Name: Hoogst vastbesloten Intravitale Striped-verlichting Microscopie van Germinal Centers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-09T21:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Leer hoe je een standaard twee-fotonenmicroscoop configureert voor hoogresolutie intravitale beeldvorming met gestreepte verlichting. Deze methode maakt gedetailleerde observatie van immuunresponsen in lymfeklieren van muizen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken R. Heintzmann voor vruchtbare discussies tijdens de ontwikkeling van de gestreepte-verlichting aanpak, K. Rajewsky en A. Haberman voor het verstrekken van C57BL / 6 B1-8 GFP transgene muizen. Wij erkennen de Deutsche Forschungsgemeinschaft onder subsidie ​​NI1167/3-1 (RN), HA5354/4-1 en SFB633, project A15 (naar AEH), de Charite onder subsidie ​​Rahel-Hirsch fellowship (RN) voor financiële steun. Wij in het bijzonder erkennen het netwerk JIMI voor vruchtbare discussies en infrastructurele ondersteuning

Multi-beam-instellingen voor Striped-verlichting TPLSM De setup die hier gebruikt is een gespecialiseerde multi-beam twee-foton laser scanning microscoop, zoals eerder beschreven 6,20. Het systeem is in figuur 1. Kan de benadering worden toegepast op andere twee-foton laser scanning microscoop, die in staat zijn camera verkrijging synchroniseren met de beweging van de galvoscanner spiegels zijn, zelfs als ze alleen in staat single-beam te scannen . In dit geval wordt het nadeel een lagere opnamesnelheid echter vergelijkbaar met de opnamesnelheid in standaard PMT-gebaseerde TPLSM zijn. Om een ​​optimale kwaliteit zover resolutie en contrast betreft bereiken, tegen de laagste photobleaching en photodamage en snelste acquisitie, is het aan te raden om de volgende aanpassing stappen van de installatie te overwegen: <ol><li> Controleer het laservermogen van de Tisa laser: checken op 100%, te vergelijken met de oorspronkelijke fabrieksinstellingen en previoons eigen metingen en het als het is als een excitatie golflengte van 700-1.000 nm noodzakelijk. </li><li> Test de afstandsbediening aanwijzing voor de Ti: Sa bundeldeler, dwz controle 0% en 100% instellingen. Als er een resterende Tisa straal op 100%, dan controleren en de stappenmotor nulstand resetten. De Ti: Sa bundeldeler bestaat uit een lage-orde λ / 2 plaat en een polarisator, waarbij de loodrecht gepolariseerde laserstraal loodrecht op straalpaden splitst: een is gericht in de microscoop voor excitatie, de andere wordt gebruikt om de optische parametrische pompen oscillator (OPO). Door het automatisch roteren van de λ / 2 plaat, een continue aanpassing van de Ti: Sa en OPO kracht respectievelijk bereikt. </li><li> Stel de OPO de gewenste golflengte en meet het uitgangsvermogen. Als de stroom te laag is (met een 4 W Ti: Sa laser bij 800 nm, moet men in staat zijn om 0,8-1 W van OPO straal rond 1,050-1,100 nm) optimaliseren van de pompen golflengte en controleer de instellingen van de ee spiegel en van de aangewakkerd kristal. Kies hun aanbevolen optimale waarden, vaak beschikbaar als grafieken en diagrammen, en dan fine-tunen tot het OPO resoneert bij de gewenste golflengte output en neemt het vermogen toe. <ol type="i"><li> Als de stroom is nog steeds laag, passen de twee toegankelijke spiegels van de OPO met de vier toegankelijke-spiegel draaiknoppen. Doe dit langzaam en in zeer kleine bewegingen, afwisselend voor en eindspiegels. </li></ol></li><li> Controleer of de Ti: Sa en / of OPO balken raakte de vermelding spiegels op de juiste, centrale ligging. <ol type="i"><li> Gebruik een stuk wit papier (niet erg glanzend of reflecterende!) En een infrarood kijker voor het observeren van de OPO balk en de hogere golflengte Ti: Sa balken. <ol type="i"><li> Draag een veiligheidsbril bij het werken met NIR Ti: Sa balken (meestal maximaal 720-750 nm is toegankelijk voor de gemiddelde persoon). </li></ol></li><li> Stel het laservermogen (s) zo laag mogelijk voor de uitlijnprocedure teneinde minimaliseren potentiële oogletsel. </li><li> Houden sfeerverlichting van de kamer altijd op, zodat pupil van het oog wordt vernauwd. </li><li> Houd in gedachten dat het laservermogen is prima-gecontroleerd door dempers, bestaande uit een λ / 2 plaat en polarisatoren, die niet in werking maar toen de Ti: Sa bundel komt in de scan-hoofd! </li></ol></li><li> Controleer of de ingangspunt diafragma wordt geraakt in het midden door de Ti: Sa en / of OPO ligger; zo niet, pas de laatste twee spiegels af, voordat de laserstraal gaat de scan hoofd. <ol type="i"><li> Gebruik de IR-viewer en een klein stukje wit (maar niet glanzend / reflecterend!) Papier. </li><li> Sluit altijd het middenrif bij de binnenkomst in de microscoop, zodat de laserstraal positie nauwkeuriger kan worden beoordeeld. Belangrijk: Vergeet niet om het diafragma te heropenen voordat u verder gaat met stap 6! </li></ol></li><li> Pas de gereflecteerde laserstraal lichtpad in de microscoop dienovereenkomstig. Doe dit op kleine segmenten en het uitvoeren van iteratieve beam-waLKing. <ol type="i"><li> Controleer de gehele licht-pad als de lichtopbrengst van het objectief is niet voldoende. </li><li> Controleer altijd het lichtpad bij het gebruik van het systeem voor de eerste keer na een lange periode van inactiviteit, een grote reparatie, vervanging van optische elementen, of als er problemen worden verdacht te bestaan ​​met de uitgang. </li></ol></li><li> Zorg ervoor dat alle actieve optische oppervlakken schoon, in het bijzonder dat zij vrij zijn van stof! Als de oppervlakken zijn bedekt met een laag stof, wordt het golffront nog voordat de objectieflens vervormd en de resulterende laserstraal een scherp beeld van het monster nooit leveren! <ol type="i"><li> Reinig indien nodig de spiegels met een opgevouwen stuk lens papier, bevochtigd met ethanol of isopropanol. </li></ol></li><li> Controleer of de bundel komt terug naar de spiegel die zich direct boven de ingang spiegel aan het eind van de prisma-gebaseerde puls compressor, na het lichtpad is ingesteld. Vanaf hier wordt de gereflecteerde bundel into de bundel multiplexer (BM). </li><li> Controleer of de laserstraal het diafragma dat ligt aan de ingang van de balk multiplexer, direct voor de λ / 2 plaat, het veranderen van de polarisatie van de laserbundel aan de eisen voor een breed-band 50% transmissie en 50% reflectie past binnen de BM. <ol