe filter: 0.02 &mu;m filter (Anotop 10)</td><td>Whatman</td><td>6809-1002</td><td>http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>D8537</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en&amp;region=US</td></tr><tr><td>Parafilm: 4 in. x 125 ft.</td><td>VWR</td><td>470152-246</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A</td></tr><tr><td>Carbon film coated TEM grid: 300 mesh</td><td>Pacific Grid-Tech</td><td>Cu-300CN</td><td>http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon</td></tr><tr><td>Carbon film coated TEM grid: 200 mesh</td><td>EMS (Electro Microscopy Sciences)</td><td>CF200-Cu</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx</td></tr><tr><td>Tweezer: Dumont Tweezer L5</td><td>EMS (Electro Microscopy Sciences)</td><td>72882-D</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5</td></tr><tr><td>Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System</td><td>EMD Millipore</td><td>Milli-Q Advantage A10</td><td>http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117</td></tr><tr><td>Filter Paper: Grade 1 circles</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx</td></tr><tr><td>Aluminum Foil</td><td></td><td></td><td>Elke type</td></tr><tr><td>Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 10&micro;L Pipettors</td><td>VWR</td><td>89174-520</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Glow Discharge Unit</td><td>Ted Pella</td><td>91000</td><td>http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm</td></tr><tr><td>Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 40&micro;L Pipettors</td><td>VWR</td><td>89174-524</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524</td></tr><tr><td>Filter Tips: VWR Signature 200 &micro;L Pipet Tips</td><td>VWR</td><td>37001-528</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528</td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Pipetman</td><td>F161201 en F167300</td><td>http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx</td></tr></tbody></table>

geoptimaliseerd negatieve kleuring: een high-throughput protocol voor de behandeling kleine en asymmetric protein structure door electron microscopy

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Structuurbepaling van eiwitten is nogal een uitdaging voor eiwitten met molecuulgewichten tussen 40-200 kDa. Aangezien meer dan de helft van de natuurlijke eiwitten hebben een molecuulmassa tussen 40-200 kDa 1,2, wordt een robuuste en high-throughput-methode met een nanometer resolutie vermogen nodig. Negatieve kleuring (NS) elektronenmicroscopie (EM) is een eenvoudige, snelle en kwalitatieve aanpak die vaak is gebruikt in onderzoekslaboratoria om eiwitstructuur en eiwit-eiwit interacties te bestuderen. Helaas, conventionele NS protocollen genereren vaak structurele artefacten op eiwitten, vooral met lipoproteïnen die meestal vormen presenteren rouleaux artefacten. Bij gebruik van afbeeldingen van lipoproteïnen van cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) als standaard, werden de belangrijkste parameters in NS prepareren omstandigheden onlangs onderzocht en gerapporteerd als de geoptimaliseerde NS protocol (OPN), een gemodificeerd NS conventionele protocol 3. Artefacten zoals rouleaux kan sterk beperkt worden door OPNS bovendien leveren van hoge contrast samen met redelijk hoge-resolutie (bij 1 nm) afbeeldingen van kleine en asymmetrische eiwitten. Deze hoge resolutie en hoog contrast zelfs gunstig voor een individuele eiwit (een enkel object, geen gemiddelde) 3D-reconstructie, zoals een 160 kDa antilichaam, door de werkwijze van elektronentomografie 4,5. Bovendien kan OPNS een high-throughput instrument honderden monsters van kleine eiwitten te onderzoeken. Bijvoorbeeld, de eerder gepubliceerde mechanisme van 53 kDa cholesteryl ester transfer proteïne (CETP) betrokken screening en beeldvorming van honderden monsters 6. Gezien cryo-EM zelden succesvol beelden eiwitten minder dan 200 kDa heeft nog enige studie waarbij screening meer dan honderd monstercondities publiceren, is het eerlijk om te bellen OPNS een high-throughput-methode voor het bestuderen van kleine eiwitten. Hopelijk de OPNS protocol hier gepresenteerde kan een nuttig instrument zijn om de grenzen van E duwenM en versnellen EM studies in kleine eiwit structuur, dynamiek en mechanismen.

