Name: Optimalisatie van hoogwaardige glioomcelcultuur van chirurgische specimens voor gebruik in klinisch relevante diermodellen en 3D-immunochemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-07T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Leer hoe je hoogwaardige glioomcelcultuur optimaliseert van chirurgische specimens voor klinisch relevante diermodellen en 3D-immunochemie. Deze methode behoudt moleculaire tumorkenmerken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk is gefinancierd door het Hermelin Brain Tumor Center, Henry Ford Hospital.

1. Eencellige suspensie van verse chirurgische glioblastoom specimen voor neurosfeer cultuur
<ol><li>Met schriftelijke toestemming van patiënten en in overeenstemming met institutionele richtlijnen, tumormonsters verzamelen voor celkweek onmiddellijk na resectiechirurgie van hoogwaardig glioom.</li>
	<li>Bevestig de diagnose van tumormonster door histopathologie. Transporteer het monster onmiddellijk van de operatiekamer naar de laminaire flow weefselkweekkap, voor verwerking binnen 1 uur na de operatie. OPMERKING: Snijd voor operaties op een afgelegen locatie het tumormonster in kleinere fragmenten en plaats het in een buis met DMEM/F12 (houd het op ijs). De tumor kan enkele uren na de operatie worden verwerkt.</li>
	<li>Begin met 200-500 mg weefsel (optimaal), gehakt het tumormonster met behulp van een scalpelblad en breng het over naar een buis van 15 ml met 10 ml DMEM/F12 serumvrij medium. Meng door meerdere keren om te keren, laat de tumor stukjes sedimenteren door zwaartekracht, verwijder medium en herhaal indien nodig.</li>
	<li>Bereid de enzymatische weefseldissociatieoplossing en stopoplossing vers.<ol>
<li>Enzymatische weefseldissociatieoplossing: 5 ml 0,05% Trypsine-EDTA, 2,5 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) calcium- en magnesiumvrije, 2,5 ml Collagenase IV-stamoplossing (2.000 U/ml in HBSS met calcium en magnesium).</li>
		<li>Stopoplossing: 5 ml Trypsine inhibitoroplossing, 5 ml DMEM/F12, 2 μl van 5.000 U/ml DNAse I (gemaakt in HBSS calcium- en magnesiumvrij).</li>
	</ol></li>
	<li>Verwijder medium en voeg enzymatische weefseldissociatieoplossing toe aan het gehakte tumormonster, met 2 ml voor elk 0,5 g weefsel. Meng voorzichtig door om te keren.</li>
	<li>Incubeer het weefsel in oplossing bij 37 °C in een weefselkweek-incubator onder rotatie gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Trituraat met een pipet van 2 ml en stop de spijsvertering of keer terug naar de incubator voor nog een incubatie van 15-30 minuten, afhankelijk van het niveau van de spijsvertering.</li>
	<li>Stop de spijsvertering door 2 volumes Stop Solution toe te voegen en trituraat mechanisch met een serologische pipet van 5 ml.</li>
	<li>Filtreer het onverteerd materiaal door een celzeef van 40 μm. Pellet de cellen op 800 x g gedurende 5 min op kamertemperatuur, gevolgd door 3x wassen in 10 ml DMEM/F12.</li>
	<li>Resuspend de laatste cel pellet in 5 ml DMEM/F12.</li>
	<li>Leg de celsuspensie langzaam op 5 ml Lympholyte-M en pellet op 1.300 x g gedurende 20 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Breng de interfacelaag met de nucleated cellen over in een buis van 15 ml met 10 ml DMEM/F12.</li>
	<li>Pellet de cellen op 800 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Herhaal de was met DMEM/F12 2x meer.</li>
	<li>Cryopreserve de resulterende enkele cellen voor verder gebruik door resuspending de pellet in Recovery Cell Freezing Medium, aliquoting in cryovials, langzaam invriezen, en opslag in vloeibare stikstof.</li>
	<li>Om te groeien, resuspend de cellen in Neurosphere Medium aangevuld met groeifactoren (NMGF), en plaat met relatief lage dichtheid (<1 x 105 cellen /ml) in een gewone T25 weefselkweek kolf onder standaardomstandigheden, 5% CO2,37 °C, bevochtigde weefselkweek incubator (Figuur 1A).<ol>
<li>Bereid NMGF met behulp van het volgende recept<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="384">
<colgroup>
<col>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;width:188px;">Voor 500 ml DMEM/F12</td>
					<td style="width:79px;"></td>
					<td style="width:117px;"></td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Voorraadoplossing</td>
					<td>volume</td>
					<td>eindconcentratie</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">N2 supplement (10x)</td>
					<td>5 ml</td>
					<td>1x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">250 mg/ml BSA stamoplossing</td>
					<td>1 ml</td>
					<td>0,5 mg/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">10 mg/ml Gentamicine reagens</td>
					<td>1,25 ml</td>
					<td>25 μg/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100x antibioticum/antimycoticum</td>
					<td>2,5 ml</td>
					<td>0,5x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td>100 mg/ml bFGF</td>
					<td>0,1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100 mg/ml EFG</td>
					<td>0,1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
</tbody>
</table>
</li>
	</ol></li>
	<li>Breng neurosferen die zich gedurende 1-3 weken vormen (figuren 1B-E) over in verse kolven, om zich te scheiden van aangekoppelde cellen en vuil. Voer elke 3-4 dagen gedeeltelijke mediawijzigingen uit. OPMERKING: Als orthotopische xenografttumor wordt losgekoppeld met behulp van het bovenstaande protocol, kunnen stappen 1.11-1.13 worden weggelaten.</li>
</ol>2. Glioblastoma Neurosfeer cultuur onderhoud en downstream toepassingen
<ol><li>
Dissociatie: Bewaak de neurosfeerculturen en voer elke 3-4 dagen gedeeltelijke mediumveranderingen uit. Wanneer de meeste meercellige neurosferen in de kolf een diameter van 100 μm bereiken, dissocieren in een eencellige suspensie:<ol>
<li>Breng het medium met de neurosferen over in een buis van 15 ml, zwaartekracht sediment de neurosferen gedurende ongeveer 5 minuten, verwijder het medium en resuspend de celkorrel in 10 ml calcium- en magnesiumvrije DPBS.</li>
		<li>Meng en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, terwijl de cellen sedimenteren door de zwaartekracht.</li>