type="i"><li> Sluit eerst het membraan dat de balk positie nauwkeuriger kan worden beoordeeld en uitvoeren balk lopen tussen de twee membranen, dwz die bij binnenkomst op de microscoop en de andere aan de BM ingang. Voor andere single-beam scanning microscopen het membraan moet zich bij binnenkomst op het xy-scanner. </li><li> Als de bundel niet raken het midden van de gesloten-down opening, past de bovengenoemde spiegel, direct voor de BM ingang membraan geplaatst. Belangrijk: Vergeet niet om het diafragma te heropenen voordat u verder gaat met stap 10. </li></ol></li><li> Met het diafragma heropend, controleer dan of de laserstraal raakt de BM spiegels inhun midden-punt. Gebruik een smalle strook papier om niet naar een ander deel van het complex lichtpaden de BM te blokkeren! </li><li> Controleer of de balk raakt het midden van de afrit spiegels: top spiegel voor parallel polarisatie &quot;P&quot;, onderaan spiegel voor loodrechte polarisatie &quot;S&quot;. Zo niet, stel de ingang spiegel voor de BM. </li><li> Controleer of de &quot;S&quot; en &quot;P&quot; gepolariseerde bundel laat groepen voeren de polarisator kubus en overlappen adequaat bij binnenkomst op het xy-scanner. Door deze stappen in het geval van een single-beam scanning microscoop wordt gebruikt. </li><li> Controleer of het laserlicht passeert centraal de scan en de buis lenzen en krijgt door het midden van het objectief &#39;back focal plane. Belangrijk: deze stap moet worden gedaan met de laserstraal in middenpositie niet parkeerstand! <ol type="i"><li> Vervang het objectief met een gericht instrument (&quot;bull&#39;s eye&quot;) en controleer of de laserstraal raakt het doel in het midden, en of deverlichting is zelfs. </li><li> Als dit het geval lijkt te zijn, sluit het diafragma voor de BM en controleer of een cirkelvormig interferentiepatroon verschijnt, met een zwarte cirkel in het midden (interferentie minimum). <ol type="i"><li> Stel de vermelding spiegel als er een significante verschuiving ten opzichte van het centrum van de roos. </li></ol></li></ol></li><li> Vervang nu de roos met een objectief, bijvoorbeeld met een 20X water immersie lens. <ol type="i"><li> Controleer de licht-veld output met een stuk wit papier. Dit moet helder, uniform en centraal gelegen zijn. </li><li> Meet het uitgangsvermogen: bij 100% OPO met 100% pompen Ti: Sa (4 W), moet men ca. krijgen. 100-150 mW na de lens op 1100 nm (de hier gebruikte microscoop). Lagere laser bevoegdheden zal niet volstaan ​​voor het uitvoeren van multi-beam SI-TPLSM. Voor single-beam scanning SI-TPLSM, 5-10 mW voldoende. De laserstraal moet in de middelste stand blijven zonder scanned! </li></ol></li><li> Als het uitvoeren van MB-SI-TPLSM, lijnt de spiegels in de BM als volgt: <ol type="i"><li> Plaats een homogeen fluorescerende monster, bijvoorbeeld een rode fluorescentie glijbaan, op het podium en de focus van de laserstraal in de steekproef, maar in de buurt van de bovenkant (dwz dicht bij het ​​objectief &#39;front). </li><li> Stel de microscoop om de multi-beam mode en kies het aantal stralen, in het begin, bij voorkeur slechts een balk, en de polarisatie, bijv. &quot;P&quot;. <ol><li> Vind de laserstraal door beeldvorming de fluorescerende dia: stel de &quot;P&quot; sluiter open en lopen de CCD-camera continu terwijl het richten van de bundel. </li><li> Zorg ervoor dat de balk in het midden, en dat de scanner is uitgeschakeld. Zorg ervoor dat de lichtbundel wordt niet gescand! </li><li> Vind de bundel door te zoeken naar een heldere vlek in het midden van de camera chip. </li><li> Focus de balk totdat de plek is de helderste en scherpste, dwz het beeldvlak vande microscoop overeenkomt met de positie van de camera chip; het laservermogen te verminderen zodat de vlek niet verzadigd. Met een goed afgestemd systeem betekent dat het laservermogen moet dichtbij minimaal zijn bij het werken in een geluidsbundels (ongeveer 0,6 mW laservermogen moeten werken). </li><li> Als de spot is beduidend uit het midden, verplaatsen dichter bij het centrum door het aanpassen van de spiegel voor de BM (of van de scanner voor single-beam scanning). </li><li> Wanneer ook het uitlijnen van de andere polarisatie, namelijk &quot;S&quot;-bundels, nu overschakelen naar 2-beam-modus, open de &quot;S&quot; sluiter en controleer de positie van de balk (slechts een bundel kan worden gezien als alleen de &quot;S&quot; sluiter open ). </li><li> Als je klaar bent, schakelt u over 4-beam mode en gebruik de &quot;P&quot; polarisatie-modus (&quot;P&quot; sluiter open). Nu twee beamlets zal verschijnen. </li><li> Schik de twee beamlets perfect worden parallel aan de onderste rand van het oog van de camera, en zet ze op 2,8 micrometer van elkaar verwijderd zijn. <ol type="i"&gt; <li> Als ze niet goed zijn uitgelijnd, pas de eerste spiegel van de BM. </li><li> Uitlijnen nooit de schroef in het midden, in plaats daarvan gebruik maken van de twee perifere schroeven om de spiegel te bewegen totdat de twee bundels zijn 2,8 um uit elkaar en perfect horizontaal gerangschikt. </li></ol></li><li> Schakel nu over naar 8-beam mode in &quot;P&quot; polarisatie, en pas de tweede BM spiegel (ook zonder de rode stip) tot de 4 beamlets op gelijke afstand op 2,8 um, en worden parallel aan de onderrand van het beeld. </li><li> Herhaal in 16 - en 32-geluidsbundels aanpassing van de 3e en 4e BS spiegels resp. Het is belangrijk dat de beamlets te equidistante omdat SI-algoritmen, de eenvoudigste zijn de min-max (HiLo) algoritme, zijn hierop gebaseerd. </li></ol></li></ol></li><li> Vervang het uniform fluorescerend monster met een heterogeen gestructureerd is, bijvoorbeeld cross-lood Convallaria wortels. <ol type="i"><li> Ga naar de parkeerstand van de excitatiebundel, which wordt meestal geplaatst op grote waarden van de scanner coördinaten, bijv. (10.000, 10.000). </li><li> Scan een afbeelding (multi-beam) met de CCD-camera. Controleer of het beeld scherp wordt weergegeven, uniform, en recht. </li><li> Stel de camera als het beeld wordt gedraaid: draai de camerabody axiaal om de verticale as met de hand (be gentle!) Totdat het beeld wordt rechtgetrokken. </li></ol></li><li> Start de xy-scanner om het scanproces kunt beheren op de excitatie patroon, dwz gestreepte plaatje te zien. <ol type="i"><li> In het geval van multi-beam scanning, verplaats de y-scanner spiegel, dwz. loodrecht