Name: Visualisatie van de immunologische Synapse door Dual Color Time-gated stimulated emission depletion (STED) Nanoscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Leer dual-color STED nanoscopie voor het visualiseren van de immunologische synapse in NK-cellen. Deze methode bereikt sub-100 nm resolutie van cytoskeletstructuren en helpt bij het begrijpen van exocytosemechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Geoff Daniels voor technische ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door R01 AI067946 te JSO

1. Coat Dekglaasjes met Antibody <ol><li> Voorverwarmen (bij 37 ° C) 30 ml RPMI 10% FCS media en 1 ml BD Cytofix / Cytoperm. </li><li> Bereid een oplossing van 5 ug / ml gezuiverd antilichaam in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Voor de activering van de NK92 cellijn, gebruik van anti-CD18 en anti-NKp30 aanbevolen. <ol><li> Markeer een ongeveer dubbeltje sized cirkel voor elke conditie op een # 1.5 dekglaasje met behulp van een PAP pen. Voor een tweekleurige experiment, moeten er vier voorwaarden: unstained, dual gekleurd, en twee enkele gebrandschilderde voorwaarden. Pipetteer 200 ul antilichaam oplossing in elke regio en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Was dekglaasjes door voorzichtig onderdompelen elk in 50 ml PBS in een 50 ml conische buis bij kamertemperatuur. Wassen onmiddellijk plaatsvinden voorafgaand aan de toevoeging van cellen en voorzichtigheid is geboden antilichaam drogen op het dekglaasje voorkomen. </li></ol></li></ol> 2. Activeer NK Cells on Coverslips, Fix en permeabilize <ol><li> Isoleer 5 x 10 5 NK92 cellen per conditie. Centrifuge en decanteren supernatant. Was eenmaal met 10 ml voorverwarmde media uit stap 1.1. Centrifuge en decanteren supernatant. <ol><li> Resuspendeer cellen in voorverwarmde media uit stap 1.1 bij een concentratie van 2,5 x 10 6 / ml. </li><li> Voorzichtig decanteren 200 ul naar het centrum van de regio die in punt 1.2.1. Incubeer bij 37 ° C gedurende 20 minuten bij 5% CO2. (Opmerking: deze keer kan worden verlengd of verlaagd, afhankelijk van de biologische functie van belang zijn voor NK-cel korrel polarisatie, 20 minuten is voldoende.). </li></ol></li><li> Na incubatie van cellen voorzichtig te wassen dekglaasjes door onderdompeling elk in 50 ml PBS kamertemperatuur in een 50 ml conische buis. </li><li> Voeg 1 ul van Triton X-100 aan 1 ml voorverwarmd Fix / Perm oplossing uit stap 1.1 en vortex grondig. Fix en permeabilize door toevoeging van 200 ul van Fix / Perm buffer (stap 2.3) aan cellen. Incubeer gedurende 10 min het donker bij kamertemperatuur. </li></ol> 3. Stain Cellen <ol><li> Bereid kleuring buffer: fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 1% BSA, 0,1% Saponine. <ol><li> Pesticide van primair antilichaam in 200 gl vlekken buffer (zie stap 3.1). (Opmerking: antilichaam moeten voor gebruik worden getitreerd). Vermijd het gebruik van primaire antilichaam dat wordt opgeworpen in dezelfde soort gebruikt voor het bekleden van de dekglaasje (stap 1.2). Vermijd ook Strepatividin-biotine koppelingen voor STED beeldvorming. </li><li> Volgende paragraaf 2.3.1, voorzichtig te wassen dekglaasjes in 50 ml vlekken buffer. Dep randen van PAP-pen regio met wattenstaafje om overtollige buffer te verwijderen. Solliciteer antilichaamoplossing aangemaakt in sectie 3.1.1. Incubeer 30 min in het donker bij kamertemperatuur. (Aanbevolen: incubeer dekglaasjes in dia doos met een vochtig keukenpapier om vochtigheid te behouden). </li></ol></li><li> Maak een oplossing van secundair antilichaam in 200 gl kleuringbuffer. Aanbevolen fluoroforen zijn Alexa Fluor 488, Pacific Oranje, en V500. Algemeen een 1:200 verdunning voor STED beeldvorming. <ol><li> Voorzichtig wassen dekglaasjes in 50 ml vlekken buffer. Dep randen van PAP-pen regio met wattenstaafje om overtollige buffer te verwijderen. Solliciteer secundair antilichaam oplossing. Incubeer 30 min in het donker bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Herhaal het wassen en kleuring voor extra eiwitten van belang. Als detecteren F-actine met Phalloidin kan dit worden opgenomen met secundaire antilichaam, doorgaans in een 1:200 verdunning. </li></ol> 4. Mount Dekglaasjes op Slides <ol><li> Bereid montage medium. Opmerking: Verleng of Verleng Gold voorkeur. Vectashield moet worden vermeden, omdat het niet verenigbaar is met STED. 2,2-thiodioethanol moet worden vermeden Phalloidin gebruikt. Mowiol is aanvaardbaar. </li><li> Geschieden ca. 10-20 ul montage drager van glijbaan. Omkeren dekglaasje (cel-kant naar beneden) en monteer dekglaasje voorzichtig, en zorg datvermijd introductie van luchtbellen. Incubeer dia&#39;s voor 24 uur (dekglaasje up) voorafgaand aan de beeldvorming. </li><li> Seal randen van dekglaasje met nagellak. </li></ol> 5. Experimentele opstelling <ol><li> Initiëren vereiste lasers en software. Initiëren STED uitputting laser op 100% vermogen. Lijn STED laser, die in het geval van commerciële systemen is vaak een geautomatiseerde procedure. </li><li> Focus van het monster, te beginnen met enkele gebrandschilderde controle, op de microscoop met oculairs. </li></ol> 6. Optimalisatie van Instellingen <ol><li> Scan de eerste kanaal en optimaliseren van laservermogen, excitatiebundel positie en detector bereik. Indien mogelijk, vermijd een winst van&gt; 100. Leg het beeld in confocale om de instellingen te optimaliseren. Lijn en / of frame middeling zal resolutie te verhogen. Controleer voor pixel verzadiging. Opmerking: Sommige verzadiging is in confocale aanvaardbaar als toepassing van STED zal de intensiteit van de emissie te verminderen. Voor STED, zal een optimale pixelgrootte kleiner dan 30 nm hoesteeds betere resolutie zal worden verkregen met kleinere pixel maten. De omvang van het gebied van belang af te beelden wordt de ondergrens van pixelgrootte dicteren. Kleinere pixelgroottes kan fotobleking verhogen. <ol><li> Solliciteer STED beeldopname uitputting balk en, te beginnen met 50% uitputting laservermogen. Als er een verbetering van de resolutie wordt gezien, kan meer uitputting laservermogen worden toegepast. In dit stadium kan het nodig excitatie laservermogen, gemiddelde ruwheid en / of versterking aan te passen. </li><li> Solliciteer tijd gating op de achtergrond (minimaal 0,3 ns) te verminderen. Instellingen aan te passen tot een verbetering van de resolutie dan confocale kan worden gezien. Resolutie kan worden benaderd door een schatting volle breedte half maximum (FWHM). Dit is de afstand van de helft van de maximale intensiteit van een Gaussische piek gecreëerd door een lijn profiel over de structuur van belang en is een veel gebruikte werkwijze voor het schatten resolutie. </li><li> Zodra het eerste kanaal is bevredigend, start een tweede reeks voor sequential scannen. In het algemeen is het het beste om eerst de langere golflengte fluorofoor scannen. Herhaal stap 6.1 op het tweede kanaal. </li></ol></li><li> Bevestigen gebrek aan spectrale overlapping door beeldvorming enkele gebrandschilderde controles met zowel scansequenties. Milde spectrale overlap kan worden gecorrigeerd met behulp van spectraal-un mix-functies in de software, dient echter zoveel mogelijk vermeden worden. </li></ol> 7. Image Acquisition <ol><li> Acquire beelden. Voor kwantitatieve beeldvorming, is het raadzaam om ten minste 20 beelden / conditie te verkrijgen. Het exacte aantal moet echter worden gedefinieerd op basis van de experimentele vraag in overleg met een statistische benadering, zoals sample size berekening. Sparen experiment. </li></ol> 8. Deconvolutie <ol><li> Open bestand met deconvolution software of batch-processor. Controleer de parameters voor elk kanaal met behulp van software. Bevestig excitatie en emissie spectra van elk kanaal, STED uitputting emissie, en imaging richtingtie (omhoog of omlaag, als het beeld is 3-dimensionaal) in het bijzonder. </li><li> Deconvolutie met de deconvolutie wizard. De standaardinstellingen zijn over het algemeen voldoende, maar signaal-ruisverhouding (SNTR) zal variëren van fluorofoor naar fluorofoor en zal moeten worden bepaald voor elk kanaal en elk experiment afzonderlijk. </li></ol>