		<li>Verwijder 7-8 ml DPBS en dissocieert de neurosferen mechanisch met een voorgewette serologische pipet.</li>
		<li>Pellet de gedissocieerde cellen bij 800 x g gedurende 5 min bij 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaging: Resuspend de gedissocieerde cellen (stap 2.1.) in NMGF en verdeel in het benodigde aantal kolven (1:3), en incubeer onder standaardomstandigheden. Secundaire neurosferen zullen zich vormen en moeten vervolgens worden gescheiden voor de vorming van tertiaire sferen.</li>
	<li>
Beoordeling van zelfvernieuwing op lange termijn: Herhaal de dissociatieprocedure totdat de neurosfeercultuur ten minste 10 passages bereikt, wat overeenkomt met minimaal 2 maanden in cultuur.</li>
	<li>
Invriezen: Om de neurosferen te cryopreserveren, de neurosferen te ontkoppelen (stap 2.1.) en de celkorrel opnieuw te gebruiken in Recovery Cell Freezing Medium, aliquot in cryovials, langzaam invriezen en opslaan in vloeibare stikstof.<ol>
<li>Om neurosfeercellen uit een bevroren stam te gekweekt: ontdooi de cellen bij 37 °C en breng onmiddellijk over op een buis van 15 ml met 10 ml DMEM/F12. Meng de buis voorzichtig en draai de cellen vervolgens 5 min op 4 °C op 800 x g. Was de celkorrel nog een keer en resuspend de cellen in NMGF en breng over naar een T25 weefselkweekkolf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Celsuspensie voor intracranieel implantaat bij immuungecompromitteerde muis:<ol>
<li>Dissocieert de neurosferen (stap 2.1.) en resuspendeert de celkorrel in calcium- en magnesiumvrije DPBS. Tel levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer en trypan blauwe uitsluiting.</li>
		<li>Bereken het aantal cellen dat nodig is voor implantaten, meestal 3 x 105 cellen/muis, breng het gewenste aantal cellen over in een flacon en pellet de cellen op 1.000 x g.</li>
		<li>Resuspend de celkorrel in een volume dat geschikt is voor implantatie (5 μl/muis) door zachtjes op de microcentrifugebuis te tikken. Plaats de celsuspensie op ijs en gebruik binnen 2 uur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Alternatief protocol voor het cultiveren van tumorigene glioblastoomcellen (voor de gevallen waarin neurosfeercultuur faalt)
<ol><li>Vul het NMGF-medium aan met foetale runderserum tot een eindconcentratie van 2% FBS/NMGF.</li>
	<li>
Beginnend met cellen in NMGF-cultuur: Oogst levensvatbare cellen uit de NMGF-kolf(figuur 1F),resuspend in 2% FBS/NMGF en plaat met een relatief lage dichtheid (<1 x10 5 cellen/ml) in een gewone T25 weefselkweekkolf, en kweek onder standaardomstandigheden, 5% CO2, 37 °C, bevochtigde weefselkweek incubator (Figuur 1G).</li>
	<li>
Beginnend met bevroren nooit gekweekte cellen (stap 1.14.): Ontdooi de cellen, was in serumvrij medium en plaat in 2% FBS/NMGF en kweek zoals beschreven in stap 3.2. Cultiveren in NMGF gedurende 3 dagen voorafgaand aan het overbrengen van levensvatbare cellen naar 2% FBS/NMGF is een alternatief voor het voorselecteren van gedifferentieerde cellen.</li>
</ol>4. Morfologische en moleculaire analyse van neurosferen door immunohistochie
<ol><li>Kweek de neurosferen totdat de meeste zwevende meercellige sferoïden een diameter van 100 μm bereiken.</li>
	<li>Verwijder kweekkolven uit de incubator en pellet onmiddellijk de neurobolletjes, verwijder het medium en voeg 10 ml DPBS toe zonder de pellet te verstoren. Verwijder DPBS, resuspend in 10% neutraal gebufferd formaline en incubeer gedurende 20 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Pellet de sferoïden, resuspend in 30% ethanol en incubeer gedurende 30-45 min.</li>
	<li>Vervang 30% ethanol door 50% ethanol, incubeer gedurende 15 min en vervang door verse 50% ethanol, incubeer nog eens 30 min.</li>
	<li>Herhaal (stap 4.4.) met 70% ethanol.</li>
	<li>Vervang door 95% ethanol twee veranderingen van elk 10-20 minuten en herhaal dit met absolute ethanol totdat sferoïden helder wit en gecondenseerd zijn.</li>
	<li>Maak een kleine filterpapierkegel van lenspapier en plaats deze in een kleine trechter in een bekerglas. Maak het lenspapier nat met absolute alcohol.</li>
	<li>Maak de pellet iets los met verse 100% ethanol, giet overtollige ethanol af en giet de sferoïden door de lenspapierkegel, zorg ervoor dat ze naar de punt van de kegel gaan. Spoel de buis af met extra absolute ethanol en giet de resterende sferoïden door de lenspapierkegel.</li>
	<li>Verwijder de papieren kegel uit de trechter en verplaats de sferoïden voorzichtig naar de onderkant van de kegel. Vouw het papier in een vierkant en zorg ervoor dat de sferoïden zo goed mogelijk zijn afgesloten.</li>
	<li>Breng de verpakte neurosferen over naar een cassette en breng ze over naar een automatische weefselprocessor.</li>
	<li>Programmeer de automatische weefselprocessor als volgt: absolute ethanol, 10 min, xyleen, 15 min (2x), paraffine, 10 min (4x).</li>
	<li>Verwijder de cassette uit de processor en plaats deze op het verwarmde deel van een paraffine-insluitsysteem . Zorg ervoor dat het hele oppervlak vrij is van fragmenten, stof of ander vuil en hevel alle paraffine uit de forceps warmwaterputten. Verwarm schone paraffinevrije tang en voeg een kleine hoeveelheid paraffine toe aan een opgewarmde basisvorm.</li>
	<li>Open de cassette, verwijder het pakket en plaats het op het verwarmde deel van het insluitsysteem. Open de papierkegel voorzichtig totdat de sferoïden zichtbaar zijn. Verzamel zoveel mogelijk van het materiaal met voorverwarmde tang en breng over op de vloeibare paraffine in de basisvorm.</li>
	<li>Herhaal dit indien nodig om zoveel mogelijk sferoïden op te halen. Schraap het tissuepapier voorzichtig met een voorverwarmd schoon scheermesje dat is afgeveegd met ethanol om eventuele resterende sferoïden te verzamelen zonder papier in het blok te krijgen.</li>
	<li>Breek voorzichtig alle bolvormige klonten met warme tangen. Verplaats de sferoïden van de hoeken naar een uniforme centrale laag. Verplaats de basisvorm naar het koelgebied om de sferoïden op hun plaats te zetten, voeg de cassette toe, vul langzaam met paraffine en koel grondig.</li>
	<li>Het neurosfeer paraffineblok kan worden gebruikt voor normale doorsneden en immunohistochie.</li>
</ol>