op de beamlet lijn, zodanig om beeld kwadratische gestreepte genereren. </li><li> Als het gezichtsveld gegenereerd zoals beschreven in stap 17.1. is te klein, uitbreiding van de scanning routine door het bewegen van de x-scanner spiegel om een ​​positie te waarborgen dat de bundel-let lijn wordt verdubbeld en de beamlets zijn op gelijke afstand langs de gehele lijn. Herhaal de exacte bewegingde y-scanner mirror na de x-scanner mirror verplaatst naar, hoe groter gestreepte genereren. </li><li> In het geval van single-beam scanning, wisselen de y-scanner spiegel beweging met x-scanner spiegel beweging herhaaldelijk op equidistante posities - gedefinieerd door de wetenschapper - om het gewenste beeld gestreepte genereren. </li><li> Zorg ervoor om te gebruiken voor de beweging van de y-scanner spiegel een opdracht voor constante snelheid (gereduceerd versnelling / vertraging) en voor de x-scanner spiegel op maximale snelheid (maximale versnelling / vertraging). </li></ol></li><li> Automatisch verwerven en de gestreepte afbeelding met de camera (veld-detector) te redden. Daarom synchroniseren van de camera met de scanner en het gebruik van de scanner als de meester trekker. </li><li> Herhaal verwerven gestreepte beelden (scanprotocol in Protocol 17 beschreven) door het bewegen van de x-scanner spiegel op verschillende posities als volgt: <ol type="i"><li> Kies genoeg herhaling stappen en de juiste stap lengte tussentwee opeenvolgende gestreepte beelden naar de afstand tussen twee opeenvolgende beamlets (in dit geval 2.8 pm en een stap van de scanner spiegels gelijk aan 25 nm) dekken; kan het raadzaam zijn om een beetje overlap mogelijk te maken, dat wil zeggen een extra 0,3-0,4 micrometer. </li><li> Stel de x-verschuiving naar een waarde die overeenkomt met de laterale resolutie te beperken bij de gegeven golflengte. Als voorbeeld, met 10 stappen van de x-scanner mirror per shift en 12 of 13 verschuift tot beste zowel axiale als laterale resolutie heeft dit systeem. Controleer een gestructureerde glijbaan, bijv. Convallaria wortels dia welke nummers het beste werken in het systeem wordt gebruikt. </li><li> Optimaliseer deze twee waarden tot het imago van de Convallaria wordt de scherpste: gebruik de lijn profiel tool op de berekende SI afbeeldingen en vergelijk de breedte van de lijn profielen (dat is de fluorescentie-signaal van Convallaria celwanden). </li><li> Acquire elk gestreept beeld gesynchroniseerd met de scanner beweging en dit afzonderlijk bewaren, bv </em&gt; als tiff of binaire bestanden. </li></ol></li><li> Open een complete set van gestreepte beelden als matrices, dwz 3D matrix, in de evaluatie routine en gebruiken ofwel de min-max algoritme of een Fourier-transformatie algoritme om een 2D-matrix van de hoge-resolutie SI-plaatje te zien. De algoritmen zijn eerder beschreven 20. </li></ol> Muizen Immunisatie en voorbereiding voor intravitale Imaging De dierproeven werden goedgekeurd door de betreffende staat comites voor dierenwelzijn (LAGeSo, Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlijn) en werden uitgevoerd in overeenstemming met de geldende richtlijnen en voorschriften (dierproef licentie G0153/08). <ol start="21"><li> De inductie van een kiemcentrum reactie in de popliteale lymfeknoop en voorbereiding van het beeldveld werd uitgevoerd zoals eerder beschreven 4. Zuiveren B-cellen immunomagnetically van milt van B1-8 + / + JK - / -en B-cellen B1-8 + / + JK - / - GFP + muizen. </li><li> Injecteer intraveneus 3 x 10 6 NP-specifieke B-cellen met een zuiverheid van&gt; 95% met ⅛ B1-8 + / + JK - / - GFP + en ⅞ niet-fluorescerende B1-8 + / + JK - / - in C57Bl / 6 ontvangers . </li><li> Een dag na cel overdracht immuniseren de ontvangers met 10 ug van NP-CGG (nitrofenyl-kip ɣ globuline) geëmulgeerd in compleet Freund&#39;s adjuvant (CFA) in de rechter achterpoot eten pad. </li><li> Label Fab fragmenten van antilichamen met anti-CD21/CD35 ATTO590-succinimidyl ester. <ol type="i"><li> Om het netwerk van folliculaire dendritische cellen (FDC) te markeren binnen de kiemcentrum in vivo, injecteren 10 pg-fluorochroom gelabelde Fab-fragmenten in de rechter achterpoot voetzool van de muizen 12-24 uur voor intravitale analyse wordt uitgevoerd. </li></ol></li></ol> De volgende stappen moeten worden ontrood voor de voorbereiding van de knieholte lymfeklier voor intravitale beeldvorming (dag 8-10 na immunisatie): <ol start="25"><li> Verdoven muis door ip injectie van ketamine / xylazine, het bedrag afhankelijk van hun gewicht. </li><li> Test reflexen om de diepte van anesthesie gedurende de gehele controleperiode beeldvorming. </li><li> Scheren been, rug en rechter flank van de muis strenge en gebruiken ontharen crème om de resterende haren volledig te verwijderen. </li><li> Fix rechts trochanter major: lokaliseren benige chip met vingers, zet een kleine incisie in de huid met een schaar tot een kleine witte driehoekige fascia verschijnt. </li><li> Klem benige chip onder deze fascia met puntige pincet van de restrainer. </li><li> Bevestig de wervelkolom in de lumbale gebied met behulp van getande pincet. </li><li> Fix rechter achterpoot op restrainer en draai de schroef. </li><li> Tape-staart aan het been in de juiste positie te houden. </li><li> Aan het caudale zijde van de dij, maak een incisie in de huid, in het gebied waar de prominente popliteale ader enters het weefsel, scheiden de huid van het onderliggende weefsel met stompe pincet en volg de knieholte ader van proximaal naar distaal. </li><li> Expose de lymfeklieren met behulp van stompe pincet, proberen te voorkomen dat het snijden om de fijne lymfevaten beschermen (houd de lymfeklier in PBS gedurende het blootstellen). </li><li> Maak een cirkel van vacuüm vet rond de lymfeklier, vul deze plas met PBS. </li><li> Kap slip op zijn plaats en plaats de thermometer-probe (houden temperatuur op 37 ° C, omdat anders de cel velocity sterk variëren). </li><li> Langs de bovenrand van het dekglas voeg een cirkel van vacuüm vet. </li><li> Zet de verwarming spoel in zijn positie op de vacuüm vet, maak een zegel op een soortgelijke manier als voorheen en voeg water / PBS op de glazen afdekplaat slip aan de doelstelling duik in. </li><li> Na beeldvorming wordt de muis bewaard in anesthesie, terwijl het verhogen van de dosis van ketamine / xylazine een letale dosis, gevolgd door cervicale dislocatie. </li></ol>

