Visualisatie van de immunologische Synapse door Dual Color Time-gated stimulated emission depletion (STED) Nanoscopy
24 maart 2014
Hier illustreren we het protocol voor beeldvorming door twee kleuren STED nanoscopy de cytotoxische immuun synaps van NK-cellen samengevat op glas. Met deze methode krijgen we sub-100 nm resolutie van synapseiwitten en het cytoskelet.
Het algemene doel van deze procedure is om structuren zoals F-actin in de NK-cel lytische synaps te visualiseren met behulp van TED-microscopie. Dit wordt bereikt door eerst de synaps op glas na te bootsen met behulp van een activerend antilichaam. De tweede stap van de procedure is om perme te fixeren en de cellen te kleuren voor structuren van belang.
Vervolgens worden de slides beeldvormd door middel van laser scanning confocale microscopie, gevolgd door toepassing van stead depletie voor verhoogde beeldresolutie. De laatste stap is om de beelden te verwerken met behulp van een deconvolutie-algoritme. Uiteindelijk kunnen resultaten een resolutie van minder dan 100 nanometer van cellulaire structuren tonen dankzij dubbelkleurige stead en endoscopie.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het vakgebied van celbiologie, zoals de relatie tussen het cytoskelet en exocytose. In ons geval zijn we geïnteresseerd in de secretie van gespecialiseerde lysosomen, aangeduid als lytische granulen, door natuurlijke killercellen. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode het moeilijk vinden omdat er meerdere variabelen zijn die kunnen worden aangepast bij de toepassing van de TED-depletielaser.
Een onjuiste toepassing van de depletiebundel zal resulteren in een verslechtering van in plaats van verbetering van de resolutie. Ter voorbereiding warmt u 30 milliliter RPMI-medium met 10%FCS en afzonderlijk op. Eén milliliter van BD CY-effecten cyop perm beide tot 37 graden Celsius. Begin vervolgens met het coaten van de deksels met antilichamen.
Neem nummer 1,5 deksels en gebruik een PAP-pen. Maak muntgrote vierkanten op de deksels. Bereid een vierkant voor elke geteste conditie voor.
Laad elke cirkel met 200 microliter antilichaam bij vijf microgram per milliliter in PBS. Voor NK 92-celactivatie gebruikt u anti CD 18 en anti NK P 30-antilichamen. Incubeer de geladen deksels bij 37 graden Celsius gedurende een half uur en was ze vervolgens af met een dompeling in PBS op kamertemperatuur. Ga onmiddellijk door met het toevoegen van de cellen voor elke geteste conditie, 500.000 cellen moeten klaar zijn om te gebruiken.
Was de cellen in 10 milliliter van het voorverwarmde medium en schud ze vervolgens opnieuw op in hetzelfde opgewarmde medium. Bij 2,5 miljoen cellen per milliliter met de cellen volledig in suspensie, decanteer 200 microliters in elk antilichaamvierkant op de deksels. Incubeer de deksels met cellen bij 37 graden Celsius met 5%CO2 in dit geval. 20 minuten is voldoende tijd om de granulen in de NK-cellen te polariseren na de incubatie was de deksels voorzichtig in PBS bij kamertemperatuur.
Begin met het toevoegen van een microliter van TRITTON X 100 aan een milliliter warme BD CY-effecten cyto perm-oplossing. Vorm vervolgens. Breng 200 microliter van deze oplossing aan op elk conditievierkant op de deksels.
Plaats vervolgens de cellen in het donker op kamertemperatuur en wacht 10 minuten. Wanneer de incubatie is voltooid, was de deksels voorzichtig in kleuringsbuffer. Droog vervolgens de randen van de omringende gebieden af met een wattenstaafje.
Voeg vervolgens 200 microliter van de primaire antilichaam in kleuringsbuffer toe aan de omringende gebieden en laat de deksels een half uur in het donker incuberen. Enkele goede secundaire antilichamen voor stead-beeldvorming zijn Alexa floor 4 88 Pacific oranje en Horizon V 500. Elk van deze werkt goed bij een verdunning van 1 op 200.