<ol><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003).</li>
<li>Ignatova, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cortical+glial+tumors+contain+neural+stem-like+cells+expressing+astroglial+and+neuronal+markers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro.</a> Glia. 39, 193-206 (2002).</li>
<li>Galli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444, 756-760 (2006).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li>
<li>Beier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%28%2B%29+and+CD133%28-%29+glioblastoma-derived+cancer+stem+cells+show+differential+growth+characteristics+and+molecular+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles.</a> Cancer Res. 67, 4010-4015 (2007).</li>
<li>Joo, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+biological+implications+of+CD133-positive+and+CD133-negative+cells+in+glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Clinical and biological implications of CD133-positive and CD133-negative cells in glioblastomas.</a> Lab. Invest. 88, 808-815 (2008).</li>
<li>Son, M. J., Woolard, K., Nam, D. H., Lee, J., Fine, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSEA-1+is+an+enrichment+marker+for+tumor-initiating+cells+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+cell%22%5BJournal%5D)">SSEA-1 is an enrichment marker for tumor-initiating cells in human glioblastoma.</a> Cell Stem cell. 4, 440-452 (2009).</li>
<li>deCarvalho, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliosarcoma+stem+cells+undergo+glial+and+mesenchymal+differentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo.</a> Stem Cells. 28, 181-190 (2010).</li>
<li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+human+glioblastoma+multiforme+tumor+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Laks, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere+Formation+Is+an+Independent+Predictor+of+Clinical+Outcome+in+Malignant+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Neurosphere Formation Is an Independent Predictor of Clinical Outcome in Malignant Glioma.</a> Stem Cells. 27, 980-987 (2009).</li>
<li>Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumour+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Brain tumour stem cells.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 425-436 (2006).</li>
<li>Gunther, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma-derived+stem+cell-enriched+cultures+form+distinct+subgroups+according+to+molecular+and+phenotypic+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria.</a> Oncogene. 27 (20), 2897-2909 (2007).</li>
<li>Fael Al-Mayhani, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+derivation+and+propagation+of+glioblastoma+cell+lines+that+conserves+the+molecular+profile+of+their+original+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient method for derivation and propagation of glioblastoma cell lines that conserves the molecular profile of their original tumours.</a> J. Neurosci. Methods. 176, 192-199 (2009).</li>
<li>Pollard, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cell+lines+expanded+in+adherent+culture+have+tumor-specific+phenotypes+and+are+suitable+for+chemical+and+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+cell%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens.</a> Cell Stem cell. 4, 568-580 (2009).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li>
<li>Leder, K., Holland, E. C., Michor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+implications+of+plasticity+of+the+cancer+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The therapeutic implications of plasticity of the cancer stem cell phenotype.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Pietras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+tumor+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in tumor heterogeneity.</a> Adv. Cancer Res. 112, 255-281 (2011).</li>
<li>Lomonaco, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+autophagy+by+gamma-radiation+contributes+to+the+radioresistance+of+glioma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The induction of autophagy by gamma-radiation contributes to the radioresistance of glioma stem cells.</a> Int. J. Cancer. 125, 717-722 (2009).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).</li>
<li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Een goede enzymatische tumorceldissociatie is een cruciale stap in dit protocol. Het weefsel moet ruim vóór incubatie in celdissociatieoplossing bij 37 °C bij rotatie worden gehakt, gedurende ten minste 30 minuten, wanneer het weefsel mechanisch moet worden getand en de verlenging van de dissociatie moet worden geverifieerd. Afhankelijk van de mate van weefselcohesie kan de incubatie met extra 15-30 minuten worden verlengd, indien nodig om dissociatie in enkele cellen te voltooien. Incubatie in dissociatieoplossing langer dan 1 uur wordt niet aanbevolen vanwege verminderde levensvatbaarheid van de cel. Hoewel de optimale hoeveelheid startweefsel 200-500 mg is, heeft dit protocol geleid tot succesvolle neurosfeerculturen vanaf slechts 50 mg tumorweefsel.
Serumvrije NMGF is een selectief medium en een percentage neoplastische cellen dat het grootste deel van de tumor en gastheercellen omvat, zal het niet overleven, terwijl anderen zich na het plateren aan de met weefselkweek behandelde kolf hechten. Het is van cruciaal belang dat de neurosferen die zich gedurende 1-3 weken zullen vormen (figuren 1B-E) worden overgebracht naar verse kolven, om zich te scheiden van gedifferentieerde tumorcellen en puin.
GBM-cellen die enzymatisch worden gedissocieerd en nooit gekweekt (stap 1.10) kunnen worden gebruikt als een back-upbron van cellen naar cultuur in alternatieve media, voor het geval de neurosfeercultuur faalt. We hebben met succes neurosfeerculturen verkregen uit dergelijke bevroren voorraden, evenals monolaagcellen die groeien in 2% FBS / NMGF.
Conceptueel gezien is "kankerstamcel" een werk in uitvoering en dit opkomende veld zal baat hebben bij aanvullende verduidelijking, aangezien de klinische implicaties aanzienlijk zijn, met name bij de generatie van tumor heterogeniteit, plasticiteit en resistentie tegen therapie19,20. De neurosfeerculturen zijn niet alleen van vitaal belang voor het genereren van patiëntspecifieke GBM-diermodellen, maar zijn ook waardevol voor in vitro studies zoals verandering in celsignalering en genexpressie als reactie op groeifactoren, hypoxie en farmacologischemiddelen 11,21. We hebben gekozen voor het gebruik van doorsneden van formaline vaste en paraffine ingebedde neurosferen, het behoud van de 3D-architectuur, om eiwitexpressie en post-translationele modificaties door immunohistochie11te bestuderen, vanwege de superieure subcellulaire lokalisatie met betrekking tot de meer gebruikelijke methode om de hele bol te labelen en in beeld te brengen.
Het is aangetoond dat niet alle cellen in neurosferen afgeleid van volwassen zoogdierhersenen stamcellen zijn22. Evenzo zijn de neurosferen gekweekt uit GBM-tumoren waarschijnlijk niet clonal, vanwege de aanwezigheid van meer gedifferentieerde kankervoorlopercellen en zelfaggregatie, waarvan bekend is dat ze optreden bij hoge celdichtheden23, wat door sommigen als een beperking van deze methode wordt beschouwd. Om verrijking voor zelfvernieuwende stamcellen op lange termijn te bevorderen, in tegenstelling tot alleen voorlopers die tijdelijk kunnen groeien als neurosferen22, worden de primaire neurosferen gedissocieerd voor secundaire neurosfeervorming en verder gepasseerd gedurende minimaal 10 passages, ongeveer gelijk aan 2 maanden in continue cultuur, wat een indicatie is van een populatie verrijkt met stamcellen22. Onze ervaring is dat GBM-neurosfeerculturen die dat doel bereiken, voor onbepaalde tijd als neurosferen kunnen worden uitgebreid. Tumorkwaliteit is belangrijk, omdat we succesvolle culturen hebben verkregen van GBM's en anaplastische astrocytomen, respectievelijk WHO-graad IV en III, maar niet van gliomen van lagere kwaliteit.
De meest voorkomende methode voor het cultiveren van glioblastoomcellen, in traditioneel groeimedium aangevuld met 10% FBS, leidt tot aanzienlijke genomische en fenotypische divergentie van de oorspronkelijke tumoren 4. Aan de andere kant zijn neurosfeerculturen een stabiele en langdurige bron van cellen die kankerstamcelfenotype4presenteren. De neurosfeermethode is steeds populairder geworden voor de verrijking van CSC in langetermijnculturen voor orthotopische muis xenograftmodellen, ondanks het feit dat het niet succesvol is voor alle hoogwaardige astrocytoommonsters, wat de belangrijkste zwakte van deze methode vertegenwoordigt. Studies om te begrijpen hoe moleculaire kenmerken van de ouderlijke tumoren de neurosfeervorming kunnen beïnvloeden, zijn aan de gang. Verkenning van praktische alternatieve methoden voor cultuur hoogwaardige gliomen, gevolgd door uitgebreide validatie, wordt verleend, gezien de belangrijke voordelen van het hebben van patiëntspecifieke GBM-modellen, naarmate we verder gaan in een tijdperk van gepersonaliseerde geneeskunde, gevoed door de toegankelijkheid van "omics" -informatie en een toenemend aantal potentiële gerichte therapieën.