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Siffrin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+partially+reversible+th17+cell-induced+neuronal+dysfunction+in+the+course+of+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis.</a> Immunity. 33 (3), 424-436 (2010).</li>
<li>Esplugues, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Th17+cells+occurs+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of Th17 cells occurs in the small intestine.</a> Nature. 475 (7357), 514-518 (2011).</li>
<li>Hauser, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+germinal-center+B+cell+migration+in+vivo+reveals+predominant+intrazonal+circulation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns.</a> Immunity. 26 (5), 655-667 (2007).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+cell+motility+and+interaction+dynamics+imaged+by+two-photon+microscopy+in+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).</li>
<li>Herz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+two-photon+intravital+microscopy+to+the+infrared+by+means+of+optical+parametric+oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Expanding two-photon intravital microscopy to the infrared by means of optical parametric oscillator.</a> Biophys. J. 98 (4), 715-723 (2010).</li>
<li>Hell, S. W., Rittweger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy%3A+Light+from+the+dark%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microscopy: Light from the dark.</a> Nature. 461 (7267), 1069-1070 (2009).</li>
<li>Ding, J. B., Takasaki, K. T., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supraresolution+imaging+in+brain+slices+using+stimulated-emission+depletion+two-photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Supraresolution imaging in brain slices using stimulated-emission depletion two-photon laser scanning microscopy.</a> Neuron. 63 (4), 429-437 (2009).</li>
<li>Bianchini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-wavelength+two-photon+excitation+-+stimulated+emission+depletion+%28SW2PE-STED%29+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single-wavelength two-photon excitation - stimulated emission depletion (SW2PE-STED) super-resolution imaging.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (17), 6390-6393 (2012).</li>
<li>Berning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscopy+in+a+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanoscopy in a living mouse brain.</a> Science. 335 (6068), 551(2012).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9, 749-754 (2012).</li>
<li>Gu, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGu%2C+M+%22Advanced+optical+imaging%22">Advanced optical imaging</a>. , Springer Verlag. Berlin. (2001).</li>
<li>Cha, J. W., Ballesta, J., So, P. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shack-Hartmann-wave+front-sensor-based+adaptive+optics+system+for+multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Shack-Hartmann-wave front-sensor-based adaptive optics system for multi-photon microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 15 (4), (2010).</li>
<li>Booth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+in+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+A%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics in microscopy.</a> Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 2829-2843 (2007).</li>
<li>Niesner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+single+and+multibeam+two-photon+microscopy+for+high-resolution+and+high-speed+deep+tissue+and+intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The power of single and multibeam two-photon microscopy for high-resolution and high-speed deep tissue and intravital imaging.</a> Biophys. J. 93 (7), 2519-2529 (2007).</li>
<li>Rückel, M., Mack-Bucher, J. A., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+wave-front+correction+in+TPM+using+coherence-gated+wave-front+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Adaptive wave-front correction in TPM using coherence-gated wave-front sensing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17137-17142 (2006).</li>
<li>Tang, J., Germain, R. N., Cui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superpenetration+optical+microscopy+by+iterative+multiphoton+adaptive+compensation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Superpenetration optical microscopy by iterative multiphoton adaptive compensation technique.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (22), 8434-8439 (2012).</li>
<li>Ji, N., Milkie, D. E., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+via+pupil+segmentation+for+high+resolution+imaging+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics via pupil segmentation for high resolution imaging in biological tissues.</a> Nat. Methods. 7, 141-147 (2009).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+laser+scanning+microscopy+through+spatiotemporal+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Super-resolution laser scanning microscopy through spatiotemporal modulation.</a> Nano Lett. 9 (11), 3883-3889 (2009).</li>
<li>Andresen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-resolution intravital microscopy.</a> PLoS ONE. 7 (12), (2012).</li>
<li>Debarre, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+for+structured-illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Exp%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics for structured-illumination.</a> Opt. Exp. 16 (13), 9290-9305 (2008).</li>
</ol>