De implementaties van OPNS zijn de structurele en morfologische onderzoeken van diverse lipoproteïne soorten zoals: ontluikende recombinant HDL (rHDL), sferische recombinant HDL, HDL, LDL, IDL en VLDL (figuur 2) 30; en kleine eiwitten zoals 53 kDa CETP (de kleinste eiwitten succesvol afgebeeld door EM) (figuur 3) 6 en 160kDa IgG-antilichamen (een van de meest dynamische en heterogene eiwitten) (figuur 4) 4,5,29,52 Zelfs 28 kDa lipidevrij apolipoproteïne A-1 (Figuur 2L) en GroEL en Proteasomen (Figuur 2M en N). Andere voorbeelden van OPN als een high-throughput werkwijze onderzoeken eiwit-eiwit interacties blootleggen van het eiwit mechanismen, zoals 53 kDa CETP. Zoals beschreven in de inleiding, hoe CETP interageert met verschillende subklassen van lipoproteïnen waren ONDERZOEKted via het onderzoek van meer dan 400 EM exemplaren 6 Voor zover wij weten, was er geen dergelijk geval van cryo-EM studie die screening betreft bijna honderd verschillende aandoeningen. OPNS kan EM grenzen uit te breiden naar kleine en asymmetrische eiwitten 3D-structuur te bestuderen en zelfs uit te breiden naar te bereiken 3D-structuur vormen een enkele en individuele eiwit (zonder gemiddeld). Bijvoorbeeld, IgG antilichaam 160 kDa molecuul met een zeer flexibele structuur, waarbij de 3D reconstructie op tussenliggende resolutie uitdagend te bereiken. de OPNS methode werd gebruikt om het individuele IgG antilichaam uit een reeks kantelbare hoeken (Figuur 4E en H). De redelijk hoge-resolutie en een hoog contrast eiwit beelden van OPNS toegestaan ​​voor de succesvolle wederopbouw van een enkel eiwit door individueel deeltje electron tomography (IPET) (Figuur 4E - J) 4,5. In IPET 3D reconstructie <sup&gt; 4 werden de 2D tilt reeks gerichte antilichaam geleidelijk aangepast naar berekende wereldcentrum vervolgens via iteratieve reconstructie van een 3D dichtheid heeft bij een resolutie van ~ 14,1 Å (Figuur 4F en G) 4. Door dezelfde aanpak, werd een enkel antilichaam-peptide complex gereconstrueerd, en de peptide geïnduceerde het interne domein conformationele verandering van een enkel antilichaam deeltje ontdekt werd (Figuur 4I en J, resolutie ~ 16,6 Å) 4,5. Het vergelijken van de 3D-reconstructies van verschillende individuele deeltjes, kan de structurele analyse kunnen we eiwit thermodynamische fluctuaties te onthullen, en zelfs &quot;snap-shot&quot; de tussenliggende stadia van een chemische reactie 4,5,29,53,54. Samengevat, de eiwitten met een molecuulgewicht tussen 40 kDa - 200 kDa zijn uitdagend voor standaard EM structurele onderzoeken en reconstructies. Aangezien meer dan 50%van eiwitten hebben moleculaire massa variërend 40-200 kDa 1,2, melden wij een OPNS methode als een robuust en high-throughput hulpmiddel om de conventionele EM grens te duwen in de richting van de kleine en asymmetrische structurele bepalingen en zelfs mechanistische studies. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur 1 Rouleau artefact van lipoproteïnen met gebruikelijke negatieve kleuring (NS) EM. Electronenmicroscoop (boven panelen) en geselecteerde deeltjes (hieronder panelen) tonen verschillende lipoproteïnen met rouleaux na NS met fosfowolfraamzuur (PTA) onder standaard mix procedure. (A) Geregenereerd HDL (rHDL) met ApoE4, (B) apoA-I-bevattend 9.6 nm discoïdale rHDL, (C) apoB met plasma LDL, (D) niet-apolipoproteïne bevatten POPC liposomen. Bars: 50 nm. Venstergrootte: A en C, 20 nm; B, 30 nm. De Journal of Lipid Research aanvankelijk publiceerde dit werk 29,30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig2highres.jpg" width="500" /> Figuur 2 Eiwitstructuur door geoptimaliseerde negatieve kleuring (OPN) EM Electron microfoto tonen verschillende lipoproteïnen en liposomen zonder rouleaux artefact door OPNS (A) apoE4 bevattende rHDL;.. (B) 7,8 nm rHDL; (C) 8.4 nm rHDL; ( D) 9,6 nm rHDL; (E) 9.3 nm sferische rHDL; (F) Menselijk plasma α-HDL, (G) Plasma HDL; (H) Menselijk plasma