Glioblastoom (GBM), een WHO graad IV astrocytoom, is de meest voorkomende en agressieve primaire hersentumor. Diverse ontwikkelingsfenotypes worden overgenomen door GBM-tumorcellen, waaronder cellen die kenmerken van "kankerstamcel" (CSC) vertonen, zoals de expressie van neurale stamcelmarkers (NSC), langdurige zelfvernieuwing en het potentieel om meer gedifferentieerde cellen te creëren die astrocytische markers uitdrukken en het grootste deel van de tumorvormen 1-3. Hoewel er nog steeds verduidelijking nodig is met betrekking tot de moleculaire identiteit van CSC en klinische implicaties, ligt de focus van dit werk op de operationele definitie van CSC: langdurige zelfvernieuwing in vitro en het vermogen om de oorspronkelijke tumor te differentiëren en te reproduceren bij orthotopische implantatie bij immuungecompromitteerde knaagdieren.
Glioblastoomcellen worden al tientallen jaren gekweekt in traditioneel medium met 10% foetale runderserum (FBS) en verschillende in de handel verkrijgbaar serum gekweekte GBM-cellijnen zijn tumorigeen bij immuungecompromitteerde knaagdieren, maar er is aanzienlijke genomische en moleculaire divergentie van de oorspronkelijke tumor4, waardoor het gebruik ervan als klinisch relevante modellen wordt beperkt. Meer recent werden cellen met stam/voorloperfenotype dat reageert op EFG en bFGF geïdentificeerd in GBM's2. Vervolgens werden gedissocieerde GBM-tumormonsters gekweekt in een serumvrij medium3, oorspronkelijk geformuleerd voor de selectie en uitbreiding van neurale stamcellen uit de volwassen zoogdierhersenen5. Deze kweekomstandigheden belemmeren de groei van de meeste niet-neuroplastische en meer gedifferentieerde tumorcelpopulaties, terwijl ze de groei van stam- en voorlopercellen als zwevende meercellige sferoïden of neurosferen3bevorderen, waarbij het gedrag van volwassen neurale stamcellen van zoogdieren wordt nagebootst5. Uitgebreide vergelijking van primaire GBM-cellen gekweekt in neurosfeermedium aangevuld met groeifactoren (NMGF) of in het traditionele groeimedium aangevuld met 10% FBS, onthulde dat de GBM-neurosferen tumorigeen waren, multilineage differentiatiepotentieel presenteerden en het genotype van de oorspronkelijke tumor behielden, in tegenstelling tot de 10% FBS-culturen die niet tumorigeen waren bij lage passages en aanzienlijk verschilden van de oorspronkelijke tumoren bij latepassages.
Isolatie van CSC van gedissocieerde GBM-tumoren door celsortering op basis van de expressie van putatieve CSC-marker CD133 is ook voorgesteld6,7, maar verder onderzoek wees uit dat het CSC-fenotype niet definitief geassocieerd is met de expressie van dergelijke markers8-10, waardoor het aanvankelijke enthousiasme voor deze strategie afneemt , terwijl nieuwe markers nog steeds worden getest10. De onbeschikbaarheid tot nu toe van een gevalideerde set markers die CSC definiëren, samen met het doel van grootschalige versterking van deze cellen voor preklinische studies, maakt het gebruik van celsortering onpraktisch voor routinematige CSC-verrijkte culturen. GBM-cellen geselecteerd door het vermogen om te groeien als neurosferen in NMGF drukken steevast neurale stamcelmarkers uit. We hebben waargenomen dat Sox2 en nestine alomtegenwoordig worden uitgedrukt in neurosfeerculturen, terwijl CD133-eiwit aanwezig is in een subset van de GBM-neurosferen (ongepubliceerde gegevens en referentie11).
Verschillende laboratoria streven neurosfeerculturen na van glioblastoomtumoren met dezelfde algemene benadering van enzymatische dissociatie en cultivering in serumvrij medium aangevuld met groeifactoren3,4,11-14, terwijl andere collega's pogingen hebben gemeld om neurosfeerculturen op lange termijn zonder succes uit GBM-monsters te laten groeien . De hier gepresenteerde algemene methode voor enzymatische dissociatie en neurosfeercultuur van hoogwaardige gliomen is vergelijkbaar met wat in de bovenstaande publicaties is beschreven. We hebben het protocol geoptimaliseerd op basis van onze ervaring met het dissocieren en cultiveren van meer dan 100 GBM-monsters. De efficiëntie van het verkrijgen van neurosfeerculturen op lange termijn uit verse GBM-monsters die het hier gepresenteerde protocol toepassen, is meer dan 40%, vergelijkbaar met de weinige rapporten die efficiëntiegegevens3,15tonen , wat leidt tot de exploratie van alternatieve protocollen zoals het voortdurend of met tussenpozen cultiveren van cellen in serumvrij medium in aanwezigheid van EFG en bFGF als monolagen op oppervlakken bedekt met ECM-eiwit16,17. Neurosfeerculturen zijn nog steeds de meest gevalideerde en steeds populairdere benadering om GBM-tumoren moleculaire kenmerken en tumorigeen potentieel3,4,11-14te behouden , dus onze aanpak is om eerst neurosfeerculturen te proberen, terwijl we tegelijkertijd alternatieve methoden testen voor het cultiveren van GBM-cellen die geen langdurige zelfvernieuwende neurosferen vormen ( figuur1), om de representatie van GBM-tumoren die in diermodellen kunnen worden gebruikt, te vergroten. Hier presenteren we een protocol voor het cultiveren van neurosferen van GBM's. Voor cellen die geen neurosferen vormen, laten we een eenvoudige wijziging in het groeimedium zien, als de eerste poging om tumorogene cellen uit niet-neurosfeervormende GBM's te cultaculeren, met veelbelovende resultaten en nog steeds uitgebreide validatie ondergaan.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin - EDTA 0.05%</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Hank&rsquo;s Balanced Salt Solution, calcium- en magnesiumvrij</td><td>Life Technologies</td><td>14170-120</td><td></td></tr><tr><td>Hank&rsquo;s Balanced Salt Solution, met calcium en magnesium&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type 4</td><td>Worthington</td><td>5004188</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>T7659</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Albumine uit runder serum, celkweekkwaliteit</td><td>Sigma</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine Reagent-oplossing</td><td>Life Technologies</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Antibioticum/Antimyoticum</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF-basis</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Lympholyte-Muis</td><td>Cedarlane Laboratories Ltd.</td><td>CL5031</td><td></td></tr><tr><td>Recovery Cell Cultuur Bevriezingsmedium</td><td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>Steriele Celzeef, 40 &mu;m</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Fosfaat-Gebufferde Saline (DPBS), geen calcium en geen magnesium</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blauw Kleurmiddel, 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Neutraal Gebufferd Formaline</td><td>Protocol</td><td>245-684</td><td></td></tr><tr><td>Histoplex Tissue Cassettes</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-146-426</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Miltenyi BioTec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut D-MEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Stem Pro Neural Supplement&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A1058-01</td><td></td></tr></tbody></table>