Na de incubatie was de deksels in kleuringsbuffer en dep ze droog. Breng vervolgens 200 microliter van het secundaire antilichaam aan op elk conditievierkant. Laat ze vervolgens nog eens 30 minuten in het donker staan.
Op dit punt is het mogelijk om na aanvullende wasbeurten extra antilichamen toe te voegen. Phin kan bijvoorbeeld worden toegepast bij 1 op 200 om f-actine te detecteren. Kies voor een montagemedium prolong boven vector shield, dat niet compatibel is met stead.
Als phin-kleuring wordt gebruikt, vermijd het gebruik van twee twee thio ethanol, terwijl dit echter oké is, breng nu 10 tot 20 microliters montagemedium aan op een slide. Met de deksel omgekeerd, laat het voorzichtig in het medium zakken en vermijd luchtbellen. Incubeer vervolgens de slide gedurende 24 uur.
Met de dek, schuif de volgende dag op, verzegel de deksel met nagellak en ga door met beeldvorming. Start de lasers en software. De stead-depletielaser moet opwarmen op 100% vermogen en gealigneerd zijn.
Gebruik het oculair om op het monster te focussen en draai vervolgens naar de software. Scan het eerste kanaal, het kanaal met de langste golflengte. Floor four, optimaliseer het vermogen van de laser, de positie van de excitatiebundel en het detectorbereik.
Vermijd instellingen boven de 100. Vang vervolgens een confocale afbeelding op en controleer op pixels. Saturatie, lijn en framegemiddelden zullen beide de pixelresolutie verbeteren.
Het doel is om onder de 30 nanometer per pixel te blijven. Enige verzadiging is acceptabel voor stead. Pas vervolgens de stead-depletiestroom toe bij 50% vermogen en vang een afbeelding op.
Als de resolutie verbetert, kan meer vermogen worden toegepast. Verder kan het aanpassen van de excitatielaservermogen of de lijngemiddelde of de versterking ook de resolutie verbeteren. Om de achtergrond te verminderen, past u 0,3 nanoseconden tijdspoorting toe en past u deze naar boven aan.
De nieuwe resolutie moet worden geschat met behulp van een volledige halfwaardebreedte maximumberekening. Zodra u tevreden bent, herhaalt u deze stappen met het tweede kanaal wanneer alle kanalen zijn aangepast. Controleer op spectraal overlap door enkele kleuringscontroles te beeldvormen met alle scansequenties.
Lichte overlap kan worden gecorrigeerd met spectraal ontmengen door de software, maar het is het beste om dit te vermijden of tot een minimum te beperken. Verwerf nu beelden voor kwantitatieve beeldvorming. Verkrijg minimaal 20 beelden per conditie volgens
Overzicht
Dit artikel illustreert een protocol voor het afbeelden van de cytotoxische immuunsynaps van NK-cellen met behulp van tweekleuren-STED-nanoscopie. De methode bereikt een resolutie van minder dan 100 nm voor synaps-eiwitten en het cytoskelet.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Immunologie
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Natural killer (NK)-cellen spelen een cruciale rol in immuunresponsen.
- Inzicht in de cytotoxische immuunsynaps is essentieel voor het begrijpen van celinteracties.
- STED-microscopie maakt resolutie-rijke beeldvorming van cellulaire structuren mogelijk.
- Er zijn uitdagingen bij het optimaliseren van de beeldvormingsparameters voor de beste resultaten.
Doel van de studie
- Om F-actine en andere structuren in de lytische synaps van NK-cellen te visualiseren.
- Om het begrip van de relatie tussen het cytoskelet en exocytose te verbeteren.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers die nieuw zijn met STED-microscopie.
Gebruikte methoden
- Recapitulatie van de immuunsynaps op glas met behulp van activerende antilichamen.
- Fixatie, permeabilisatie en kleuring van NK-cellen.
- Imaging met laser-scanning confocale microscopie gevolgd door STED.