Volker Andresen is een aandeelhouder van LaVision Biotec GmbH, Bielefeld, Duitsland. De andere auteurs hebben geen belangenconflicten.

Het doel van intravitale optische beeldvorming is dynamisch en functioneel visualiseren cellulaire motiliteit en interacties om weefsel en orgaanfunctie bij gezondheid en ziekte 5 begrijpen. De meest krachtige techniek om deze multi-foton laser scanning microscopie te realiseren, moet nog beperkingen in voor verstoringen, verstrooiing, trage verwerving, fotobleken en photodamage, die de ruimtelijke resolutie beperkt golf overwinnen, contrast en de tijdsresolutie . Er zijn twee suc...

Twee-foton laser scanning microscopie (TPLSM), met zijn voordelen voor deep-tissue imaging gerelateerd aan infrarood ultrakorte gepulste excitatie 1, heeft een revolutie teweeggebracht in onze visie op vitale processen op een single-cell niveau door de onthulling van de beweeglijkheid en interactiepatronen van verschillende celsubsets levende dieren 2-5. De huidige technologie is nog onvoldoende om de mechanismen van orgaanfunctie en disfunctie helderen als voorwaarde voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën, want het maakt slechts spaarzame informatie over de moleculaire basis van cellulaire respons op weefsels in gezondheid en ziekte. De huidige technologie maakt slechts een ruimtelijk raam van enkele honderden micrometer door verstrooiing en golffront vervormingseffecten op de ruimtelijke resolutie en signaal-ruisverhouding 6, die bijzonder duidelijk in de zeer compacte weefsel van volwassen dieren. Deze verstrooiing en golffront distortion effecten ontstaan ​​door een zeer heterogene eend anisotrope verdeling van de brekingsindex in weefsel, wat in een eerste stap een diepteafhankelijke verslechtering van 3D ruimtelijke resolutie en tenslotte het totale verlies van het signaal afkomstig van ballistische excitatie fotonen, onder meer verloren signaal-ruisverhouding. Qua biowetenschappelijke en biomedische bindweefselmassages toepassingen betekent dit dat de huidige technologie is niet ondubbelzinnig cellulair onthullen vanwege slechte resolutie leidt tot vals positieve interacties terwijl de afname van de signaal-ruisverhouding zou veroorzaken dat het systeem sommige kijken interacties tussen afm structuren. Teneinde ondubbelzinnig te detecteren cellulaire interacties in een dynamische wijze wordt een sterk verbeterde ruimtelijke resolutie nodig diep in het weefsel. De momenteel geïntroduceerd krachtige nanoscopy technieken op basis van speciale numerieke algoritmen, zoals structuur-verlichting benaderingen, op uitputting van de eerste aangeslagen toestand, bijv. </em&gt; STED, RESOLFT, of molecuul lokalisatie, bijvoorbeeld dSTORM, PALM, hebben vele toepassingen gevonden in gefixeerde cellen en in levende celculturen 7. Echter, om deze toepassingen te breiden tot weefselsecties, levend weefsel en organismen we moeten nog ernstige technische problemen te overwinnen. Twee-foton excitatie sted met verschillende golflengtes en met een enkele golflengte (sw2PE-STED) voor excitatie en gestimuleerde emissie is toegepast op laterale resolutie in hersencoupes 8 of kunstmatige matrices verbeteren respectievelijk ingebedde cellen 9, terzelfder axiale resolutie standaard TPLSM. Met een foton STED kan de dynamiek van dendritische worden afgebeeld op het oppervlak van de hersenen cortex (tot 10-15 micrometer diepte) in een levend Thy1 EGFP muis met een resolutie van 67 nm 10. Een veelzijdig instrument voor ontwikkelingsbiologie wordt door de multifocale gestructureerde verlichting microscopie, die tweevoudige verbeterde 2D geeftresolutie. Echter, deze techniek alleen worden gebruikt in organismen met een lage neiging van lichtverstrooiing zoals zebravis embryo&#39;s 11. Maar geen van deze technieken in zeer verstrooiende weefsel van volwassen dieren worden toegepast in verscheidene honderden micrometers, die cruciaal modellen voor biomedisch en klinisch onderzoek van ziekten die ontstaan ​​na de geboorte. Onafhankelijk van de benadering gebruikt om de buigingsbegrensde golfvorm voor berekenen, namelijk de puntspreidingsfunctie (PSF), na het scherpstellen door een lens, de breedte van de PSF langs de optische as (axiale resolutie) ten minste drie keer groter is dan de breedte PSF loodrecht op de optische as (laterale resolutie) 12. Golffront verstoringen van de verschillende orders gekwantificeerd door Zernike coëfficiënten het golffront vorm van gerichte elektromagnetische golf in diep-weefsel beeldvorming leidt tot veel grotere PSF&#39;s, met name langs de optische aanzienlijk wijzigenal. as 13-15. Dus zowel de diffractie wetten en golffront vervormingseffecten wijzen op de resolutie langs de optische as als de beperkende factor in diep weefsel beeldvorming. Overwegende nanoscopy technieken richten zich op het tegengaan van de grenzen van diffractie alleen, een technologie die axiale resolutie en het contrast aan het tegengaan van zowel diffractie en wave-front distortion effecten verbetert nodig is voor hoge-resolutie intravitale beeldvorming. Idealiter zou deze techniek ook snel genoeg om controle van cellulaire dynamiek mogelijk te maken. De real-time correctie van PSF aberraties en contrast verlies met behulp van adaptieve optiek in TPLSM is uitgebreid bestudeerd en verbeterd in de afgelopen tien jaar 13,14,16-18 en het is daarom de beste momenteel beschikbare keuze leidt tot een beter beheer van ballistische excitatie fotonen 14. Toch, vanwege het feit dat de meeste golffront correctie gehanteerde adaptieve optiek iteratief en dat ze hanaar herhaald worden kleine gebieden (enkele 10 x 10 urn 2) vanwege de hoge heterogeniteit van de brekingsindex in het weefsel, de opnamesnelheid aanzienlijk lager dan voor beeldvorming celmotiliteit en communicatie. Bovendien is de fysieke grens in adaptieve optiek verbeterd TPLSM wordt nog bepaald door diffractie. Ruimtelijke modulatie van verlichting (SPIN) en temporele modulatie op de detectie kant (SPADE) zijn theoretisch voorgesteld moeten worden toegepast op laser scanning microscopie om de resolutie te verbeteren. Hun praktische toepassing in intravitale beeldvorming moet nog worden aangetoond 19. Samen genomen, is er een grote vraag naar de ontwikkeling van technologieën, die de resolutie voor deep-tissue imaging in levende volwassen dieren te verbeteren. In dit werk, we ruimtelijke modulatie van de excitatie patroon door het beheersen van het scanproces in multi-beam gestreept-verlichting multi-foton laser-s te bereikeninblikken microscopie (MB-SI-MPLSM) 20. Anders gestructureerde verlichting benaderingen, waarbij het gedeelte excitatiebundel kruis ruimtelijk gemoduleerde, gebruiken we alleen het scanproces de ruimtelijke modulatie van de excitatie bereiken. Door de uitbreiding van de excitatie naar een langere golflengte, kunnen we zowel ruimtelijke resolutie en signaal-ruisverhouding in diep weefsel van sterk verstrooiende weefsel (bijv. lymfeklieren, free-verstrooiing path 47 urn 6) te verbeteren, onafhankelijk van de optische niet-lineaire signaal dat we te detecteren, bijvoorbeeld fluorescentie, tweede harmonische generatie of andere frequentie mengen fenomeen. Met deze aanpak op golflengten tot 900 nm kunnen we dynamisch beeld cellulair eiwit structuren op de schaal van enkele moleculen in kiemcentra van muis lymfeklieren. Zo kunnen we beter visualiseren de interactie tussen antigeen dragende eenheden op het oppervlak van folliculaire dendritische cellen en B-cellen in het proces van onderzoeken van het antigen tijdens de immuunrespons bij secundaire lymfoïde organen.