optimalisatie van hoogwaardige glioomcelcultuur van chirurgische specimens voor gebruik in klinisch relevante diermodellen en 3d-immunochemie

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Glioblastomen, de meest voorkomende en agressieve vorm van astrocytoom, zijn vuurvast voor therapie en moleculair heterogeen. Het vermogen om celculturen op te zetten die het genomische profiel van de oudertumoren behouden, voor gebruik in patiëntspecifieke in vitro en in vivo modellen, heeft het potentieel om een revolutie teweeg te brengen in de preklinische ontwikkeling van nieuwe behandelingen voor glioblastoom die zijn afgestemd op de moleculaire kenmerken van elke tumor.
Beginnend met verse hoogwaardige astrocytoomtumoren gedissocieerd in enkele cellen, gebruiken we de neurosfeertest als een verrijkingsmethode voor cellen die kankerstamcelfenotype presenteren, inclusief expressie van neurale stamcelmarkers, langdurige zelfvernieuwing in vitroen het vermogen om orthotopische xenografttumoren te vormen. Deze methode is eerder voorgesteld en wordt nu door verschillende onderzoekers gebruikt. Op basis van onze ervaring met het scheiden en cultiveren van 125 glioblastoommonsters, kwamen we tot het gedetailleerde protocol dat we hier presenteren, geschikt voor routinematige neurosfeerculering van hoogwaardige astrocytomen en grootschalige uitbreiding van tumorigenic cellen voor preklinische studies. We rapporteren over de efficiëntie van succesvolle langetermijnculturen met behulp van dit protocol en stellen betaalbare alternatieven voor het kweken van gedissocieerde glioblastoomcellen voor die niet groeien als neurosferen. We beschrijven ook in detail een protocol voor het behoud van de neurosferen 3D-architectuur voor immunohistochie. Celculturen verrijkt met CCC's, die orthotopische xenograftmodellen kunnen genereren die de moleculaire handtekeningen en heterogeniteit van GBM's behouden, worden steeds populairder voor de studie van de biologie van GBM's en voor het verbeterde ontwerp van preklinische tests van potentiële therapieën.

