Ultrasound Imaging-begeleide Intracardiale Injection een muismodel van borstkanker hersenmetastasen Gevolgd door Longitudinale MRI Ontwikkelen
6 maart 2014
Een borstkanker hersenmetastasen muismodel wordt vastgesteld met echografie-imaging geleide intracardiale injectie van MDA-MB231/Br-GFP cellen. Ontwikkeling van multifocale intracraniële metastasen is longitudinaal gevolgd met behulp van hoge-resolutie 9.4 T MRI.
Het algemene doel van deze procedure is om echogeleide technieken te gebruiken voor het vestigen van een muismodel voor hersenmetastasen bij borstkanker, dat vervolgens via MRI kan worden gemonitord. Dit wordt bereikt door hersentrope borstkankercellen te verzamelen en deze in de linker ventrikel te injecteren. Met behulp van echogeleiding wordt de intracraniële tumorontwikkeling vervolgens gemonitord.
Met behulp van MRI worden metastasen bevestigd via h&e-kleuring. Uiteindelijk kan nauwkeurige injectie onder beeldgeleiding het succes van de monitoring, vorming en ontwikkeling van hersenmetastasen bij borstkanker aanzienlijk verhogen. Longitudinale MRI maakt een niet-invasieve monitoring van de vorming en ontwikkeling van borstkanker mogelijk.
Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het University of Texas Southwestern Medical Center. Voor dit protocol moeten M-D-A-M-B 2 31 B-R-G-F-P-cellen gereed zijn, gekweekt in DMEM-medium met 10% FBS, 1% glutamine en 1% penicilline-streptomycine. Controleer voortdurend de conditie van de cellen en vervang het medium elke twee tot drie dagen. Wanneer een confluentie van 80% is bereikt, worden de cellen getrypsineerd en geoogst.
Verwijder eerst het oude medium volledig met een vacuümpipet. Voeg vervolgens vijf milliliter PBS toe om de cellen voorzichtig te wassen totdat alle cellen met PBS zijn bedekt. Verwijder daarna het wasmiddel.
Voeg vervolgens 1,5 milliliter trypsine toe aan de schaal. Kantel de schaal voorzichtig om ervoor te zorgen dat alle cellen met trypsine zijn bedekt. Plaats de schaal terug in de celincubator bij 37 °C.
Wacht één minuut en observeer de cellen onder een microscoop. Als ze rond zijn en zweven, zijn ze losgekomen. Voeg drie milliliters medium toe om de digestie te stoppen en pipetteer het celmengsel naar een centrifugebuis.
Centrifugeer het mengsel bij 1.160 G gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens het medium voorzichtig met een vacuümpipet. Resuspendeer daarna de cellen voorzichtig in vijf milliliter serumvrij medium met een pipet, totdat er geen zichtbare celpellet meer is en de oplossing homogeen oogt voor 50 µL van het celmengsel.
Voeg 50 µL trypaanblauw toe zodra het mengsel volledig homogeen is. Breng aliquots van 10 µL aan op verschillende telkamers. Tel vervolgens de cellen op basis van de waarden van de cel teller.
Bereken en gebruik het gemiddelde van alle tellingen. Maak nu een nauwkeurigere celsuspensie. Centrifugeer ze opnieuw en resuspendeer ze op 175.000 cellen per 100 µL serumvrij medium.
Bewaar de cellen vervolgens op ijs voor de intracardiale injectie. Gebruik voor dit protocol vrouwelijke BC nude-muizen in de leeftijd van zes tot acht weken. Log in op het beeldvormingssysteem en initialiseer de transducer.
7 0 4 bij 40 megahertz. Start een nieuwe studie en vul de informatieprompts dienovereenkomstig in. Anestheseer vervolgens de muis en dien het anestheticum toe via een neusconus.
Stel tijdens de begeleide injectie de temperatuur van de beeldvormingstafel in op 37 degrees Celsius en plak de muis in rugligging op de tafel vast. Houd de echogel voorafgaand aan de beeldvorming op 37 degrees Celsius en breng hiervan een kleine hoeveelheid aan op de borst van de muis. Plaats nu de transducer in de houder en laat deze zakken tot de gewenste beeldvormingsdiepte.
Vervolgens verplaatst u de tafel tot de linker ventrikel is geïdentificeerd, met de aorta ascendens als referentiepunt, en vergrendelt u de tafel wanneer het beeld het duidelijkst is. Trek nu 100 µL van het gekoelde celmengsel op in een spuit van 1 ml met een naald van 22 gauge. Bevestig de gevulde spuit aan de spuithouder.
Beweeg vervolgens de spuit naar de borstkas. Voordat u de muis binnendringt, beweegt u deze voorzichtig van zij naar zij totdat de naaldpunt zich in het beeldveld van de beeldvorming bevindt. Pas de hoogte en hoek van de naald aan om de linker ventrikel te targeten en penetreer, zodra de naald in positie is, prompt door de huid- en spierlagen in de linker ventrikel.