<ol><li>Stinchcombe, J. C., Bossi, G., Booth, S., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse+of+CTL+contains+a+secretory+domain+and+membrane+bridges%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse of CTL contains a secretory domain and membrane bridges.</a> Immunity. 15 (5), 751-761 (2001).</li>
<li>Grakoui, A., Bromley, S. K., Sumen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mature+activating+natural+killer+cell+immunologic+synapse+is+formed+in+distinct+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (24), 14151-14156 (2003).</li>
<li>Treanor, B., Lanigan, P. M., Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microclusters+of+inhibitory+killer+immunoglobulin-like+receptor+signaling+at+natural+killer+cell+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microclusters of inhibitory killer immunoglobulin-like receptor signaling at natural killer cell immunological synapses.</a> J. Cell Biol. 174 (1), 153-161 (2006).</li>
<li>Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+signaling+blocks+activating+receptor+clustering+and+induces+cytoskeletal+retraction+in+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells.</a> J. Cell Biol. 192 (4), 675-690 (2011).</li>
<li>Beemiller, P., Jacobelli, J., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+the+movement+of+signaling+microclusters+with+cellular+motility+in+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Integration of the movement of signaling microclusters with cellular motility in immunological synapses.</a> Nat. Immunol. 13 (8), 787-795 (2012).</li>
<li>Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+agonist+MHC-peptide+complex-dependent+T+cell+receptor+microclusters+as+scaffolds+for+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling.</a> J. Exp. Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).</li>
<li>Mossman, K. D., Campi, G., Groves, J. T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+TCR+signaling+from+geometrically+repatterned+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altered TCR signaling from geometrically repatterned immunological synapses.</a> Science. 310 (5751), 1191-1193 (2005).</li>
<li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li>
<li>Yokosuka, T., Sakata-Sogawa, K., Kobayashi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat. Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 285-314 (2010).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse%3A+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front. Immunol. 3, 421 (2012).</li>
<li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 19 (11), 780-782 (1994).</li>
<li>Klar, T. A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+resolution+in+far-field+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).</li>
<li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li>
<li>Rankin, B. R., Moneron, G., Wurm, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscopy+in+a+living+multicellular+organism+expressing+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Nanoscopy in a living multicellular organism expressing GFP.</a> Biophys. J. 100 (12), 63-65 (2011).</li>
<li>Willig, K. I., Kellner, R. R., Medda, R., Hein, B., Jakobs, S., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+resolution+in+GFP-based+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale resolution in GFP-based microscopy.</a> Nat. Methods. 3 (9), 721-723 (2006).</li>
<li>Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), (2011).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+channel+STED+nanoscopy+of+lytic+granules+on+actin+filaments+in+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells.</a> Commun. Integr. Biol. 5 (2), 184-186 (2012).</li>
<li>Singh, H., Lu, R., Rodriguez, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+quantification+of+cardiac+mitochondrial+protein+clusters+with+STED+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Visualization and quantification of cardiac mitochondrial protein clusters with STED microscopy.</a> Mitochondrion. 12 (2), 230-236 (2012).</li>
<li>Tonnesen, J., Nagerl UV, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+imaging+for+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Superresolution imaging for neuroscience.</a> Exp. Neurol. 242, 33-40 (2013).</li>
<li>Kempf, C., Staudt, T., Bingen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+multicolor+STED+nanoscopy+of+presynaptic+proteins+in+the+calyx+of+held%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tissue multicolor STED nanoscopy of presynaptic proteins in the calyx of held.</a> PLoS One. 8 (4), (2013).</li>
<li>Jans, D. C., Wurm, C. A., Riedel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+super-resolution+microscopy+reveals+an+array+of+MINOS+clusters+along+human+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">STED super-resolution microscopy reveals an array of MINOS clusters along human mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (22), 8936-8941 (2013).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Gustafsson, M. G., Shao, L., Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination).</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 13 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Cdc42-interacting protein-4 functionally links actin and microtubule networks at the cytolytic NK cell immunological. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22J.+Exp.+Med%22">J. Exp. Med</a>. Banerjee, P. P., Pandey, R., Zheng, R., Suhoski,, Monaco-Shawver, L., Orange, J. S. 204 (10), 2305-2320 (2007).</li>
<li>Vicidomini, G., Moneron, G., Han, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharper+low-power+STED+nanoscopy+by+time+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sharper low-power STED nanoscopy by time gating.</a> Nat. Methods. 8 (7), 571-573 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen. Gedeeltelijke publicatie kosten van dit artikel werd gedragen door Leica Microsystems, Inc