<table><tbody><tr><td>ATTO590 &ndash; NSH voor koppeling</td><td>ATTO Tec, Duitsland</td><td>AD-590-35</td><td></td></tr><tr><td>CD21/35 &ndash; Fab fragment &ndash; ATTO590</td><td>DRFZ, Berlijn</td><td></td><td>De koppelingsreactie werd uitgevoerd in het centrale lab van onze instelling.</td></tr><tr><td>B1-8 Jk-/- EGFP+</td><td>Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, VS</td><td></td><td>Kan ook worden gevonden bij Jackson Laboratories (JAX).</td></tr><tr><td>EasySep Negatieve Selectie Muis B-cel Verrijking&nbsp;</td><td>StemmCell Technologies, Duitsland</td><td>19854</td><td></td></tr><tr><td>Polystyreen kralen (605), 0.2 &micro;m</td><td>Life Technologies, Duitsland</td><td>F8803</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TriMScope I</td><td>LaVision Biotec, Bielefeld, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPO (manuele versie)</td><td>APE, Berlijn, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II</td><td>Coherent, Duisburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water-immersie objectieflens, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm</td><td>Olympus Duitsland, Hamburg, Duitsland</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hoogst vastbesloten intravitale striped-verlichting microscopie van germinal centers

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellulaire communicatie door intravitale bindweefselmassages multi-foton microscopie is de sleutel voor het begrijpen van het lot van de immuuncellen in dikke weefselmonsters en organen in gezondheid en ziekte. Door het regelen van het aftastpatroon in multi-foton microscopie en toepassen van numerieke algoritmen hebben we een gestreepte-verlichting benadering, waardoor we bereiken 3-voudig beter axiale resolutie en verbeterde signaal-ruisverhouding, dus daarentegen meer dan 100 urn diepte in weefsel sterk verstrooiende weefsel van lymfoïde organen vergeleken met standaard multi-foton microscopie. De opnamesnelheid en fotobleken en photodamage effecten waren vergelijkbaar met standaard foto-multiplier-gebaseerde techniek, terwijl de beeldvormende diepte iets lager door het gebruik van velddetectoren. Door het gebruik van de gestreepte-verlichting aanpak zijn wij in staat om de dynamiek van immune complex afzettingen op secundaire folliculaire dendritische cellen waarnemen ̵1; het niveau van enkele eiwitmoleculen in kiemcentra.

Ruimtelijke resolutie in de lymfklieren De afmetingen van de effectieve puntspreidingsfunctie (EPSF) corresponderen met de ruimtelijke resolutie van een microscoop 12. We maten deze driedimensionale functie van het verwerven van de tweede harmonische generatie signaal collageenvezels in lymfklieren onze MB-SI-TPLSM tegenover waarbij twee-foton laser scanning microscopie methodes, detectieveld TPLSM (via CCD-camera) en puntdetectie TPLSM (door middel van PMT&#39;s). <p cl...

Hoge-resolutie intravitale beeldvorming met verbeterd contrast tot 120 urn diepte lymfklieren van volwassen muizen wordt bereikt door ruimtelijk moduleren van de excitatie patroon van een multi-focale twee-foton microscoop. In 100 micrometer diepte gemeten we resoluties van 487 nm (lateraal) en 551 nm (axiaal), waardoor verstrooiing en diffractie grenzen omzeilen.