- Toepassing van deconvolutie-algoritmen voor beeldbewerking.
Belangrijkste resultaten
- Bereikte een resolutie van minder dan 100 nm voor cellulaire structuren.
- Identificeerde belangrijke interacties tussen het cytoskelet en de secretie van lytische granula.
- Demonstreerde de effectiviteit van dual-color STED-imaging.
- Bood inzichten in potentiële valkuilen en optimalisatiestrategieën.
Conclusies
- Het protocol vergroot het begrip van de NK-celfunctie.
- STED-microscopie is een krachtig instrument voor het bestuderen van cellulaire interacties.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methodologie om andere cellulaire processen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dual-color time-gated STED-nanoscopie maakt visualisatie met een resolutie van minder dan 100 nm van de architectuur van de immunologische synaps mogelijk, waarmee direct de resolutiebeperkingen van conventionele fluorescentie-imaging in immuuncelonderzoek worden aangepakt. Deze mogelijkheid vergroot het mechanistische begrip van cytoskeletdynamiek en eiwitlokalisatie bij de NK-celsynaps, wat het voorspellende vertrouwen in vroege immuno-oncologie-ontdekkingen ondersteunt. De methode stelt teams in staat om de relaties tussen het cytoskelet en exocytose te onderzoeken, die cruciaal zijn voor targetvalidatie en functionele risicoreductie in programma's voor immuun-effectorcellen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt hoogresolutie-onderzoek naar de organisatie van het cytoskelet en eiwitten bij de NK-celsynaps mogelijk.
- Ondersteunt mechanische risicobeperking door actin-exocytose-relaties in de immuuneffectorfunctie te verduidelijken.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets in immuno-oncologie en celtherapie-pipelines.
Screening & Assayontwikkeling
- Faciliteert de preparatie van gevalideerde immuunsynapsmodellen voor downstream kwantitatieve imaging-workflows.
- Maakt reproduceerbare, kwantitatieve meting van eiwitcolocalisatie en subcellulaire lokalisatie mogelijk.
- Ondersteunt assay-standaardisatie en platformhergebruik voor functionele screening van immuuncellen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt beeldvormingsresultaten uit met ziekterelevante mechanismen van immuuncellen voor translationeel onderzoek naar biomarkers.
- Biedt continuïteit van mechanistische studies in de ontdekkingsfase naar preklinische modellen voor immuunmodulatie.
- Vermindert de risico's bij beslissingen over verdere ontwikkeling door een kwantitatieve beoordeling van de integriteit van de immuunsynaps mogelijk te maken.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze beeldvormingsmethode is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek en ondersteunt hypothese-testen, targetvalidatie en kwantitatieve analyses in het onderzoek naar immuuncellen.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothese-gestuurde analyse van cytoskelet- en proteïnedynamiek bij de immunologische synaps mogelijk.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare imaging-outputs voor functionele assays van immuuncellen.
- Analytica: Biedt hoogresolutie-metingen voor comparatieve analyse van proteïnelokalisatie en colokalisatie.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen mechanistische ontdekkingen en preklinische studies naar immuunmodulatie.
- Hergebruik op bedrijfsniveau: Vestigt een herbruikbaar imaging-platform voor diverse onderzoeken naar immuuncellen en synapsen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van targets voor immuuncellen.
- Operationele waarde: Standaardiseert imaging-workflows met hoge resolutie voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en vermindert biologische risico's in een laat stadium binnen immuno-oncologieportfolio's.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van therapeutische programma's op basis van immuuncellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in geavanceerde fluorescentiemicroscopie en immuuncelbiologie.
- Vereist toegang tot dual-color STED-instrumentatie en deconvolutiesoftware.
- Vereist strikte standaardisatie van beeldingsparameters en controles tussen teams.
- Aanpassing aan verschillende immuunceltypen en synapsmodellen kan protocoloptimalisatie vereisen.
- De resolutie en kwantitatieve output zijn afhankelijk van nauwkeurige uitlijning, gating en beeldverwerking.
