Geoptimaliseerd Negatieve kleuring: een High-throughput protocol voor de behandeling Kleine en Asymmetric Protein Structure door Electron Microscopy

Het algemene doel van deze procedure is om kleine en asymmetrische eiwitten te beeldvormen met behulp van een geoptimaliseerd protocol voor negatieve kleuring in elektronenmicroscopie met hoge doorvoer. Dit wordt bereikt door het eiwit eerst in een voorbereide incubatiestation te incuberen terwijl een werkstation voor negatieve kleuring wordt voorbereid. De tweede stap van de procedure is om het monster snel op drie waterdruppels achtereenvolgens te wassen.

De derde stap is om het monster zorgvuldig op drie kleidruppels achtereenvolgens te kleuren. De laatste stap is om de overtollige oplossing te verwijderen door te blotten vanaf de achterkant van het EM-raster en vervolgens voorzichtig te drogen onder stikstofgas. Uiteindelijk kunnen de resultaten hoge resolutiebeelden van kleine eiwitten laten zien door TEM-beeldvorming onder een lage defocuseerconditie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van cryo-elektromicroscopie is ingesteld. Het kan hoge doorvoeronderzoek en hoog contrast beeldvorming van kleine en asymmetrische eiwitstructuren mogelijk maken terwijl het de structuurartefacten van conventionele negatieve kleuring vermindert. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de structurele basis voor kleine eiwitmechanismen zoals het cholesterolesteroverdrachtseiwit.

Het kan ook worden toegepast op andere eiwitten zoals IgG één antilichaam hoge dichtheid lipoproteïne en proteasoom, die sterk variëren in grootte. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de was- en kleurstofstappen moeilijk te leren zijn vanwege variatie in timing en zelfs kletsen van het monster kan dramatische effecten hebben op het voltooide gekleurde eiwit. Demonstreren van de procedure zal worden gemist onder Z.A. onderzoeksmedewerker van mijn laboratorium. Bij het voorbereiden van dit protocol is het noodzakelijk om 1% urinal vorm acht oplossing met de grootste aandacht te maken om de blootstelling aan licht te minimaliseren.

Dit omvat het verpakken van de spuit N 0,2 micron filteronderdelen in folie wanneer het tijd is om de oplossing voor het eerst te filteren. Na het filteren, bewaar twee milliliter folie verpakte flesjes op negentig graden Celsius op de dag van het experiment. Ontdooi een portie in een waterbad op kamertemperatuur eenmaal volledig ontdooid.

Filter het opnieuw door een 0,02 micron filter met delen verpakt in folie. De verzamelfles moet ook in folie worden verpakt. Breng de negatieve kleurstof over naar een ijsbox totdat deze wordt gebruikt.

Maak een druppelhoudend blad door een achtduim lengte van param op een pipettentipsteun te drukken. Dit maakt wegbakken die dienen als vijf millimeter diameter putjes. Na het maken van zes rijen putjes, vlak de ijs op het oppervlak van een piepschuimlade en plaats het blad vervolgens op het ijs.

Voeg vervolgens 35 microliters DI-water toe aan de eerste drie putjes van het blad aan de linkerkant. Laad vervolgens de drie rechter putjes in het blad met 35 microliters van de bereide negatieve kleurstofoplossing. Bedek de lade om lichtblootstelling aan de oplossing te minimaliseren.

Dit zal dienen als kleurstation. Bereid nu een EM-rasterincubatiestation voor vanuit een lege pipettentipsbox met een bevestiging waarop pincetten kunnen worden gemonteerd. Vul de doos voor de helft met ijs zodat het ijsoppervlak dicht bij de punt van de pincetten staat wanneer ze zijn gemonteerd.

Ontlaad eerst de dunne koolstof gecoate 300 mesh koper EM-rasters gedurende ongeveer 10 seconden. Neem vervolgens een raster op met pincetten die haaks op de EM-rasterincubatiestation kunnen worden gemonteerd. Hang de pincetten met het raster, zodat het raster in een hoek van 45 graden een halve inch boven het ijs hangt.

Verdun nu het eiwitmonster in DPBS bij 50 tot 100 microgram eiwit per milliliter oplossing. Breng onmiddellijk ongeveer vier microliters van de verdunning aan op het EM-raster. Laat het monster ongeveer een minuut incuberen.

Na een minuut, dop snel het gaas met filterpapier om overtollig oplossing te verwijderen. En vervolgens bij het kleurstation, raak het gaas aan met de eerste druppel water op de parafilm. Herhaal snel het proces van het drogen van het filter en het retting met de volgende druppel.

Gebruik een totaal van drie waterdruppels en doe dit zo snel mogelijk. Het wassen van het raster met water moet snel worden gedaan om nadelige effecten van bufferverandering op het eiwit te voorkomen. Na het afvegen van de laatste wasbeurten binnen drie seconden, begin met het drijvend maken van het raster op de eerste druppel negatieve kleurstofoplossing.

Laat het daar drijvend blijven gedurende 10 seconden. Maak ondertussen de pincetten schoon door de punten in filterpapier te drukken. Een paar keer na de tien seconden drijftijd, blot de oplossing met filterpapier af en start een andere drijftijd in de volgende druppel kleurstof gedurende twee seconden.

Reinig de pincetten gedurende de twee seconden. Dep vervolgens het raster droog en plaats het op de derde druppel. Voor een volle minuut dek de kleurstation af tijdens deze stap.

Het verwijderen van de kleur moet worden gedaan door de achterkant van het EM-raster gedurende een precieze hoeveelheid tijd aan te raken om ervoor te zorgen dat het raster gelijkmatig is gedroogd. Als het filterpapier te lang in contact komt met de kleur, kan er te veel kleur worden verwijderd, wat leidt tot slechte beeldvorming. Ga vervolgens verder met het drogen van het raster.

Raak eerst de volledige niet-koolstof kant aan met het filterpapier totdat de oplossing is overgebracht. Tweede, breng een zachte stroom stikstofgas aan. Breng nu het raster over naar een schaal bekleed met filterpapier en bedek de schaal gedeeltelijk.

Laat het raster 30 minuten op kamertemperatuur in de schaal drogen. Alternatief kunnen lipidehoudende monsters worden gebakken bij 40 graden Celsius gedurende een uur. Zodra het volledig is opgedroogd, brengt u het EM-raster over naar een EM-rasteropslagdoos voordat u begint, het TEM