We hebben het hierboven beschreven protocol toegepast op dissociate en kweek 125 verse chirurgische glioblastoommonsters (figuur 1), 88 nieuw gediagnosticeerde en 37 terugkerende tumoren (tabel 2), met goedgekeurde toestemming van de patiënt en volgens institutionele richtlijnen. De efficiëntie van het protocol voor het vaststellen van neurosfeerculturen op lange termijn was 41,6%, en vergelijkbaar voor nieuw gediagnosticeerde tumoren en terugkerende tumoren (Tabel 2). Voor sommige GBM-monsters vormen zich in de eerste paar dagen neurosferen (figuren 1B en 1C), terwijl voor andere langere cultiveringstijd vereist is (figuren 1D en 1E).
De efficiëntie van neurosfeervorming was niet uitsluitend afhankelijk van het niveau van necrose in het weefsel, zoals blijkt uit de resultaten van een nieuw gediagnosticeerde tumor met hoge celdichtheid (GBM1) en een terugkerende en necrotische tumor (GBM2) verwerkt volgens protocollen 1 en 2, die beide neurosfeerculturen opleverden (Figuur 2).
Het testen van het tumorigene potentieel van elke neurosfeercultuur bij immuungecompromitteerde muizen is de cruciale validatie van deze aanpak voor verrijking van CSC's. Met behulp van een protocol vergelijkbaar met eerder beschreven18, GBM1 en GBM2 neurosferen werden geïmplanteerd in de hersenen van immuungecompromitteerde muizen, volgens institutionele en IACUC-richtlijnen voor dierverzorging. De xenografttumoren vertonen morfologische kenmerken van GBM's, zoals invasie in het hersenparenchym en necrose (figuur 2).
GBM3 werd gedissocieerd (figuur 1A) en gekweekt in neurosfeermedium (figuren 1D en 1E), en in 2% FBS/NMGF (figuren 1D, 1G en 1H). Monolaagcellen gekweekt in 2% FBS/NMGF en neurosfeercellen gekweekt in NMGF werden gedissocieerd en hetzelfde aantal cellen werd geïmplanteerd in naaktmuis, met dezelfde procedure als in figuur 2. Er werden geen verschillen in overleving, tumorgroeidynamiek of morfologie waargenomen tussen de twee pre-implantatiekweekmethoden (Figuren 3A-C). Tumorgroeikenmerken veranderen niet tot de meest recente geteste passage, P20 voor neurosferen en P10 voor 2% FBS/NMGF. Terwijl neurale stamcelmarkers, waaronder Sox2, worden gereguleerd in de meeste primaire GBM-cellen gekweekt in 10% FBS 3,4,11, maakt NMGF aangevuld met 2% FBS het behoud van Sox2-expressie mogelijk (Figuur 3D).
Neurosferen werden verwerkt volgens Protocol 4 en gelabeld met H&E(figuur 4A),anti-Sox2-antilichamen, met nucleaire lokalisatie(figuur 4B)en EGFR-antilichaam, celmembraanlokalisatie(figuur 4C). Dit protocol is toegepast om toegang te krijgen tot stimuliafhankelijke veranderingen in de expressie van nestine, GFAP en de proliferatiemarker Ki6711.
Tabel 2. Efficiëntie van het afleiden van langdurige zelfvernieuwende neurosfeerculturen van GBM's.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Pathologie</td>
			<td>N.</td>
			<td>Percentage monsters dat op lange termijn zelfvernieuwende neurosferen oplevert (n)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glioblastoom - onbehandeld, eerste operatie</td>
			<td>88</td>
			<td>42.0% (37)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glioblastoom - recidiverend</td>
			<td>37</td>
			<td>40.5% (15)</td>
		</tr>
<tr>
<td>totaal</td>
			<td>125</td>
			<td>41.6% (52)</td>
		</tr>
</tbody></table><img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1.jpg"> Figuur 1. Celkweek van verse glioblastoom chirurgische specimens. Verse tumoren worden enzymatisch gedissocieerd tot enkele cellen. Nucleated cell interface van dichtheid scheidingsmedium wordt vervolgens geplateerd in NMGF. Gedissocieerde neurosferen worden geplateerd in NMGF, en meestal 1 dag na plating zijn er dode cellen, puin, gehechte enkele cellen en af en toe delende cellen in suspensie (A). Neurosfeervorming is in sommige gevallen sneller (B,C) en voor andere (D,E). Alle neurosferen worden gedissocieerd en opnieuw geploeterd voor ten minste 10 passages, 41,6% GBM's leveren op lange termijn zelfvernieuwende neurosferen op. Levensvatbare GBM-gedissocieerde cellen die niet groeien als neurosferen (F) kunnen worden overgebracht naar alternatieve kweekomstandigheden, bijvoorbeeld 2% FBS/NMGF (G,H). Bar (A), 100 μm, is van toepassing op alle afbeeldingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" target="_blank"> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2.jpg"> Figuur 2. Neurosfeergeneratie en orthotopische muis xenografts van GBM tumoren. Een tumormonster met een hoge celdichtheid (GBM1) en een tumor met een hoog necrotisch gehalte (GBM2) werden gedissocieerd en neurosferen gekweekt voor 10 passages volgens protocollen 1 en 2. Immuungecompromitteerde muizen werden geïmplanteerd met 3 x10 5 gedissocieerde neurosfeercellen en opgeofferd wanneer ze sterven. Muishersenen waren formaline gefixeerd en paraffine ingebed voor H&E-kleuring en immunohistochiëmiedetectie van menselijke markers, menselijke mitochondriën (hMit) of grote histocompatibiliteitsklasse I subeenheid HLA-A (MHC-I). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" target="_blank"> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3.jpg"> Figuur 3. Vergelijkbare tumorgroei bij muizen intracraniaal geïmplanteerd met GBM3-cellen gekweekt als neurosferen in NMGF of als monolagen in 2% FBS/NMGF. (A) Kaplan-Meier overlevingscurven voor GBM3 gekweekt als neurosferen in NMGF of monolagen in 2%FBS/NMGF (beide passage <10) vertonen geen verschil in overleving (n=10, p=0,7174, log-rank test). (B) Tumorgroei gecontroleerd door live bioluminescentie imaging (BLI) vertoont geen significant verschil in tumorgroeidynamiek tussen de twee groepen. (C) Tumormorfologie is niet te onderscheiden voor 4 GBM3 xenografts, 2 gekweekt in NMGF en 2 gekweekt in 2% FBS/NMGF. MHC-I vlek zoals beschreven voor figuur 2. Schaal, 600 μm. (D) Westelijke vlek met de stamcelmaker Sox2-expressie die wordt vastgehouden in 2% FBS/NMGF-culturen die worden gebruikt om de xenografttumoren (A-C) te initiëren . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" target="_blank"> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4.jpg"> Figuur 4. Analyse van eiwitexpressie in neurosfeersecties door immunohistochistry. Neurosfeerculturen waren formaline-vast en paraffine ingebed zoals beschreven in procedure 4, en gekleurd met H&E (A), anti-Sox2 antilichaam (B) en anti-EGFR antilichaam (C). DAB-substraat werd gebruikt om te visualiseren (B,C). Staaf, 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>

Protocol voor vermeerdering van gedissocieerde hoogwaardige glioom chirurgische specimens in serumvrij neurosfeermedium om te selecteren voor cellen met kankerstamcelfenotype. Voor specimens die niet als neurosferen groeien, wordt een alternatief protocol voorgesteld. Een paraffine-inbeddingstechniek voor het behoud van de 3D-neurosfeerarchitectuur voor immunocytochemie wordt beschreven.

Optimalisatie van hoogwaardige glioomcelcultuur van chirurgische specimens voor gebruik in klinisch relevante diermodellen en 3D-immunochemie