LDL; (I) Menselijk plasma IDL; (J) Menselijk plasma VLDL; <strong&gt; (K) POPC liposomen, (L) lipidevrij apoA-I. Extra controle werd gedaan met behulp van (M) GroEL en (N) Proteasome monsters. Microfoto (boven panelen) en de geselecteerde deeltjes (hierna panelen). Bars: 50 nm. Vensterafmetingen: A - D, 20 nm; E en F, 25 nm; G, 20 nm; H, 25 nm; I, 50 nm; J en K, 100 nm; L, 80 nm., Behalve lipide gratis apoA-I, GroEL en Proteasome, Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in het Journal of Lipid Research 29,30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig3highres.jpg" width="500" /> Figuur 3 OPNS electronenmicroscoop van CETP. (A) Overzicht microscoop met CETP (gestippelde cirkels) banaan gevormde deeltjes. (B) windowed rauw deeltjes. (C) Drie enkele ruwe CETP deeltje beelden die duidelijk groter, zwaarder en groter bolvormige uiteinde waaronder de andere kleinere, lichtere en smallere uiteinde (linker paneel), bovenaanzicht dat soortgelijke eindstandige gebieden met minder totale kromming (middle panel) en eindaanzicht langs de lengteas van CETP (rechterpaneel) (D) superponeren de kristalstructuur (VOB. 2OBD) op deze grondstoffen CETP deeltje beelden, past goed in zowel structurele vorm en maat domein waarin de oriëntatie kan worden vrijwel direct gedefinieerd zelfs zonder hulp van computer (overeenkomend panelen (C)). (E) Referentie vrije 2D klasgemiddelden (ab initio een proces om de gelijkenissen (kruiscorrelatie berekening) van deze willekeurig georiënteerde deeltjes berekenen, de deeltjes een hoge gelijkenis met elkaar werden gegroepeerd, uitgelijnd en vervolgens gemiddeld om de ruis te verminderen en versterkt de particle image contrast. De referentie-vrije 2D klasse gemiddelden worden berekend door refine2D.py software in de EMAN pakket, waarin, geen een mens gemaakt initiële model betrokken was in deze klasse gemiddelde. De gemiddelden referentie klasse kan worden gebruikt als een onafhankelijke methode om de 3D ​​reconstructie van onafhankelijke deeltjes reconstructie valideert). (F) zetten referentie free 2D klasgemiddelden tonen een groter distaal uiteinde tegenover de andere. (G) Bovenop kristalstructuur (PDB : 2OBD) ten opzichte van de referentie-vrije gemiddelden, de overlay-beelden tonen een bijna perfecte matches tussen kristal-structuur en-referentie-vrije klasse gemiddeld in zowel vorm structuur en het domein grootte (laag paneel) (F) 3D-dichtheid kaart van CETP in een. resolutie van 13 Å werd gereconstrueerd uit 8879 deeltjes afgebeeld door OPNS en single-deeltje reconstructie methode (bovenste paneel) en de geribbelde lichaam aangemeerd in deze single-deeltje reconstructie door de kristalstructuur (laag paneel). De detscheelde informatie van de ene deeltje reconstructie, inclusief Afbeeldingen voorbewerken, eerste model, verfijning procedures, stralend en Fourier Shell Correlatie (FSC) werden gepubliceerd in het hoofdstuk methode en ondersteunende informatie van de originele papieren (H) Final vergelijking van enkel deeltje reconstructie ( boven paneel) en aanvullende VOB fit vergelijking (onderste paneel) 6. Bars: A, 50 nm; B - D, 10 nm; F, 3 nm. Sommige van deze cijfers werden eerder gepubliceerd in de Nature Chemical Biology 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig4highres.jpg" width="500" /> Figuur 4 OPNS beelden en reconstructies van Human IgG 1 antilichaam deeltjes. (A) danvisie op de menselijke IgG1 antilichaam OPNS beelden. Deeltjes die in witte cirkels duidelijk de deeltjes weer met 3 subdomeinen. (B) Geselecteerde ruwe beelden met een hoge resolutie van vijf individuele niet-geconjugeerd antilichaam deeltjes en (C) de bijbehorende geluidsarme beelden door handmatig het verminderen van geluidsoverlast rond rauwe deeltje rand (zonder contact komen met een dichtheid in de deeltjes) om gemakkelijk te visualiseren. (D) De kristalstructuur (VOB binnenkomst 1IGT) van IgG1 antilichaam dat is gericht op een even kijken