De verbetering van de resolutie dan confocale zal enigszins afhankelijk van factoren die niet kunnen worden gecontroleerd. Deze factoren omvatten kleine afwijkingen in dekglas dikte en inconsistenties in de montage media. Het is belangrijk om de temperatuur en vochtigheid in de beeldvorming kamer zo constant mogelijk te houden, en de STED balk worden uitgelijnd ongeveer elke 60 minuten. Zoals vermeld in procedures, moet het gebruik van Vectashield montage medium worden vermeden, want dit is niet compatibel met STED. In aanvulling op die, moet men altijd gebruik maken van # 1.5 dekglaasjes, en indien beschikbaar, die te gebruiken die zijn geverifieerd aan een specifieke dikte. Een wijziging van de hier beschreven aanpak is om het extra kanalen in confocale, met behulp van fluoroforen die uitzenden op een langere golflengte dan de STED balk. Zo kan men het tot vier kanalen (twee in confocale twee in STED). Als het nemen van deze aanpak, maar de kanalen met fluoroforen everzendende boven de STED uitputting laser zal eerst moeten worden afgebeeld, zoals de toepassing van de STED balk zal fotonen uitputten in deze kanalen. Een voordeel van deze techniek is de toepassing van tijd gating, die ook verbeterd resolutie confocale door het elimineren van emissie van fotonen met korte levensduur 34. In het bijzonder zal het gebruik van tijd gating, de timing van de emissie detectoren te corresponderen met gepulste excitatie STED, achtergrond fluorescentie dalen van reflectie van dekglaasje glas bij beeldvorming dichtbij. Zelfs in een experiment niet geschikt voor STED, bij gebruik van een gepulste excitatie bron, tijd gating kan een nuttig instrument voor de verbetering van resolutie confocale zijn. Er zijn verschillende modificaties die kunnen worden gebruikt om resolutie STED verbeteren. Een is om de grootte van de pinhole van de standaard 1 Airy eenheid verlagen, maar dit zal ook de hoeveelheid licht die het monster te verlagen. Dit kan worden gecompenseerd door de laser macht of gewin. Een andere is het gemiddelde ruwheid verhogen, wat de hoeveelheid informatie verzameld voor elke foton toenemen, verbeteren resolutie. Nogmaals, dit echter ten koste van fotobleken van het monster, zodat een evenwicht moet worden gevonden tussen resolutie en bleken. Evenzo zal het gebruik van fluorescente eiwitten zoals GFP zorgvuldige optimalisatie vereisen bleken voorkomen. Dit kan worden bewerkstelligd door het verlagen STED laservermogen indien nodig. Langere tijdstippen zal ook zorgen voor een grotere foton herstel en verminderen bleken. Correctie voor photobleaching moet rekening houden bij het analyseren van live-STED. Natuurlijk beeldvorming in 3 dimensies STED is ook mogelijk, en ook een verbetering ten opzichte van conventionele confocale beeldvorming geven. Dit geldt met name als dit gebeurt in combinatie met deconvolutie, maar er moet worden genomen voor het corrigeren van afwijking die optreedt tijdens beeldvorming meerdere vlakken in de z-as. Bij gebruik van Huygens softwarenaar Deconvolutie, wordt deze correctie verkregen met behulp van de &quot;stabiliseren beeld&quot; eigenschap. Met deze aanpak, zal resolutie in de z-as worden verbeterd. Dit is een grote verbetering ten opzichte van conventionele confocale beeldvorming, die arme axiale resolutie heeft, en zelfs over zichzelf gewoon STED, die heeft ook een relatief slechte z-as resolutie. Terwijl het verwerven van meerdere stapels in STED, moeten maatregelen genomen worden om het bleken van het monster te voorkomen, en indien nodig een lijn middeling of laservermogen intensiteit kan verminderen om dat te doen. Ook moet worden opgemerkt dat indien beeldvorming andere fluoroforen die niet geschikt zijn STED toepassing van de uitputting balk in de eerste sequentiële scan zou emissie verhinderen deze kanalen. Daarom is een gemengde STED / confocale benadering (bij gebruik van confocale scanning in kanalen die uitzenden bij een golflengte groter dan 592 nm) helaas niet geschikt voor 3D. Samengevat hebben wij STED gekozen als benadering door zijn relatieve gemak van appbekendmaking en verbetering van de resolutie ten opzichte van standaard confocale beeldvorming. Voor het afbeelden van het immuunsysteem synaps, is het een effectieve en waardevolle techniek die ons in staat stelt om details in F-actine architectuur niet mogelijk te zien bij resolutie dan 200 nm bewezen. Hoewel veel van deze gegevens lijkt subtiel, kunnen ze een diepgaand effect op NK celfunctie hebben. Zo passen we de nieuwste nanoscopic imaging technologie om het inwinnen van informatie die essentieel is voor het behoud van de menselijke gezondheid.