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van een routine voor de neurosfeer-kweek van hooggradige astrocytomen en de grootschalige expansie van tumorigenere cellen voor preklinische studies. Dit wordt bereikt door eerst verse tumorbiopten acuut te dissociëren en de enkelvoudige cellen te scheiden van rode bloedcellen en debris. In de tweede stap worden de tumorcellen gekweekt in neurosfeer-medium aangevuld met groeifactoren totdat er neurosferen worden waargenomen.Neurosferen kunnen worden gekweekt voor in vivo experimenten en moleculaire karakterisering, of gefixeerd en in paraffine worden ingebed voor immunologische karakterisering. Uiteindelijk kunnen de langetermijn zelfvernieuwing, orthotope tumormining en moleculaire profilering van de neurosfeer-culturen worden geëvalueerd. Het belangrijkste voordeel ten opzichte van bestaande methoden, zoals langetermijn serumculturen met 10% FBS, is dat deze techniek de moleculaire en genetische kenmerken van de oorspronkelijke tumor behoudt.Deze methode maakt de oprichting van een levende tumorenbank mogelijk voor de generatie van patiëntspecifieke glioblastoomcelculturen en diermodellen voor klinisch relevant onderzoek. De implicaties van dit model voor therapeutisch testen bij patiënten met een maligne gliom zijn evident. Het model is de meest getrouwe weergave van de primaire tumor en maakt therapeutisch testen in een preklinische omgeving mogelijk.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in glioblastomen van een hoge graad, kan zij ook worden toegepast op andere menselijke en dierlijke tumoren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat er correcte steriele technieken en zorg vereist zijn, evenals meerdere stappen om de langetermijnlevensvatbaarheid van de cellen te bevorderen. We kregen oorspronkelijk het idee voor de 3D-histologiemethode vanwege de superieure subcellulaire lokalisatie van gelabelde eiwitten en de coupes in vergelijking met de meer gangbare methoden van het labelen en afbeelden van volledige neurosferen of het dissocieren van de cellen.Een visuele demonstratie van deze histologiemethode is essentieel, aangezien de stappen voor fixatie, klaring, processing en inbedding moeilijk aan te leren zijn. Er is zorgvuldigheid vereist om te waarborgen dat alle neurosferen adequaat worden blootgesteld aan de reagentia en gelijkmatig worden verwerkt, om zo de best mogelijke pellet te verkrijgen voor morfologie en immunohistochemie. Begin met 200 tot 500 milligrams tumorstalen en gebruik een scalpellamella om het weefsel fijn te hakken.Breng de stukjes over naar een buis van 15 milliliter met 10 milliliter medium en keer de suspensie vervolgens enkele keren om om de weefseloplossing te mengen. Laat de tumorstukjes bezinken door zwaartekracht en verwijder daarna het medium. Ga door met het wassen van het residu van de tumorstukjes totdat het medium niet langer troebel is.Verwijder vervolgens het medium. Voeg twee milliliters enzymatische weefseldissociatie-oplossing toe per 0,5 grams gemengd tumormonster en meng de oplossing voorzichtig door inversie. Incubeer de weefseloplossing bij 37 degrees Celsius in een weefselkweekincubator onder rotatie.Tritureer de suspensie na 30 minuten met een pipet van twee milliliter. Wanneer de tumor is verteerd tot een suspensie die hoofdzakelijk uit enkelvoudige cellen bestaat, stop dan de enzymatische werking met twee volumes stopoplossing en meng de celsuspensie met een serologische pipet van vijf milliliter. Filter nu eventueel onverteerd materiaal weg via een celzeef van 40 micrometer en pellet de cellen gedurende vijf minuten bij 800 ×g en kamertemperatuur.Suspendeer vervolgens, na drie wasbeurten in 10 milliliters medium, het uiteindelijke celpellet in vijf milliliters medium. Breng deze celsuspensie voorzichtig als een laag aan over vijf milliliters lympho light M, en scheid vervolgens de celpopulaties gedurende 20 minuten bij 1300 times G en kamertemperatuur. Verzamel nu de interfase-laag met de gekernde cellen in een 15 milliliter buis die 10 milliliters medium bevat.Resuspendeer de cellen vervolgens in neurosphere-medium aangevuld met groeifactoren en zaai ze uit met een dichtheid van minder dan 1 × 10⁵ cellen per milliliter in een T 25 weefkweekfles bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde weefkweekincubator.Overbreng de drijvende neurosferen die gedurende één tot drie weken zijn gevormd naar een nieuwe kolf om ze te scheiden van de aanhechtende cellen en debris. Om de neurosferen via immunohistochemie te analyseren, moeten de neurosferen eerst worden gecentrifugeerd tot een pellet; wees hierbij voorzichtig om de pellet niet te verstoren. Verwijder het supernatant en voeg 10 milliliters DPBS toe aan de buis.Verwijder vervolgens de DPBS, resuspendeer het pellet in 10% neutraal gebufferde formine en incubeer de cellen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Nadat de steroïden opnieuw zijn gepellet, worden ze geresuspendeerd in een reeks ethanol-incubaties. Na de tweede incubatie met 95% ethanol wordt de PHE geresuspendeerd met absolute ethanol totdat de cellen helderwit en gecondenseerd zijn.Maak vervolgens een kleine kegel van lenspapier. Plaats deze in een kleine trechter in een bekerglas en bevochtig het lenspapier met absolute alcohol. Maak het pellet voorzichtig los met verse 100% ethanol en giet daarna het overtollige alcohol af.Giet de sferen door de kegel van lenspapier, zorg dat ze tot aan de punt gaan en spoel de buis na met extra absolute ethanol. Giet eventuele resterende steroïden door de kegel van lenspapier en verwijder vervolgens de kegel uit de trechter. Vouw het lenspapier daarna tot een vierkant, waarbij u ervoor zorgt dat de steroïden zo veilig mogelijk zijn ingesloten, en breng het pakketje neurosferen over naar een cassette.Plaats de cassette nu in een automatische weefselprocessor en start de processor. Verwijder vervolgens de cassette en plaats deze op het verwarmde gedeelte van een paraffine-inbeddingssysteem. Nadat is bevestigd dat het oppervlak vrij is van fragmenten, stof of ander vuil, wordt alle paraffine vanuit de pincet in verwarmingsbakjes gesiphoneerd.Verwarm vervolgens een schoon paar paraffinevrije pincetten en voeg een kleine hoeveelheid paraffine toe aan een verwarmde basisvorm. Verwijder nu het pakketje uit de cassette en plaats het op het verwarmde deel van het inbeddingssysteem. Open het papier voorzichtig totdat de sferen zichtbaar zijn.Gebruik de voorverwarmde pincet om zoveel mogelijk van het materiaal te verzamelen en breng de sferoïden vervolgens over naar de vloeibare paraffine in de basisvorm. Breek voorzichtig eventuele klonters op en verplaats de sferoïde van de hoeken naar een uniforme centrale laag. Plaats de basisvorm in het koelingsgebied om de sferoïde op zijn plaats te fixeren.Voeg ten slotte de cassette toe en vul deze langzaam met paraffine. Zodra de cassette volledig is afgekoeld, kan het paraffineblok van de neurosfere worden gesneden voor immunohistochemie, zoals beschreven in de tabel. De efficiëntie van dit protocol voor het opzetten van langetermijn-neurosfereculturen uit in totaal 88 nieuw gediagnosticeerde en 37 recidiverende tumoren was 41,6%, wat vergelijkbaar was voor zowel nieuw gediagnosticeerde tumoren als recidiverende tumoren.Voor sommige glioblastoommonsters vormden zich neurosferen binnen de eerste paar dagen, terwijl voor andere een langere kweektijd nodig was. De efficiëntie van de neurosfeer-vorming was niet uitsluitend afhankelijk van het niveau van necrose in het weefsel, zoals blijkt uit de resultaten van een recent gediagnosticeerde tumor met een hoge celdichtheid en een recurrente en necrotische tumor, die beide werden verwerkt zoals zojuist gedemonstreerd en neurosferen opleverden om het tumorigeniteits-potentieel van elke neurosfeer te testen. Kweek in immuungecompromitteerde muizen is een cruciale validatie van deze benadering voor de verrijking van kankerstamcellen.In dit experiment werden twee verschillende glioblastoom-neurosfeer-culturen geïmplanteerd in de hersenen van immuungecompromitteerde muizen. De xenograft-tumoren vertoonden morfologische kenmerken van glioblastomen, zoals invasie in het hersenparenchym en necrose. In dit experiment werden cellen die geen neurosferen vormden gekweekt in neurosfeer-medium aangevuld met 2%FBS om de tumoraanmaak van deze cellen in alternatieve media te bestuderen.In vergelijking met glioblastoom werden neurosfeer-culturen xenogeraft in naakte muizen recipients geëvalueerd. Er werden geen verschillen in overleving, tumorgroeidynamiek of morfologie waargenomen tussen de twee pre-plant cultivatiemethoden.Hoewel markers voor neurale stamcellen, waaronder SOX2, downgereguleerd zijn in de meeste primaire glioblastoomcellen die zijn gekweekt in 10% FBS, behouden glioblastoomcellen die zijn gegroeid in neurosfeer-medium, aangevuld met 2% FBS, de expressie van SOX2 na de verwerking zoals zojuist gedemonstreerd. In dit experiment werden de neurosferen gelabeld met een H&E anti-SOX2 antilichaam om de nucleaire lokalisatie aan te tonen en met een epidermale groeifactor-antilichaam om de lokalisatie van het celmembraan te illustreren. Zoals de resulterende beelden illustreren, optimaliseert de gedemonstreerde methode de analyse van eiwitexpressie en posttranslationele modificaties, terwijl de 3D-architectuur van de neurosferen behouden blijft. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze weefseldissociatie in ongeveer twee uur worden uitgevoerd als dit correct wordt gedaan. Tijdens het uitvoeren van de procedure is het belangrijk om te onthouden dat het tijdsinterval tussen de operatie en de dissociatie, evenals de heterogene moleculaire samenstelling van hooggradige gliomen, de resultaten na deze procedure kunnen beïnvloeden.Andere methoden, zoals intracraniële implantatie, kunnen worden uitgevoerd om de oorspronkelijke tumor in diermodellen te reproduceren. Deze techniek revolutioneert de neuro-oncologie en maakt preklinisch onderzoek mogelijk in een klinisch relevante omgeving. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u neurosferen op lange termijn ontwikkelt en onderhoudt, alsook hoe u formaline-gefixeerde en in paraffine ingebedde neurosferen produceert voor moleculaire analyse.Vergeet niet dat het werken met menselijk weefsel uiterst gevaarlijk kan zijn; bij het uitvoeren van deze procedure moeten daarom altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen en het correct omgaan met compatibele en potentieel gevaarlijke stoffen.