naar de EM beelden. Vergelijking van de bijbehorende beelden toont vele gemeenschappelijke kenmerken tussen de EM imago en de kristalstructuur, inclusief domeinnaam posities en vormen. (E) De stap-voor-stap procedure van een ab initio 3D-reconstructie van een enkel exemplaar IgG1 antilichaam (geen gemiddelde, een afzonderlijk object) met afzonderlijke deeltjes electron tomography (IPET methode). (F) De definitieve 3D-reconstructie van een single antilichaam deeltje met een resolutie van 14,1 Å toonde drie donut vormige domeinen vormen in een &quot;Y&quot; vorm. (G) Docking de domeinen kristalstructuren in elk van overeenkomstige domeinnaam density maps respectievelijk, en handmatig het herhalen van de lussen tussen de domeinen. (H) De stap-voor-stap procedure van 3D-reconstructie van een IgG-peptide complex (geen gemiddelde, een individueel object) door IPET. (I) De laatste 3D-reconstructie van een IgG-peptide complex werd getoond met een resolutie van 16,6 Å toonde drie rod vormige domeinen vormen in een &quot;Y&quot; vorm (J) Respectievelijk docking de kristalstructuur van elke IgG antilichaam domeinen (VOB entry: 1IGT). staafvorm in elk dichtheden toonde een slecht passend bij domein kristalstructuren, suggereert een binnenste domein conformatieverandering na peptide conjugatie. De gedetailleerde procedure resolutie analyse en statistieken werden in de originele papieren beschreven <sup&gt; 5 Bars: A, 50 nm; B - D, 10 nm. Dit werk in eerste instantie gepubliceerd in PLoS ONE 4 en wetenschappelijke rapporten 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig5highres.jpg" width="500" /> Figuur 5 Vermogen spectrum van amorfe koolstof film belicht onder 1,6 micrometer defocus door een Zeiss Weegschaal 120 LaB6 TEM. Hoge-resolutie imaging voldoende bewijs om aan te tonen dat EM heeft de juiste uitlijning en een hoge resolutie capaciteit vereist. De analyse van het vermogensspectrum van koolstof nabije omgeving van het raster op een efficiënte manier de bundel samenhang voorwaarde voor gegevensverwerving controleren. Fourier overdracht van het beeld van een amorfe koolstof geven aan welke soortgelijk instrument contrast overdrachtsfunctie (C<html> TF), zogenaamde Thon-ringen. Een goede afstemming en samenhang kan worden gereflecteerd door het aantal zichtbare Thon-ringen en de hoogste resolutie van zichtbare Thon ringen onder een relatief hoge defocus conditie. Als voorbeeld van een bijna juiste uitlijning toestand van een LaB 6 filament uitgerust TEM, meer dan ~ 20 Thon ringen (~ 5 A) kunnen uit een koolstoffilm worden afgebeeld op 1,6 urn defocus middels dosis 20,4 E - / Å 2. De Thon ringen bereikt met een low-end TEM hebben vergelijkbaar met die van high-end TEM, zoals een veld-emissie (FEG) meer TEM uitgevoerd onder goede uitlijning aandoening. Dit werk in eerste instantie gepubliceerd in Scientific Reports 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig5highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> 6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figuur 6 Voorbeeld microfoto van &quot;ideaal&quot; gebieden OPNS beeldvorming. Drie eiwitmonsters, (A) GroEL (B) Proteasome (C) Sferische HDL, werden gebruikt als voorbeelden om de ideale OPNS voor beeldvorming tonen. Sinds vlekken ongelijk verdeeld in het monster, de lage vergroting van het monster verschijnt meestal &quot;troebel&quot; (meest linker paneel). De ideale gebieden voor imaging bevinden zich normaal gesproken in de grenzen van deze &quot;wolken&quot;. Een voorbeeld van een stap-voor-stap-zoom-in one &quot;bewolkt&quot; vlek regio (links midden paneel) tonen de sterk vergrotende beelden die zich presenteren met een hoge resolutie en een hoog contrast van deeltjes (rechts midden paneel). Geselecteerde beelden van deeltjes tonen de structuur details van de eiwitten (rechterpaneel). Bars:. 30nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig6highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grote foto</a>r versie van deze figuur. <img alt="Figuur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig7highres.jpg" width="500" /> Figuur 7 een schematisch diagram van OPN procedures. (A) EM rooster incubatie station, eenvoudig station naar de oplossing van het monster op de gloed-ontladen raster uitbroeden. (B) kleuring werkstation, ontworpen om te wassen met water druppels en vlekken druppeltjes boven een ijs bed te behouden, terwijl het minimaliseren van de blootstelling aan licht vlek. (C) Overzicht van kleuring procedure illustreert: blotting richting, 3x spoelen met water, 3x UF vlek blootstelling Staining incubatie met omgekeerde monster raster vlek druppeltjes en definitieve achterzijde monster blotting een dun laagje monster kleuroplossing voor droging door stikstof lucht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig7highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van th bekijken</a>is figuur. <img alt="Figuur 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig8highres.jpg" width="500" /> Figuur 8 Hoge - resolutie afbeeldingen van 53kDa kleine eiwit CETP bleek uit een gemodificeerde OPNS methode, cryo-positieve-kleuring (cryo-PS) Vijf selecteren met een hoge resolutie en ronde vorm zacht gemaskerde ruwe beelden van CETP deeltjes (met omgekeerd contrast). en korrelvorm gemaskeerd ruwe deeltjes (handmatig minder ruis omliggende randen ruwe deeltje beelden &#39;, maar zonder het wijzigen van een dichtheid binnen de deeltjes) om gemakkelijk te visualiseren. All-atoom en lint kristalstructuur vergelijking met ruwe deeltjes afgestemd op gelijkaardige oriëntaties van elk deeltje aan EM beelden gemaskeerd. De hoge-resolutie gegevens afbeeldingsgebieden ruwe vertonen bepaalde overeenkomsten met de kristalstructuur, maar niet alle kristalstructuur functies kunnen worden opgelost uit ruwe data. Remarka<html> bly, deze ruwe beelden tonen gelijkenis in beide uiteinden met nabijgelegen kleine ronde gaten gezien in de hand verminderd ruis (driehoeken); Bovendien, de strengen in de C-terminale gebieden binnen deeltjesgrootte beelden compleet kristalstructuur β-sheets (pijlen) en tenslotte uitstekende lussen op de CETP C-terminale gebied zijn verwant aan in de kristalstructuur (ruiten). (A) Vijf select zachte gemaskerde ruwe beelden met een hoge resolutie en de ronde vorm van CETP deeltjes (met omgekeerd contrast). (B) laagdoorlaatfilter tot 10A. (C) Hogere laagdoorlaatfilter 20A. (D) Gemaskerde handmatig ruis verminderd beelden. (E) kristalstructuur vergelijking door lintstructuur. (F) Crystal structuur vergelijking van alle atoom vertegenwoordiging. Bar: 5nm. Een deel van dit werk werd gepubliceerd in Nature Chemical Biology 6.lank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <img alt="Figuur 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51087/51087fig9highres.jpg" width="500" /> Figuur 9 Electron microfoto van liposomen tonen rouleau vorming door conventionele NS-protocol (PTA vlek) onder verschillende zoutgehalte. (A) met een hoog zoutgehalte (~ 0,5 MNaCl). (B) Reguliere zoutgehalte (~ 0,25 M NaCl). (C) Laag zoutgehalte (~ 0,1 M NaCl). (D) Zuiver water. Micrografen (boven paneel) en selecteer windowed deeltjes (hieronder paneel) getoond. Bars: 100 nm. Venster grootte: 80 nm. De Journal of Lipid Research oorspronkelijk gepubliceerd dit werk 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51087/51087fig9highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Meer dan de helft van de eiwitten zijn kleine eiwitten (moleculaire massa &lt;200 kDa) die zijn uitdagend voor zowel de elektronenmicroscoop beeldvorming en driedimensionale reconstructies. Geoptimaliseerde negatieve kleuring is een robuuste en high-throughput protocol hoog contrast en relatief hoge resolutie (~ 1 nm) beelden van kleine asymmetrische eiwitten of complexen onder verschillende fysiologische omstandigheden te verkrijgen.

