Hoogst vastbesloten Intravitale Striped-verlichting Microscopie van Germinal Centers

Het algemene doel van deze procedure is het voorbereiden van een standaard tweefotonmicroscoop voor intravitale beeldvorming met een hoge resolutie. Dit wordt bereikt door eerst de microscoop uit te lijnen, wat onder meer het afstellen van de lasers omvat. Vervolgens wordt de straalmultiplexer uitgelijnd om een perfecte straalvorm en een optimale belichting van het gezichtsveld te verkrijgen.

In het geval van multibeam-scanning worden de ruwe beelden verkregen door het monster te scannen met het gestreepte verlichtingspatroon. Ten slotte wordt een algoritme toegepast om het uiteindelijke beeld met hoge resolutie te berekenen. Uiteindelijk wordt gestreepte verlichtingsmicroscopie gebruikt om details van het gedrag van het immuunsysteem binnen kiemcentra in de lymfeklieren van muizen aan te tonen, wat voorheen onbereikbaar was voor intravitale microscopie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals gestructureerde illuminatie of lokalisatiemicroscopie, is dat deze kan worden toegepast op grote weefseldieptes in levende monsters. Het vereist geen enkele aanpassing van de vorm van de laserstraal, waardoor de methode zeer eenvoudig blijft en gemakkelijk kan worden geïmplementeerd in elke multifotonmicroscoop. De opstelling die wordt gebruikt voor multi-beam tweefoton gestreepte illuminatiemicroscopie wordt hier getoond om een optimale resolutie en contrastkwaliteit te bereiken met het laagste niveau van fotobleking en de snelste acquisitie.

Overweeg om aanpassingen aan de opstelling aan te brengen zoals beschreven in het tekstprotocol. Controleer na het maken van de aanpassingen of de bundel terugkeert naar de spiegel die zich direct boven de ingangspiegel aan het einde van de prisma-gebaseerde pulskompressor bevindt. Zodra het lichtpad vanaf dit punt is ingesteld, wordt de bundel gereflecteerd in de bundelmultiplexer.

Indien er gebruik wordt gemaakt van multi-beam gestreepte illuminatie, gebruik dan multifotonmicroscopie met de scanner uitgeschakeld. Lijn de spiegels in de straalmultiplexer uit door een homogeen fluorescerend monster op de tafel te plaatsen en de laserstraal in het monster te focussen, maar vlakbij het bovenoppervlak. Dicht bij de frontlens van de objectief.

Stel de microscoop in op de multi-beam-modus en kies het aantal bundels en de polarisatie. Om bijvoorbeeld de P-laserbundel te vinden door de fluorescerende slide af te beelden, opent u de P-sluiter en laat u de CCD-camera continu lopen terwijl u de bundel scherpstelt, waarbij u ervoor zorgt dat deze zich in de middenpositie bevindt. Schakel bij het uitlijnen de P-bundel naar de 64-beams-modus en open de bijbehorende sluiter.

Controleer de positie van de straal. Stel de spiegels van de eerste tot en met de vijfde straalmultiplexer af, zodat de lichtstralen equidistant zijn. Aangezien gestreepte illuminatie-algoritmen gebaseerd zijn op deze aanname, vervangt u het uniform fluorescerende monster door het heterogeen gestructureerde monster.

Neem bijvoorbeeld een wortelmonster uit het Conval-gebied en scan een multi-beam afbeelding. Controleer of de afbeelding scherp, uniform en recht is. Vervang het heterogene monster door het homogene monster.

Start de XY-scanner om het scanproces te besturen. Om het gestreepte excitatiepatroon voor multi-beam scanning te genereren, beweegt u de Y-scannerspiegel loodrecht op de belichte straallijn.

Herhaal het gegenereerde patroon, hier aangegeven door het aantal blokken, door de X-scannerspiegel (hier aangeduid als block shift) te verplaatsen om een rechthoekig gestreept beeld te genereren. Plaats het heterogene monster terug en gebruik de scanner als de mastertrigger. Synchroniseer de camera met de scanner om automatisch een gestreept beeld te verkrijgen en op te slaan, zodat er herhaaldelijk gestreepte beelden kunnen worden vastgelegd.

Verplaats de X-scannermirror naar verschillende posities door hier voldoende herhalingsstappen, het aantal verschuivingen en de juiste staplengte te kiezen. Kies een verschuivingsstap tussen twee opeenvolgende gestreepte beelden om de afstand tussen twee opeenvolgende bundelbreedtes te overbruggen. Stel de X-verschuiving in op een waarde die onder de limiet van de laterale resolutie ligt bij de gegeven excitatiegolflengte.