De immunologische synaps is een complex milieu van signalering eiwitten en cytoskelet elementen. De cytolytische synaps werd oorspronkelijk beschreven als een &quot;bulls-eye&quot; structuur met een ring van actine en adhesiemoleculen rondom een centrale secretoire domein 1-4. Maar we weten nu dat het bestaat uit microscopisch kleine domeinen van actieve signalering die continue dynamische cytoskelet reorganisatie voor de functie 5-11 vereisen. Veel van de informatie die we nu hebben over de synaps is afgeleid van microscopie en immunologen hebben early adopters van cutting-edge imaging technologie. Een van deze nieuwe technologie is super-resolutie microscopie. Conventionele lichtmicroscopie ruimtelijk beperkt door de diffractie dan het licht, waarvan de ondergrens resolutie voor fluorescentiemicroscopie, zoals confocale, bij ongeveer 200 nm bevat. De laatste jaren zijn verscheidene technieken develope geweestd waarmee resolutie onder de diffractie barrière. Deze omvatten stimulatie emission depletion microscopie (STED), gestructureerde verlichting microscopie (SIM), stochastisch opgelost microscopie (STORM), en fotoactiveerbare licht microscopie (PALM). Deze technieken zijn beoordeeld in detail elders 12-15, maar worden hieronder beschreven. Subdiffraction beperkte resolutie wordt gegenereerd op een unieke manier in elk systeem. De keuze van een super-resolutie techniek derhalve worden bepaald door het experiment en experimentele systeem plaats. STED super resolutie wordt bereikt met behulp van een hoge intensiteit ringkernen uitputting balk die selectief &quot;stiltes&quot; fluorescentie rond elk fluorofore van belang na excitatie, wat resulteert in subdiffraction beperkte fluorescentie microscopie 16-18. Een voordeel van STED is dat imago overname is snel en vergt relatief weinig post-processing. Terwijl kleurstof selectie wordt bepaald door de spectrale positie van de uitputting balk, die in de handel verkrijgbaar systeem bevindt zich op 592 nm, verschillende commercieel beschikbare kleurstoffen zijn dat combinaties van twee fluoroforen mogelijk. Bovendien kunnen algemeen gebruikte fluorescente reporters zoals GFP worden afgebeeld, waardoor levende celexperimenten mogelijk 19,20. We hebben voorheen STED regio&#39;s van F-actine hypodensity die worden gebruikt door NK cellen voor degranulatie 21,22 identificeren en te kwantificeren. Wij stellen STED is een goede keuze voor het afbeelden van het immuunsysteem synaps vanwege de relatief flexibel beschikbare fluoroforen en superieure verbetering van de resolutie in het xy as. Bovendien, de commercieel beschikbare STED systeem gebruikt voor deze experimenten, het gebruik van een hoge snelheid (12.000 Hz) resonantie scanner maakt snelle verwerving van beelden met minimale schade aan monsters. Beperkte flexibiliteit in kleurstof selectie wordt beschouwd als een nadeel van STED 12,echter tweekleurige STED is relatief eenvoudig met een aantal commercieel verkrijgbare fluoroforen. De integratie van STED met een confocale laser scanning microscoop maakt het ook mogelijk voor een extra confocale beeldvorming in combinatie met STED, dus terwijl STED is beperkt tot twee kanalen kunnen extra structuren worden afgebeeld in confocale met een resolutie van ongeveer 200 nm (E. Mace, ongepubliceerde waarnemingen ). Terwijl we beschrijven het gebruik van STED voor beeldvorming immuuncellen, wordt deze techniek toegepast op een verscheidenheid van celtypen, met inbegrip van neurale cellen en voor het visualiseren van verschillende celstructuren 23-26. SIM gebruikt een andere benadering van subdiffraction beperkt beelden te genereren. Door het visualiseren bekende periodieke excitatiepatronen, kan informatie worden verkregen over de onbekende structuur bestudeerd volgende wiskundige transformatie 27. Dit levert een verhoging van de resolutie te ~ 100 nm lateraal 28,29. Het voordeel van SIM is dat het iis geschikt voor alle standaard confocale kleurstoffen en probes, maar het nadeel is dat het veel langzamer afbeeldingen ophalen en deze vereisen langdurige nabewerking 12. Dit beperkt ook het gebruik ervan voor live cell imaging. Tenslotte kan super-resolutie beelden worden gegenereerd door stochastische foto-schakelen van fluoroforen. Deze aanpak wordt uitgebuit in foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) en stochastische optische reconstructie microscopie (STORM). Door het scannen van meerdere camera frames en lokaliseren willekeurig geactiveerde moleculen die &quot;aan&quot; en &quot;uit&quot; in de tijd, worden de beelden met 20-30 nm resolutie gegenereerd uit geaccumuleerde frames 30-32. De trade-off voor deze resolutie is de tijd die nodig is om beelden te verwerven. Hier laten we zien, in detail, het protocol voor het voorbereiden en beeldvorming dual kleurstalen in STED. In dit systeem, excitatie is met een gepulste, te stemmen, wit licht laser. Vanwege de aardvan de gepulste excitatiebundel, wordt tijd gating van de detectie mogelijk gemaakt en verdere verhogingen resolutie. Bovendien is het systeem uitgerust met gadolinium hybride (HYD) detectoren, die gevoeliger dan conventionele fotomultiplicatorbuizen zijn, waardoor lagere laservermogen eisen. De uitputting balk STED wordt continu toegepast en is afgestemd op 592 nm, waarbij de keuze van kleurstoffen beschikbaar voor twee kleuren STED zal dicteren. Algemeen gebruikte kleurstof combinaties omvatten over het algemeen een prikkelbaar bij 488 nm (zoals Alexa Fluor 488, Oregon Green, DyLights groen of Chromeo 488) en een prikkelbaar bij 458 nm (zoals Pacific Oranje of Horizon V500). Dus, terwijl de detectie van de twee kleurstoffen zal in een vergelijkbare reeks (en beide zijn toegankelijk door de uitputting laser), zal excitatie optreden met verschillende golflengten. Met een afstembare wit licht laser en afstembare detectoren, het maximaliseren signaal terwijl het elimineren van spectrale overlap is redelijk eenvoudig. Als zodanig hebben we goede succes met combinat gehadionen van commercieel beschikbare kleurstoffen, zoals Pacific Oranje en Alexa Fluor 488 (hier gebruikt). Het protocol is afgestemd op en beschrijft de evaluatie van menselijke NK cellen als die aangeeft de historische focus van ons laboratorium. We zijn specifiek gebruik te maken van de NK92 cellijn in dit voorbeeld want dat is degene die we hebben in onze experimentele werk 21,33 regelmatig toegepast.