Geoptimaliseerd Negatieve kleuring: een High-throughput protocol voor de behandeling Kleine en Asymmetric Protein Structure door Electron Microscopy

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Het algemene doel van deze procedure is het afbeelden van kleine en asymmetrische eiwitten met behulp van een hoog-doorvoer geoptimaliseerd protocol voor negatief kleurings elektronenmicroscopie. Dit wordt bereikt door het eiwit eerst te incuberen in een voorbereid incubatiestation, terwijl een werkstation voor negatief kleuren wordt klaargemaakt. De tweede stap van de procedure is het snel wassen van het monster op drie opeenvolgende waterdruppels.De derde stap is om het monster zorgvuldig en opeenvolgend in drie druppels kleurstof te kleuren. De laatste stap is het verwijderen van het overtollige oplosmiddel door de achterkant van het EM-grid droog te deppen en vervolgens voorzichtig te laten drogen onder stikstofgas. Uiteindelijk kunnen de resultaten beelden met een hoge resolutie van kleine eiwitten laten zien via TEM-imaging onder een lage defocusconditie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van cryo-elektronenmicroscopie is vastgesteld. Het maakt high-throughput onderzoek en contrastrijke beeldvorming van kleine en asymmetrische proteïnestructuren mogelijk, terwijl structurele artefacten door conventionele negatiefkleuring worden verminderd. Deze methode kan inzicht bieden in de structurele basis van mechanismen van kleine proteïnen, zoals het cholesterylestertransferproteïne.Het kan ook worden toegepast op andere eiwitten, zoals IgG1-antilichamen, high-density lipoproteïnen en het proteasoom, die sterk variëren in grootte. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de was- en kleuringsstappen moeilijk aan te leren zijn vanwege variaties in timing, en zelfs het droogdeppen van monsters drastische effecten kan hebben op het uiteindelijke gekleurde eiwit. De demonstratie van de procedure zal worden bijgewoond door Z.A., een onderzoeker uit mijn laboratorium. Bij de voorbereiding van dit protocol is het noodzakelijk om een 1% urinalformaldehyde-oplossing te maken, waarbij uiterste zorg moet worden besteed aan het minimaliseren van de blootstelling aan licht.Dit omvat het in folie wikkelen van de onderdelen van het spuitfilter van 0,2 micron wanneer de oplossing voor het eerst gefilterd moet worden. Bewaar na filtering op de dag van het experiment aliquoten van twee milliliter in folie omwikkelde vials bij -80 °C. Ontdooi een aliquot in een waterbad op kamertemperatuur tot deze volledig is ontdooid.Filter het opnieuw door een 0,02 micron filter waarbij de onderdelen in folie zijn gewikkeld. Het opvangbuisje moet ook in folie worden gewikkeld. Breng de negatieve kleuring over naar een koelbox tot het wordt gebruikt.Maak een houderplaat voor druppels door een stuk parafilm van acht inch op een steun voor pipetteertips te drukken. Hierdoor ontstaan inkepingen die dienen als putjes met een diameter van vijf millimeter. Maak zes rijen putjes, strijk het ijs op het oppervlak van een styrofoam bak glad en plaats vervolgens de plaat op het ijs.Voeg vervolgens 35 µL DI-water toe aan de eerste drie putjes aan de linkerzijde van de plaat. Vul daarna de drie rechterputjes van de plaat met 35 µL van de bereide negatieve kleuringsoplossing. Dek het tray af om de blootstelling van de oplossing aan licht te minimaliseren.Dit dient als kleurstation. Bereid nu een incubatiestation voor EM-roosters met een lege pipetpuntendoos en een bevestiging waarop pincetten gemonteerd kunnen worden. Vul de doos voor de helft met ijs, zodat het ijsoppervlak dicht bij de punt van de pincetten ligt wanneer deze zijn gemonteerd.Voer eerst een glow discharge uit op de met een dunne koolstoflaag gecoate koperen EM-grids van 300 mesh gedurende ongeveer 10 seconden. Pak vervolgens met een pincet, dat is bevestigd aan het incubatiestation voor EM-grids, een grid op. Hang het pincet met het grid zodanig op dat het grid in een hoek van 45 graden een halve inch boven het ijs hangt.Verdun nu het eiwitmonster in DPBS tot een concentratie van 50 tot 100 micrograms eiwit per milliliter oplossing. Breng onmiddellijk ongeveer vier microliters van de verdunning aan op het EM-raster. Laat het monster ongeveer een minuut incuberen.Dep na één minuut het gaas snel af met filterpapier om overtollige oplossing te verwijderen. Raak vervolgens bij het kleurstation met het gaas de eerste waterdruppel op de parafilm aan. Herhaal dit proces van het drogen van het