Gebruik bijvoorbeeld 10 stappen van de X-scannerspiegel per shift en 12 of 13 shifts om de beste ruimtelijke resolutie te verkrijgen. Optimaliseer deze twee waarden aan de hand van de resultaten met de conval area root slide, totdat de afbeelding van het conval area het scherpst is. Gebruik de line profile-tool op de conventionele CCD-afbeeldingen en de berekende afbeeldingen met gestreepte verlichting.

Vergelijk de breedte van de lijnprofielen, wat in dit voorbeeld het fluorescentiesignaal van de celwanden van conval is. Neem elke ruwe gestreepte afbeelding synchroon met de beweging van de scanner op en sla deze afzonderlijk op, bijvoorbeeld als TIFF- of binaire bestanden. Om een tweedimensionale matrix van de gestreepte verlichtingsafbeelding met hoge resolutie te genereren, opent u een volledige set ruwe gestreepte afbeeldingen als matrices in de evaluatieroutine.

Gebruik ofwel het minimum maximum-algoritme of een op de Fourier-transformatie gebaseerd algoritme, zoals eerder in detail is beschreven, om gestreepte belichting, multi-beam, multi-foton microscopie in diep weefsel uit te voeren. Neem in levende organismen gestreepte beelden op verschillende weefseldieptes in de loop van de tijd op en evalueer deze zoals eerder beschreven, om een 3D-film met een hoge resolutie te genereren van de dynamische interactie tussen kiemcentra, B-cellen en folliculaire dendritische cellen. De dimensies van de effectieve point spread function komen overeen met de ruimtelijke resolutie van een microscoop.

We hebben deze driedimensionale functie gemeten door het signaal van de tweede harmonische generatie van collageenvezels of het fluorescentiesignaal van polystyreenbolletjes van 100 nanometer die emitteren bij 515 nanometer in lymfeklieren van muizen te verwerven. Hierbij is onze multi-beam striped illumination T-P-L-S-M gebruikt in vergelijking met gevestigde twee-foton laser-scanning microscopietechnieken, zoals field detection T-P-L-S-M met behulp van CCD-camera's en point detection T-P-L-S-M. Uit deze metingen blijkt duidelijk dat aan het oppervlak van het preparaat zowel de laterale als de axiale resolutie overeenkomen met de verwachte waarden zoals voorspeld door de diffractietheorie.

Echter, bij een toenemende beelddiepte, en daarmee een toenemend optisch pad van zowel excitatie- als emissiestraling door een medium met sterk variërende brekingsindices, verslechtert de ruimtelijke resolutie aanzienlijk, onafhankelijk van de gebruikte opstelling. Door M-B-S-I-T-P-L-S-M te gebruiken, onafhankelijk van de beelddiepte, bereikten we een ongeveer 20% betere laterale resolutie en een 220% betere axiale resolutie in vergelijking met de standaard T-P-L-S-M-benaderingen.

De clonale selectie van B-cellen tijdens de immuunrespons in de secundaire lymfoïde organen van volwassen muizen is de eerste stap in hun differentiatie tot geheugen-B-cellen of plasmacellen. In dit proces wordt verondersteld dat de zeer dynamische interactie tussen folliculaire dendritische cellen en B-cellen op het niveau van immuuncomplexstructuren binnen kiemcentra een centrale rol speelt. Alleen door het gebruik van een hoogresolutie intravitale microscopietechnologie is het mogelijk om deze cellulaire communicatie en de implicaties ervan voor de immuunrespons te ontleden, hier gevisualiseerd door follicular dendritic cells te labelen met anti CD 2135 FAB ATO five 90.

M-B-S-I-T-P-L-S-M maakt voor het eerst de mogelijkheid mogelijk om in vivo de dimensies van clusters van immuuncomplexafzettingen tot een diepte van 120 micron in kiemcentra van populiere lymfeklieren te visualiseren en te kwantificeren. Deze afbeeldingen tonen de directe vergelijking tussen de 3D-fluorescentiebeelden van immuuncomplexafzettingen in een kiemcentrum, zoals verkregen met conventionele PMT-gebaseerde systemen en met M-B-S-I-T-P-L-S-M. Bovendien konden de interacties van de immuuncomplexafzettingen met B-cellen in het kiemcentrum met een hoge resolutie worden weergegeven en kunnen deze nu worden onderzocht in combinatie met in vivo functionele probes voor proliferatie, differentiatie of apoptose.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met het feit dat bij een techniek op basis van cameradetectie de acquisitiesnelheid ongeveer acht keer hoger is, terwijl de maximale beelddiepte ongeveer 25% lager is dan die van een standaard multifotonmicroscoop op basis van fotomultiplicatoren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het configureren van uw multifotonmicroscoop voor gebruik met de methode van gestreepte illuminatie, inclusief het afstellen van de lichtpad van de microscoop, de uitlijning van de straalstaven, de berekening van de scanparameters en de manieren om het uiteindelijke resolutiebeeld te berekenen voor intravitale diepe weefselexperimenten.