<table><tbody><tr><td>#1.5 dekglasjes</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Rund serum albumine</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Wattenstaafjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S450941</td><td></td></tr><tr><td>Falcon centrifuge buizen (50 ml)</td><td>VWR</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runder serum (FCS) (500 ml)</td><td>Atlantic Biologicals</td><td>S11050</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-konijn Pacific Orange</td><td>Life Technologies</td><td>P31584</td><td></td></tr><tr><td>Laboratorium doekjes</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Nagellak</td><td>VWR</td><td>100491-940</td><td></td></tr><tr><td>NK-92 cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferd zout water</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Prolong anti-fade reagens</td><td>Life Technologies</td><td>P7481</td><td></td></tr><tr><td>Gezuiverd anti-CD18</td><td>Biolegend</td><td>301202</td><td></td></tr><tr><td>Gezuiverd anti-NKp30</td><td>Biolegend</td><td>325202</td><td></td></tr><tr><td>Gezuiverd anti-perforine</td><td>Biolegend</td><td>308102</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium (500 ml)</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Saponine van Quillaja schors</td><td>Sigma</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP pen</td><td>Life Technologies</td><td>008899</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22142</td><td></td></tr><tr><td>Huygens deconvolutie software</td><td>SVI</td><td>Contact company</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS STED microscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td>contact company</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie van de immunologische synapse door dual color time-gated stimulated emission depletion (sted) nanoscopy

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cellen vormen strak gereguleerd, fijn afgestemde immunologische synapsen (IS) om viraal geïnfecteerde of tumorigene cellen lyseren. Dynamische actine reorganisatie is cruciaal voor de functie van NK cellen en de vorming van de IS. Beeldvorming van F-actine in de synaps is van oudsher gebruikt confocale microscopie, maar de diffractie limiet van licht beperkt resolutie van fluorescentie microscopie, waaronder confocale, tot ongeveer 200 nm. Recente ontwikkelingen in de imaging technologie hebben de ontwikkeling van subdiffraction beperkte super-resolutie beeldvorming ingeschakeld. Om de F-actine architectuur te visualiseren op de IS recapituleren we de NK-cel cytotoxische synaps door vast te houden NK-cellen te activeren receptor op glas. Vervolgens hebben we het eiwitten van belang met behulp van twee-kleuren stimulated emission depletion microscopie (STED). Dit resulteert in &lt;80 nm resolutie in de synaps. Hierin worden de stappen van de monstervoorbereiding en de acquisitie van beelden met behulp van dual col beschrijven weof STED nanoscopy aan F-actine te visualiseren op het NK IS. We illustreren ook optimalisering van afnemen van het monster met behulp van Leica SP8 software en-tijd gated STED. Tot slot maken we gebruik van Huygens software voor post-processing deconvolutie van beelden.