filter en het bevochtigen ervan met de volgende druppel snel.Gebruik in totaal drie waterdruppels en voer dit zo snel mogelijk uit. Het wassen van het raster met water moet snel gebeuren om nadelige effecten van de bufferwijziging op het eiwit te voorkomen. Nadat de laatste spoeling binnen drie seconden is drooggedept, wordt het raster op de eerste druppel negatieve contrastvloeistof geplaatst.Laat het daar 10 seconden drijven. Reinig ondertussen de pincet door de punten in filterpapier te drukken. Blot na het tien seconden drijven een paar keer de oplossing weg met filterpapier en begin opnieuw met drijven in de volgende druppel kleurstof gedurende twee seconden.Reinig de pincet gedurende twee seconden. Dep vervolgens het raster droog en plaats het op de derde druppel. Bedek tijdens deze stap het kleurstation gedurende een volledige minuut.Het verwijderen van de kleuring moet gebeuren door de achterzijde van het EM-grid gedurende een nauwkeurige tijd aan te raken om te garanderen dat het grid gelijkmatig droogt. Als het filterpapier te lang in contact blijft met de kleuring, kan er te veel kleurstof worden verwijderd, wat leidt tot een slechte beeldkwaliteit. Ga vervolgens verder met het drogen van het grid.Raak eerst de volledige niet-koolstofzijde aan het filterpapier tot de oplossing is overgedragen. Pas vervolgens een zachte stroom nitrogeneen toe. Breng het raster nu over naar een schaal bekleed met filterpapier en dek de schaal gedeeltelijk af.Laat het raster 30 minuten bij kamertemperatuur in de schaal drogen. Als alternatief kunnen monsters die lipiden bevatten een uur lang worden gebakken bij 40 °C. Zodra ze volledig zijn opgedroogd, wordt het EM-raster overgebracht naar een bewaardoos voor EM-rasters voordat men begint met het uitlijnen van de TEM.Controleer de resolutie van de hoogste zichtbare dooi-ring met het powerspectrum van een koolstoffilmgebied van het negatief gekleurde rooster, welke beter moet zijn dan de beoogde resolutie. Controleer vervolgens, om de uitlijning aan te passen, zorgvuldig het powerspectrum op het koolstoffilmgebied van het preparaat. Bij een correcte uitlijning kunnen meer dan 20 Thon-ringen worden gevisualiseerd, wat overeenkomt met een visualisatie van beter dan vijf angstrom.De ringen werden gemaakt door een Fourier-transformatie van een amorf koolstofbeeld bij een defocus van 1,6 microns en een dosis van 20,4 elektronen per vierkante Angstrom. Breng de focus nu terug naar een conditie nabij de Scherzer-focus van ongeveer 0,1 micrometers voor het afbeelden van kleine eiwitten tijdens het onderzoek van het EM-rooster. Idealiter bevinden gekleurde gebieden zich bij een lage vergroting meestal nabij de rand van dikkere, gekleurde wolkachtige gebieden.De structuur van lipoproteïnesamples werd bekeken met OPNS. Voorbeelden hiervan zijn recombinant HDL, menselijk plasma, LDL, IDL uit menselijk plasma en VLDL uit menselijk plasma. Kleinere structuren, zoals CETP van 53 kilodalton, werden ebenfalls bekeken.Dit is een van de kleinste proteïnen die met succes zijn afgebeeld via eem. De superpositie van de CETP-kristalstructuur komt zeer goed overeen met het beeld, wat zeer dynamisch is. Heterogene proteïnen werden eveneens bekeken in immunoglobulin G-antilichamen van 160 kilodalton.Drie subdomeinen waren duidelijk zichtbaar. Bij een nauwere bestudering van het IgG1-antilichaam werd een vergelijking gemaakt met de kristalstructuur ervan. De kristalstructuur van het IgG1-antilichaam komt op veel vlakken overeen met het EM-beeld van deze antilichamen, zoals in de posities van de domeinen en hun vormen.Andere gevisualiseerde moleculen omvatten 28 kilodalton, lipid-vrij apolipoproteïne A-I grow EL en proteasomen. In essentie breidt de OPNS-methode de grenzen van EM-imaging voor kleine asymmetrische structuren en bijbehorende mechanistische studies aanzienlijk uit. Tijdens het uitvoeren van de procedure is het belangrijk om de blootstelling van het kleurmiddel aan licht zoveel mogelijk te beperken, het monster snel te wassen en near-treasure focus te gebruiken voor de beeldvorming na deze procedure.Andere methoden, zoals elektrontomografie, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de structuren van enkelvoudige moleculen met nanometerresolutie en de conformationele veranderingen daartussen. Na deze ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers in het veld van de structurele biologie om de mechanismen van clusteresteroverdracht tussen menselijke plasmalipoproteïnen te onderzoeken.