Hoogst vastbesloten Intravitale Striped-verlichting Microscopie van Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Het algemene doel van deze procedure is het voorbereiden van een standaard tweefotonmicroscoop voor intravitale beeldvorming met een hoge resolutie. Dit wordt bereikt door eerst de microscoop uit te lijnen, wat onder meer het afstellen van de lasers omvat. Vervolgens wordt de straalmultiplexer uitgelijnd om een perfecte straalvorm en een optimale belichting van het gezichtsveld te verkrijgen.In het geval van multibeam-scanning worden de ruwe beelden verkregen door het monster te scannen met het gestreepte verlichtingspatroon. Ten slotte wordt een algoritme toegepast om het uiteindelijke beeld met hoge resolutie te berekenen. Uiteindelijk wordt gestreepte verlichtingsmicroscopie gebruikt om details van het gedrag van het immuunsysteem binnen kiemcentra in de lymfeklieren van muizen aan te tonen, wat voorheen onbereikbaar was voor intravitale microscopie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals gestructureerde illuminatie of lokalisatiemicroscopie, is dat deze kan worden toegepast op grote weefseldieptes in levende monsters. Het vereist geen enkele aanpassing van de vorm van de laserstraal, waardoor de methode zeer eenvoudig blijft en gemakkelijk kan worden geïmplementeerd in elke multifotonmicroscoop. De opstelling die wordt gebruikt voor multi-beam tweefoton gestreepte illuminatiemicroscopie wordt hier getoond om een optimale resolutie en contrastkwaliteit te bereiken met het laagste niveau van fotobleking en de snelste acquisitie.Overweeg om aanpassingen aan de opstelling aan te brengen zoals beschreven in het tekstprotocol. Controleer na het maken van de aanpassingen of de bundel terugkeert naar de spiegel die zich direct boven de ingangspiegel aan het einde van de prisma-gebaseerde pulskompressor bevindt. Zodra het lichtpad vanaf dit punt is ingesteld, wordt de bundel gereflecteerd in de bundelmultiplexer.Indien er gebruik wordt gemaakt van multi-beam gestreepte illuminatie, gebruik dan multifotonmicroscopie met de scanner uitgeschakeld. Lijn de spiegels in de straalmultiplexer uit door een homogeen fluorescerend monster op de tafel te plaatsen en de laserstraal in het monster te focussen, maar vlakbij het bovenoppervlak. Dicht bij de frontlens van de objectief.Stel de microscoop in op de multi-beam-modus en kies het aantal bundels en de polarisatie. Om bijvoorbeeld de P-laserbundel te vinden door de fluorescerende slide af te beelden, opent u de P-sluiter en laat u de CCD-camera continu lopen terwijl u de bundel scherpstelt, waarbij u ervoor zorgt dat deze zich in de middenpositie bevindt. Schakel bij het uitlijnen de P-bundel naar de 64-beams-modus en open de bijbehorende sluiter.Controleer de positie van de straal. Stel de spiegels van de eerste tot en met de vijfde straalmultiplexer af, zodat de lichtstralen equidistant zijn. Aangezien gestreepte illuminatie-algoritmen gebaseerd zijn op deze aanname, vervangt u het uniform fluorescerende monster door het heterogeen gestructureerde monster.Neem bijvoorbeeld een wortelmonster uit het Conval-gebied en scan een multi-beam afbeelding. Controleer of de afbeelding scherp, uniform en recht is. Vervang het heterogene monster door het homogene monster.Start de XY-scanner om het scanproces te besturen. Om het gestreepte excitatiepatroon voor multi-beam scanning te genereren, beweegt u de Y-scannerspiegel loodrecht op de belichte straallijn.Herhaal het gegenereerde patroon, hier aangegeven door het aantal blokken, door de X-scannerspiegel (hier aangeduid als block shift) te verplaatsen om een rechthoekig gestreept beeld te genereren. Plaats het heterogene monster terug en gebruik de scanner als de mastertrigger. Synchroniseer de camera met de scanner om automatisch een gestreept beeld te verkrijgen en op te slaan, zodat er herhaaldelijk gestreepte beelden kunnen worden vastgelegd.Verplaats de X-scannermirror naar verschillende posities door hier voldoende herhalingsstappen, het aantal verschuivingen en de juiste staplengte te kiezen. Kies een verschuivingsstap tussen twee opeenvolgende gestreepte beelden om de afstand tussen twee opeenvolgende bundelbreedtes te overbruggen. Stel de X-verschuiving in op een waarde die onder de limiet van de laterale resolutie ligt bij de gegeven excitatiegolflengte.Gebruik bijvoorbeeld 10 stappen van de X-scannerspiegel per shift en 12 of 13 shifts om de beste ruimtelijke resolutie te verkrijgen. Optimaliseer deze twee waarden aan de hand van de resultaten met de conval area root slide, totdat de afbeelding van het conval area het scherpst is. Gebruik de line profile-tool op de conventionele CCD-afbeeldingen en de berekende afbeeldingen met gestreepte verlichting.Vergelijk de breedte van de lijnprofielen, wat in dit voorbeeld het fluorescentiesignaal van de celwanden van conval is. Neem elke ruwe gestreepte afbeelding synchroon met de beweging van de scanner op en sla deze afzonderlijk op, bijvoorbeeld als TIFF- of binaire bestanden. Om een tweedimensionale matrix van de gestreepte verlichtingsafbeelding met hoge resolutie te genereren, opent u een volledige set ruwe gestreepte afbeeldingen als matrices in de evaluatieroutine.Gebruik ofwel het minimum maximum-algoritme of een op de Fourier-transformatie gebaseerd algoritme, zoals eerder in detail is beschreven, om gestreepte belichting, multi-beam, multi-foton microscopie in diep weefsel uit te voeren. Neem in levende organismen gestreepte beelden op verschillende weefseldieptes in de loop van de tijd op en evalueer deze zoals eerder beschreven, om een 3D-film met een hoge resolutie te genereren van de dynamische interactie tussen kiemcentra, B-cellen en folliculaire dendritische cellen. De dimensies van de effectieve point spread function komen overeen met de ruimtelijke resolutie van een microscoop.We hebben deze driedimensionale functie gemeten door het signaal van de tweede harmonische generatie van collageenvezels of het fluorescentiesignaal van polystyreenbolletjes van 100 nanometer die emitteren bij 515 nanometer in lymfeklieren van muizen te verwerven. Hierbij is onze multi-beam striped illumination T-P-L-S-M gebruikt in vergelijking met gevestigde twee-foton laser-scanning microscopietechnieken, zoals field detection T-P-L-S-M met behulp van CCD-camera's en point detection T-P-L-S-M. Uit deze metingen blijkt duidelijk dat aan het oppervlak van het preparaat zowel de laterale als de axiale resolutie overeenkomen met de verwachte waarden zoals voorspeld door de diffractietheorie.Echter, bij een toenemende beelddiepte, en daarmee een toenemend optisch pad van zowel excitatie- als emissiestraling door een medium met sterk variërende brekingsindices, verslechtert de ruimtelijke resolutie aanzienlijk, onafhankelijk van de gebruikte opstelling. Door M-B-S-I-T-P-L-S-M te gebruiken, onafhankelijk van de beelddiepte, bereikten we een ongeveer 20% betere laterale resolutie en een 220% betere axiale resolutie in vergelijking met de standaard T-P-L-S-M-benaderingen.De clonale selectie van B-cellen tijdens de immuunrespons in de secundaire lymfoïde organen van volwassen muizen is de eerste stap in hun differentiatie tot geheugen-B-cellen of plasmacellen. In dit proces wordt verondersteld dat de zeer dynamische interactie tussen folliculaire dendritische cellen en B-cellen op het niveau van immuuncomplexstructuren binnen kiemcentra een centrale rol speelt. Alleen door het gebruik van een hoogresolutie intravitale microscopietechnologie is het mogelijk om deze cellulaire communicatie en de implicaties ervan voor de immuunrespons te ontleden, hier gevisualiseerd door follicular dendritic cells te labelen met anti CD 2135 FAB ATO five 90.M-B-S-I-T-P-L-S-M maakt voor het eerst de mogelijkheid mogelijk om in vivo de dimensies van clusters van immuuncomplexafzettingen tot een diepte van 120 micron in kiemcentra van populiere lymfeklieren te visualiseren en te kwantificeren. Deze afbeeldingen tonen de directe vergelijking tussen de 3D-fluorescentiebeelden van immuuncomplexafzettingen in een kiemcentrum, zoals verkregen met conventionele PMT-gebaseerde systemen en met M-B-S-I-T-P-L-S-M. Bovendien konden de interacties van de immuuncomplexafzettingen met B-cellen in het kiemcentrum met een hoge resolutie worden weergegeven en kunnen deze nu worden onderzocht in combinatie met in vivo functionele probes voor proliferatie, differentiatie of apoptose.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met het feit dat bij een techniek op basis van cameradetectie de acquisitiesnelheid ongeveer acht keer hoger is, terwijl de maximale beelddiepte ongeveer 25% lager is dan die van een standaard multifotonmicroscoop op basis van fotomultiplicatoren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het configureren van uw multifotonmicroscoop voor gebruik met de methode van gestreepte illuminatie, inclusief het afstellen van de lichtpad van de microscoop, de uitlijning van de straalstaven, de berekening van de scanparameters en de manieren om het uiteindelijke resolutiebeeld te berekenen voor intravitale diepe weefselexperimenten.