Het is duidelijk dat een primair doel van super-resolutie afbeelding een verbetering ten opzichte van conventionele confocale microscopie. Echter, er zijn een aantal valkuilen die kunnen leiden tot suboptimale oplossing. Deze vereisen dat elk experiment afzonderlijk worden geoptimaliseerd. In onze representatief experiment, we beeldvorming de F-actine netwerk een NK-cel geactiveerd door antilichaam gebonden aan glas. Veelvoorkomende oorzaken van (en correcties voor) een gebrek aan een betere resolutie van STED dan confocale zijn als volgt: <ol><li> Onder-sampling (figuur 1a). Kan dit leiden tot korreligheid en verlies van pixel informatie, zoals blijkt uit een slechte resolutie van F-actine filamenten. Verhoogde lijn of frame middeling kan dit vaak corrigeren. </li><li> Bleken en / of over-sampling (Figuur 1b). Dit kan veroorzaakt worden door lange pixelverblijftijd als gevolg van buitensporige lijn middeling. Als alternatief kan het gevolg van over-scan van het beeld vóór de verwerving, met inbegrip van over-gebruik van zijnde uitputting laser. Dit resulteert vaak in wazige of vage beelden. Dit kan worden gecorrigeerd door het scannen van het gebied van belang slechts minimaal voordat u tot aanschaf of, indien mogelijk, steeds sneller laser scan. Als het probleem aanhoudt, kan de uitputting laservermogen worden verminderd. </li></ol> Door het bereiken van de juiste balans van pixelverblijftijd, excitatie laservermogen en uitputting laservermogen, een beeld met verbeterde resolutie en voldoende informatie kan worden gegenereerd (figuur 1c). De resolutie kan verder worden verbeterd door het gebruik van deconvolutie (figuur 1d). Bij overname wordt geoptimaliseerd, zal deconvolutie resolutie verbetert zowel kwalitatief als kwantitatief en sub-100 nm resolutie moet routinematig haalbaar zijn. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1.jpg" /> Figuur 1. Optimalisatie van verwerving en de gemeenschappelijke valkuilen van STED beeldvorming. NK92 cellen geactiveerd op anti-CD18 en-NKp30 gecoat glas voor 20 min daarna gefixeerd, permeabel en gekleurd voor F-actine met Phalloidin Alexa Fluor 488. A) Een voorbeeld van verlies van beeldinformatie als gevolg van onder-sampling. b) Een voorbeeld van verlies van resolutie vanwege bleken / over-sampling c) de voorwaarden geoptimaliseerd d) geoptimaliseerde omstandigheden leiden tot een grotere verbetering van de resolutie met deconvolutie. Schaal bar = 5 micrometer.

Hier illustreren we het protocol voor beeldvorming door twee kleuren STED nanoscopy de cytotoxische immuun synaps van NK-cellen samengevat op glas. Met deze methode krijgen we sub-100 nm resolutie van synapseiwitten en het cytoskelet.