optimization-high-grade-glioma-cell-culture-from-surgical-specimens

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Kwaadaardige gliomen vormen een heterogene groep van zeer infiltratieve gliane neoplasmata met duidelijke klinische en moleculaire kenmerken. Primaire orthotopische xenograften heroveren de histopathologische en moleculaire kenmerken van kwaadaardige glioomsubtypes in preklinische diermodellen.

Primaire orthotopische glioom xenograften recapituleren infiltratieve groei en isocitraat dehydrogenase I mutatie

We hebben een corticaal orthotope glioblastoom model vastgesteld muizen intravitale twee-foton microscopie dat de biofysische beperkingen recapituleert beginsel zullen spelen tijdens de groei van de tumor. Een chronische glazen venster vervangen van de schedel boven de tumor kan de follow-up van de progressie van de tumor na verloop van tijd door twee-foton microscopie.

Een orthotope Glioblastoma Muis Model Handhaving Brain Parenchymale fysieke beperkingen en geschikt voor intravitale twee-foton microscopie

Van patiënten afgeleide xenografts van glioblastoma multiforme kunnen worden geminiaturiseerd tot levende microtumoren met behulp van een 3D-menselijke biogel-kweeksysteem. Deze in vivo-achtige 3D-tumortest is geschikt voor het testen van de reactie op geneesmiddelen en moleculair profileren, inclusief kinoomanalyse.

Genereren van Microtumors Met behulp van 3D Human Biogel Cultuur System en Patient afgeleide glioblastoma Cellen voor Kinomic Profiling and Drug Response Testen

Neurospheres gegroeid als 3D culturen vormen een krachtig hulpmiddel om te studeren glioma biologie. Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van immunohistochemistry met behoud van de 3D structuur van glioma neurospheres via paraffine insluiten. Deze methode kan de karakterisatie van glioma neurosphere eigenschappen zoals stemness en Neurale differentiatie.

Evaluatie van Biomarkers in Glioma door Immunohistochemistry op 3D Glioma paraffine-ingebedde Neurosphere culturen

Laser microdissectie (LMD) is een gevoelige en zeer reproduceerbare techniek die kan worden gebruikt om paden die glioom heterogeniteit en invasie te bemiddelen blootleggen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol om discrete gebieden te isoleren van glioomweefsel met behulp van laser LMD, gevolgd door transcriptomische analyse.

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Hier beschrijven we een gebruiksvriendelijke invasietest voor glioblastoom. Deze test is geschikt voor glioblastoom stamcellen-achtige cellen. Een Fiji macro voor eenvoudige kwantificering van invasie, migratie en proliferatie wordt ook beschreven.

Een 3D Spheroid Model voor Glioblastoom

We presenteren een nieuwe benadering voor twee-fotonmicroscopie van de tumorafgifte van fluorescerend gelabelde ijzeroxide-nanodeeltjes aan glioblastoom in een muismodel.

Intravitale microscopie met twee fotonen van glioblastoom in een muizenmodel

IDH1-mutant diffuse laaghangstroomgliomen zijn zeldzame tumoren die moeilijk te kweken zijn. We introduceren een eenvoudige, niet-enzymatische explant-methode die de expressie van IDH1-mutante eiwitten behoudt en culturen maandenlang in stand houdt. Belangrijk is dat deze techniek werkt met diepvriesgeconserveerde tumoren en een waardevolle bron biedt voor glioomonderzoek.

Een protocol voor explantaatculturen van IDH1-mutant diffuse laaggradige gliomen

Het doel van dit protocol is om onderzoekers een zeer reproduceerbare techniek te bieden voor intracraniële implantaties.

Stereotactische intracraniële implantatie van door de patiënt afgeleide xenograftcellijnen van de glioblastoom bij muizen

Sepsis verwijst naar een systemic inflammatory response syndrome als gevolg van een bacteriële infectie, en kan worden gesimuleerd door een chirurgische techniek genoemd cecal ligatie en punctie (CLP). Hier beschrijven we een methode om CLP-geïnduceerde diermodel te gebruiken om geneeskrachtige kruiden te screenen op therapeutische middelen.

Het gebruik van dierlijk model van Sepsis op nieuwe kruidentherapieën Evalueer

Leer hoe je hoogwaardige glioomcelcultuur optimaliseert van chirurgische specimens voor klinisch relevante diermodellen en 3D-immunochemie. Deze methode behoudt moleculaire tumorkenmerken.

Optimalisatie van hoogwaardige glioomcelcultuur van chirurgische specimens voor gebruik in klinisch relevante diermodellen en 3D-immunochemie (Video) | JoVE Journal

Optimalisatie van hoogwaardige glioomcelcultuur van chirurgische specimens voor gebruik in klinisch relevante diermodellen en 3D-immunochemie

Meer video's verkennen