highly-resolved-intravital-striped-illumination-microscopy-germinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Neisseria meningitidis (Nm), een gram negatieve mens-specifieke respiratoire pathogeen, kan binden aan menselijke α-actinine. Hier presenteren wij een protocol voor de visualisatie van colocalisation van de bacterie met de intracellulaire α-actinine na bacteriële binnenkomst in menselijke hersenen microvasculaire endotheelcellen (HBMECs).

Visualisatie en kwantificering van intracellulaire interacties van Neisseria meningitidis En Human α-actinine door Confocale Imaging

This video demonstrates the visualization of γδ intraepithelial lymphocytes (IELs) in transgenic mice using confocal microscopy. The surgical procedure involves creating a perforation line and making a longitudinal incision to expose the intestinal mucosa and villi. The transgenic mice express reporter proteins exclusively in γδ IELs, allowing their tracking. Intravital imaging captures the dynamic movement of green fluorescence-labeled γδ IELs along the intestinal epithelial cell's basement...

Intravital Visualization of Gamma Delta Intraepithelial Lymphocytes

Hier illustreren we het protocol voor beeldvorming door twee kleuren STED nanoscopy de cytotoxische immuun synaps van NK-cellen samengevat op glas. Met deze methode krijgen we sub-100 nm resolutie van synapseiwitten en het cytoskelet.

Visualisatie van de immunologische Synapse door Dual Color Time-gated stimulated emission depletion (STED) Nanoscopy

We beschrijven hier een combinatie van de glas-ondersteunde lipide dubbellaagstechniek voor het vormen van immunologische synapsen met de superresolutie-beeldtechniek van gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie. Het doel van dit protocol is gebruikers de nodige instructies te geven om deze twee technieken met succes uit te voeren.

Super-resolutie beeldvorming van de Natural Killer Cell Immunological Synapse op een glas-ondersteunde Planar lipidendubbellaag

Cilia ontwikkeling is essentieel voor goede organogenese. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te etiketteren en ciliated cellen van de zebravis visualiseren.

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

Presenteren we een protocol voor het gebruik van STED microscopie gelijktijdig afbeelding actine structuren, microtubuli en microtubulus plus-end bindende proteïnen in B-cellen die zich hebben verspreid op coverslips bekleed met antilichamen aan de B-cel receptor, een model voor de eerste fase van immuun synapse formatie.

Visualiseren van de actine en microtubulus Cytoskeletons in de B-cel immuun Synaps met behulp van de gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren van immune cellen die zijn ingesloten in een matrix van de driedimensionale (3D) collageen met behulp van licht vel microscopie. Dit protocol wordt ook ingegaan hoe bijhouden van cel migratie in 3D. Dit protocol kan worden gebruikt voor andere soorten schorsing cellen in de 3D-matrix.

Licht vel microscopie voor driedimensionale visualisatie van menselijke Immune cellen

Dit protocol beschrijft de generatie van gemengde lymfkliertest beenmerg chimaeren met spontane auto-immune germinal centra, in welke autoreactieve lymfocyten een photoactivatable groen fluorescent proteïne (PA-GFP) verslaggever dragen. Dit biedt de mogelijkheid om de cellulaire verbindingsplaats in weefsels met stroomafwaartse moleculaire en functionele analyses.

Individuele autoreactieve Germinal Centers door Photoactivation in een gemengd chimeer Model van Autoimmunity ondervragen

We beschrijven een methode om GFP-gelabeld γδ IELs met behulp van intravital Imaging van muizen dunne darm te visualiseren door omgekeerde spinnen schijf confocale microscopie. Deze techniek maakt het bijhouden van levende cellen in het slijmvlies voor maximaal 4 uur en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van intestinale immuun-epitheel interacties te onderzoeken.

Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm

Dit protocol beelden zowel de immunologische Synapse vorming en de daaropvolgende gepolariseerde secretoire verkeer naar de immunologische Synapse. Celconjugaten werden gevormd tussen een superantigen-gepulseerde Raji-cel (optredend als een antigeen-presentercel) en een Jurkat-kloon (optredend als effector helper T lymfocyten).

Imaging van de humane immunologische SYNAPS

Het keldermembraan is essentieel voor weefsel- en orgaanmorfogenese tijdens de ontwikkeling. Om de mechanismen die leiden tot de juiste plaatsing van deze structuur beter te begrijpen, beschrijft het gepresenteerde protocol methoden om de intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten in epitheelcellen te visualiseren en te karakteriseren met behulp van confocale en superresolutiemicroscopie.

Confocale en superresolutie beeldvorming van gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten tijdens Drosophila Oogenesis

Leer hoe je een standaard twee-fotonenmicroscoop configureert voor hoogresolutie intravitale beeldvorming met gestreepte verlichting. Deze methode maakt gedetailleerde observatie van immuunresponsen in lymfeklieren van muizen mogelijk.

Hoogst vastbesloten Intravitale Striped-verlichting Microscopie van Germinal Centers

Meer video's verkennen