Visualisatie van de immunologische Synapse door Dual Color Time-gated stimulated emission depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Het algemene doel van deze procedure is om structuren zoals F-actine in de lytische synaps van NK-cellen te visualiseren met behulp van TED-microscopie. Dit wordt bereikt door eerst de synaps op glas te recreëren met behulp van een activerend antilichaam. De tweede stap van de procedure is het fixeren, permeabiliseren en kleuren van de cellen voor de structuren van belang.Vervolgens worden de coupes afgebeeld met laser-scanning confocale microscopie, gevolgd door de toepassing van STED-depletie voor een verhoogde beeldresolutie. De laatste stap is het verwerken van de beelden met een deconvolutie-algoritme. Uiteindelijk kunnen de resultaten een resolutie van minder dan 100 nanometer van cellulaire structuren laten zien dankzij tweekleuren-STED en endoscopie.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de celbiologie, zoals de relatie tussen het cytoskelet en exocytose. In dit geval zijn wij geïnteresseerd in de secretie van gespecialiseerde lysosomen, genaamd lytische granula, door natural killer-cellen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite ondervinden, omdat er meerdere variabelen zijn die kunnen worden aangepast bij de toepassing van de TED-depletielaser.Een onjuiste toepassing van de depletiebundel zal leiden tot een verslechtering in plaats van een verbetering van de resolutie. Warm ter voorbereiding 30 milliliter RPMI-medium met 10% FCS en apart één milliliter BD Cytoperm beide op tot 37 graden Celsius. Begin vervolgens met het proces van het coaten van de dekglasjes met antilichamen.Neem dekglasjes van nummer 1,5 en maak met een PAP-pen muntvormige vierkantjes op de dekglasjes. Bereid één vierkantje voor per geteste conditie.Vul elke cirkel met 200 µL antilichaam met een concentratie van 5 µg/mL in PBS. Gebruik voor de activatie van NK 92-cellen anti-CD 18- en anti-NK P 30-antilichamen. Incubeer de geladen dekglasjes gedurende een half uur bij 37 °C en spoel deze vervolgens af door ze kort in PBS op kamertemperatuur te dompelen. VoegH direct daarna de cellen toe voor elke geteste conditie; er moeten 500.000 cellen gereedstaan voor gebruik.Was de cellen in 10 milliliters voorverwarmd medium en resuspendeer ze vervolgens in hetzelfde verwarmde medium. Bij een concentratie van 2,5 miljoen cellen per milliliter en met de cellen volledig in suspensie, giet 200 microliters in elk antilichaamveld op de dekglasplaatjes. Incubeer de dekglasplaatjes met cellen bij 37 degrees Celsius met 5%CO2; in dit geval is 20 minuten voldoende tijd om de granulaten in de NK-cellen te polariseren. Was na de incubatie de dekglasplaatjes voorzichtig in PBS bij kamertemperatuur.Begin met het toevoegen van 1 µL TRITTON X 100 aan 1 mL warme BD CY effects cyto perm-oplossing. Vortex vervolgens. Breng 200 µL van deze oplossing aan op elk conditievak op de dekglasjes.Plaats de cellen vervolgens in het donker bij kamertemperatuur en wacht 10 minuten. Wanneer de incubatie is voltooid, worden de dekglasjes voorzichtig gewassen in kleuringsbuffer. Droog vervolgens de randen van de omringende gebieden af met een wattenstaafje.Voeg vervolgens 200 µL van het primaire antilichaam in kleuringsbuffer toe aan de omringende regio's en laat de dekglasjes een half uur in het donker incuberen. Enkele geschikte secundaire antilichamen voor stead-imaging zijn Alexa Fluor 488, Pacific Orange en Horizon V 500. Elk van deze werkt goed bij een verdunning van 1:200.Na de incubatiewassing worden de dekglasjes in de kleuringsbuffer geplaatst en drooggedept. Breng, zoals voorheen, 200 µL van het secundaire antilichaam aan op elk conditievak. Laat deze vervolgens nogmaals 30 minuten in het donker rusten.Op dit punt is het mogelijk om na extra wasbeurten aanvullende antilichamen toe te voegen. Bijvoorbeeld, Phalloidine kan in een verdunning van 1:200 worden toegepast om f-actine aan te tonen. Kies voor het montagemedium Prolong in plaats van Vectashield, aangezien dit laatste niet compatibel is met STEAD.Indien phin-kleuring wordt gebruikt, dient het gebruik van twee thio-ethanol vermeden te worden, hoewel het nu wel acceptabel is; breng vervolgens 10 tot 20 µL montage medium aan op een objectglas. Laat het dekglas, terwijl het omgekeerd wordt gehouden, voorzichtig in het medium zakken en voorkom daarbij de vorming van luchtbellen. Incubeer het objectglas daarna gedurende 24 uur.Plaats de volgende dag het dekglas, verzegel het dekglas met nagellak en ga over tot het maken van beelden. Start de lasers en de software op. De STED-depletielaser moet opwarmen bij 100% vermogen en moet worden uitgelijnd.Stel het oculair scherp op het monster en schakel daarna over naar de software. Scan het eerste kanaal, het kanaal met de langste golflengte. Optimaliseer in stap vier het laservermogen, de positie van de excitatiebundel en het detectorbereik.Vermijd instellingen boven de 100. Maak vervolgens een confocale opname en controleer op pixelverzadiging; lijn- en frame-averaging zullen beide de pixelresolutie verbeteren.Het doel is om onder de 30 nanometer per pixel te blijven. Enige verzadiging is acceptabel voor stead. Pas vervolgens de stead-depletiebundel toe bij 50% vermogen en leg een afbeelding vast.Als de resolutie verbetert, kan er meer vermogen worden toegepast. Daarnaast kan het aanpassen van het vermogen van de excitatielaser, de lijngemiddelde waarde of de gain de resolutie ook verbeteren. Om de achtergrond te verminderen, kan een time gating van 0,3 nanoseconden worden toegepast en vervolgens naar boven worden bijgesteld.De nieuwe resolutie moet worden geschat met behulp van een volledige berekening van de halve maximale breedte. Zodra het resultaat bevredigend is, worden deze stappen herhaald voor het tweede kanaal, totdat alle kanalen zijn afgesteld. Controleer op spectrale overlap door enkelvoudige kleuringscontroles te beelden met alle scansequenties.Lichte overlap kan met spectrale ontmenging door de software worden gecorrigeerd, maar het is het beste om dit te vermijden of tot een minimum te beperken. Neem nu beelden op voor kwantitatieve beeldvorming. Verkrijg ten minste 20 beelden per conditie volgens de experimentele condities.Om de opgeslagen beelden te deconvolueren, opent u de bestanden in de geschikte software. Controleer de parameters van elk kanaal, specifiek de excitatie- en emissiespectra, de steady-state depletion-emissie en de beeldrichting. Pas vervolgens de deconvolutieberekeningen van de software toe.Standaardinstellingen zijn meestal voldoende, maar de signaal-ruisverhouding zal variëren per vloerkracht, waardoor deze parameter handmatig voor het experiment moet worden ingesteld. Er zijn enkele veelvoorkomende valkuilen die kunnen leiden tot een suboptimale resolutie met stead. Eén daarvan is onderbemonstering.Dit leidt tot korreligheid en verlies van pixelinformatie, zoals te zien is in deze f actinefilamenten. Het verhogen van het gemiddelde per lijn of frame lost dit probleem vaak op. Een ander probleem is bleaching of oversampling veroorzaakt door langdurige pixelblootstelling.De verblijftijd, meestal veroorzaakt door overmatige lijnmiddeling tijdens het scannen voorafgaand aan de beeldacquisitie, kan eveneens de oorzaak zijn en kan worden gecorrigeerd door een kleinere scan uit te voeren vóór het vastleggen van beelden of door een hogere scansnelheid te gebruiken. Het verlagen van het laservermogen kan ook helpen om alles optimaal te laten functioneren. De beeldkwaliteit zal hierdoor drastisch verbeteren.Deconvolutie zal de afbeelding verder verbeteren, zowel kwantitatief als kwalitatief. Tijdens deze procedure zou routineus een resolutie van minder dan 100 nanometer behaald moeten worden.Het is belangrijk om te onthouden dat er vóór elk experiment en daarna ongeveer elk uur volgens deze procedure een stabiele uitlijning van de straal moet worden uitgevoerd. Andere methoden, zoals kwantitatieve analyse, kunnen worden toegepast om aanvullende vragen over colocalisatie, subcellulaire lokalisatie en moleculaire interacties te beantwoorden.

visualization-immunological-synapse-dual-color-time-gated-stimulated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Neisseria meningitidis (Nm), een gram negatieve mens-specifieke respiratoire pathogeen, kan binden aan menselijke α-actinine. Hier presenteren wij een protocol voor de visualisatie van colocalisation van de bacterie met de intracellulaire α-actinine na bacteriële binnenkomst in menselijke hersenen microvasculaire endotheelcellen (HBMECs).