optimized-negative-staining-high-throughput-protocol-for-examining

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Dit artikel beschrijft een standaard methode om een ​​drie-dimensionale (3D) reconstructie van biologische macromoleculen met behulp van negatieve kleuring van elektronenmicroscopie (EM) te krijgen. In dit protocol leggen we uit hoe u de 3D-structuur van de Saccharomyces cerevisiae exosome complex krijgen op medium resolutie met behulp van de random conische kantel reconstructie methode (RCT).

Single Particle Electron Microscopy Reconstructie van de Exosome Complex Met behulp van de Random conische Tilt Methode

Visualiseren eiwit monsters door negatieve kleuring elektronenmicroscopie (EM) is uitgegroeid tot een populaire structurele analyse-methode. Het is nuttig voor kwantitatieve structurele analyse, zoals het berekenen van een 3D-reconstructie van de moleculen wordt bestudeerd, en ook voor kwalitatieve onderzoek naar de kwaliteit van het eiwit preparaten. In dit artikel geven we gedetailleerde protocollen voor de voorbereiding van de EM roosters, het kleuren van de steekproef en visualiseren van...

Het visualiseren van Eiwitten en macromoleculaire complexen door Negative Stain EM: van Grid Voorbereiding op Image Acquisition

This video describes a procedure for negative staining of purified exosomes. The negatively stained exosomes are imaged using transmission electron microscopy. This technique helps visualize the morphology of exosomes.

Negative Staining of Purified Exosomes: A Procedure to Visualize Exosome Morphology Using Transmission Electron Microscopy

Veel eiwitten voeren hun functie uit wanneer ze aan membraanoppervlakken zijn gehecht. De binding van extrinsieke eiwitten op nanodisc-membranen kan indirect worden afgebeeld door transmissie-elektronenmicroscopie. We laten zien dat de karakteristieke stapelvorming (rouleau) van nanodiscs, veroorzaakt door de negatieve kleuring natriumfosfowolframaat, wordt voorkomen door de binding van extrinsiek eiwit.

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Negatieve vlek EM is een krachtige techniek voor het visualiseren van macromoleculaire structuur, maar verschillende kleuring technieken wisselende resultaten kunnen produceren in een monster afhankelijke wijze. Hier zijn verschillende negatieve kleuring benaderingen in detail te bieden een eerste workflow voor het aanpakken van de visualisatie van uitdagende systemen beschreven.

Variaties op negatieve vlek elektronenmicroscopie methoden: Tools voor de aanpak van de uitdagende systemen

Een instrument en methoden voor de bereiding van de monster nanoliter middelgrote volumes voor transmissie-elektronenmicroscopie wordt gepresenteerd. Er zijn geen papier-bevlekken stappen vereist, dus het vermijden van de schadelijke gevolgen dat voor eiwitten hebben kan, aanzienlijk verminderen monster verlies en de analyse van eencellige lysate voor visuele proteomics inschakelen.

Verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft technieken gebruikt om te bepalen van ion kanaal structuren door cryo-elektronenmicroscopie, met inbegrip van een systeem van de baculovirus gebruikt om genen in zoogdiercellen met minimale inspanning en toxiciteit, eiwit winning, zuivering, efficiënt en kwaliteit controleren, Raster monstervoorbereiding en screening, evenals gegevensverzameling en verwerking.

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft de cryoAPEX-methode, waarbij een APEX2-gelabeld membraaneiwit kan worden gelokaliseerd door transmissieelektronenmicroscopie binnen een optimaal bewaarde celultrastructuur.

De CryoAPEX-methode voor elektronenmicroscopieanalyse van membraaneiwitlokalisatie binnen ultrastructureel bewaarde cellen

Structuurbepaling van macromoleculaire complexen met behulp van cryoEM is routine geworden voor bepaalde klassen van eiwitten en complexen. Hier wordt deze pijplijn samengevat (monstervoorbereiding, screening, gegevensverzameling en -verwerking) en worden lezers gericht op verdere gedetailleerde bronnen en variabelen die kunnen worden gewijzigd in het geval van meer uitdagende exemplaren.

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Dit protocol presenteert een praktische methode met Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) als voorbeeld om ongelijke deeltjesverdeling aan te pakken door optimalisatie van de monstervoorbereiding, en biedt een referentie voor onderzoekers om macromoleculaire structuren efficiënt op te helderen met behulp van cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM).

Optimalisatie van monstervoorbereiding voor cryogene elektronenmicroscopie

Leer een geoptimaliseerd negatief kleuringsprotocol voor kleine en asymmetrische eiwitten met elektronenmicroscopie. Deze methode biedt hoge doorvoer en contrastrijke beelden voor structurele biologie.

Geoptimaliseerd Negatieve kleuring: een High-throughput protocol voor de behandeling Kleine en Asymmetric Protein Structure door Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal

Geoptimaliseerd Negatieve kleuring: een High-throughput protocol voor de behandeling Kleine en Asymmetric Protein Structure door Electron Microscopy

Meer video's verkennen