Visualisatie en kwantificering van intracellulaire interacties van Neisseria meningitidis En Human α-actinine door Confocale Imaging

Dit protocol beschrijft hoe u synaps nummer zowel in gedissocieerde neuronale cultuur en in de hersenen secties met behulp van immunocytochemie kwantificeren. Met behulp van vak-specifieke antilichamen, we label presynaptische terminals alsmede ten aanzien sites van postsynaptische specialisatie. We definiëren synapsen als punten van colocalization tussen de signalen die door deze markers.

Het kwantificeren van Synapsen: een immunocytochemie-gebaseerde test te Synapse Number Kwantificeer

This video demonstrates a technique for visualizing the formation of the immunological synapse in natural killer (NK) cells on a supported lipid bilayer (SLB). The SLB is first labeled with a fluorophore-tagged NK cell activating receptor ligand, followed by incubation with NK cells. Subsequently, the cells are stained for polymerized actin and perforin-positive lytic granules. This approach enables the visualization of synapse formation using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

Super-Resolution Imaging of NK Cell Immunological Synapse Formation on a Supported Lipid Bilayer

This video demonstrates live-cell imaging of immunological synapse topology, investigating the interactions between T lymphocytes and epithelial cells carrying fluorescent antigens. Fluorescence microscopy reveals red cytoplasm displacement and yellow membrane rings in endothelial cells, indicating the formation of immunological synapses.

Assessing Immunological Synapse Topology through Live-Cell Imaging

Vierdimensionale (4D) beeldvorming wordt gebruikt om het gedrag en interacties tussen twee soorten endosomen in levende gewervelde zenuwuiteinden bestuderen. Beweging van deze kleine structuren wordt gekenmerkt in drie dimensies, waardoor de bevestiging van evenementen zoals endosome fusie en de exocytose.

Visualisatie van endosoom Dynamiek in woon zenuwuiteinden met vier-dimensionale Fluorescentie Imaging

We beschrijven hier een combinatie van de glas-ondersteunde lipide dubbellaagstechniek voor het vormen van immunologische synapsen met de superresolutie-beeldtechniek van gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie. Het doel van dit protocol is gebruikers de nodige instructies te geven om deze twee technieken met succes uit te voeren.

Super-resolutie beeldvorming van de Natural Killer Cell Immunological Synapse op een glas-ondersteunde Planar lipidendubbellaag

Adaptieve immuniteit wordt gecontroleerd door dynamische 'immunologische synapsen' gevormd tussen T-cellen en antigeen presenterende cellen. Dit protocol beschrijft methoden voor het onderzoeken van endotheelcellen, zowel als onderbelichte fysiologische APC's als ook als een nieuw type 'planair cellulair APC-model'.

Een endotheliale Planar Cell Model for Imaging Immunologische Synapse Dynamics

Presenteren we een protocol voor het gebruik van STED microscopie gelijktijdig afbeelding actine structuren, microtubuli en microtubulus plus-end bindende proteïnen in B-cellen die zich hebben verspreid op coverslips bekleed met antilichamen aan de B-cel receptor, een model voor de eerste fase van immuun synapse formatie.

Visualiseren van de actine en microtubulus Cytoskeletons in de B-cel immuun Synaps met behulp van de gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie

Het algemene doel van deze methodiek is geven de optimale proefomstandigheden van monstervoorbereiding Beeldacquisitie en wederopbouw om uit te voeren van 2D dubbele dSTORM kleurenafbeeldingen van microtubuli en intermediaire filamenten in vaste...

Imaging Intermediaire filamenten en microtubuli met 2-dimensionale directe stochastische optische wederopbouw microscopie

Dit protocol beelden zowel de immunologische Synapse vorming en de daaropvolgende gepolariseerde secretoire verkeer naar de immunologische Synapse. Celconjugaten werden gevormd tussen een superantigen-gepulseerde Raji-cel (optredend als een antigeen-presentercel) en een Jurkat-kloon (optredend als effector helper T lymfocyten).

Imaging van de humane immunologische SYNAPS

Dit protocol beschrijft een methode voor morfometrische analyse van neuromusculaire juncties door gecombineerde confocale en STED-microscopie die wordt gebruikt om pathologische veranderingen in muismodellen van SMA- en ColQ-gerelateerd CMS te kwantificeren.

Karakterisering van neuromusculaire juncties bij muizen door gecombineerde confocale en superresolutiemicroscopie

Leer dual-color STED nanoscopie voor het visualiseren van de immunologische synapse in NK-cellen. Deze methode bereikt sub-100 nm resolutie van cytoskeletstructuren en helpt bij het begrijpen van exocytosemechanismen.

Visualisatie van de immunologische Synapse door Dual Color Time-gated stimulated emission depletion (STED) Nanoscopy

Meer video's verkennen