Onder begeleiding van het echobeeld is de terugstroom van helderrood arterieel bloed in de spuit een indicatie voor een succesvolle insertie in de linker ventrikel. Injecteer vervolgens het celmengsel langzaam, trek de naald eruit, til de transducer op en maak de echogel schoon met vochtig gaas. Verwijder daarna de tape van het dier en plaats het in een schone kooi met een voorverwarmd kussentje.
Observeer de muis tot deze volledig is hersteld en controleer daarna gedurende enkele dagen dagelijks de toestand ervan. Met een resolutie van 78 vierkante micron in het vlak kunnen MRI-hyperintense laesies worden geïdentificeerd bij een diameter van 310 micron. Omdat de metastasen in deze studie zeer klein waren en necrose en oedeem minimaal waren, vertegenwoordigde de hyperintense laesie op T2-gewogen beelden daadwerkelijk de tumor.
Grootschalige longitudinale MRI-studies maken een niet-invasieve in vivo evaluatie van tumorgroei mogelijk. Met MRI met een hoge resolutie konden drie weken na intracardiale injectie meerdere kleine laesies worden gedetecteerd; in week vier waren alle laesies die bij de vorige scan zichtbaar waren, vergroot. Op de T2-gewogen beelden waren meer nieuwe laesies verschenen.
H&E-kleuring toonde diffuse metastatische laesies aan, of H&E toonde cluster-type metastatische laesies aan. Vergrote vaten werden vaak waargenomen rond de tumor, wat erop wijst dat er niet-sproutende angiogenese plaatsvond. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een echogeleide naaldinjectie in de linker ventrikel van een muizenhart uitvoert.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie vestigt een muismodel voor hersenmetastasen bij borstkanker middels echogeleide intracardiale injectie van MDA-MB231/Br-GFP-cellen. De ontwikkeling van multifocale intracraniële metastasen wordt longitudinaal gemonitord met hoge-resolutie 9.4 T MRI.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Borstkanker kan metastaseren naar de hersenen, wat de behandeling bemoeilijkt.
- Het vaststellen van een betrouwbaar muismodel is cruciaal voor het bestuderen van hersenmetastasen.
- Echogeleide injecties verhogen de precisie van intracardiace injecties.
- Longitudinale MRI maakt niet-invasieve monitoring van de tumorgroei mogelijk.
Doel van de studie
- Om een model van borstkankerhersenmetastasen te creëren voor onderzoek.
- Om echogeleide injectie te gebruiken voor een nauwkeurige celinjectie.
- Om de tumorgroei en -ontwikkeling te monitoren met behulp van MRI.
Gebruikte methoden
- Echografie voor begeleiding tijdens intracardiale injectie.
- Injectie van MDA-MB231/Br-GFP borstkankercellen in de linker ventrikel.
- Longitudinale monitoring van tumorontwikkeling met behulp van 9.4 T MRI.
- Bevestiging van metastasen via histologische kleuring (H&E).
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vestiging van een model voor hersenmetastasen bij borstkanker.
- Multifocale intracraniële metastasen werden in de loop van de tijd waargenomen.
- Echogeleide injecties verbeterden de nauwkeurigheid van de celinjecties.
- Niet-invasieve MRI monitorde de tumorprogressie effectief.
Conclusies
- Het model biedt een waardevolle tool voor het bestuderen van hersenmetastasen bij borstkanker.
- Echogeleide injecties verhogen de succespercentages van experimenten.
- Longitudinale MRI is een krachtige methode voor het volgen van tumorontwikkeling.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor het management
Het vaststellen van fysiologisch relevante modellen van hersenmetastasen bij borstkanker is cruciaal voor preconklinische targetvalidatie en therapeutische screening. Echogeleide intracardiale injectie verbetert de getrouwheid van het model door een nauwkeurige aflevering van tumorcellen in de cerebrale circulatie te waarborgen, waardoor variabiliteit en experimenteel falen worden verminderd. Longitudinale MRI maakt niet-invasieve, kwantitatieve monitoring van de metastatische last mogelijk, wat go/no-go-beslissingen in pipelines voor oncologische geneesmiddelenontwikkeling ondersteunt.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken in een klinisch relevant metastasemodel.
- Operationele waarde: Vermindert het aantal mislukte modellen door nauwkeurige, echogeleide celtoediening.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het beperken van risico's bij targets door de hemodynamische verspreiding van borstkankercellen naar de hersenen te modelleren.
Screening & assayontwikkeling
- Klaar voor analyse: Genereert een consistente intracraniale tumorgroei voor screeningcampagnes van verbindingen.
- Kwantitatieve output: MRI biedt meetbare laesievolumes en -aantallen in de loop van de tijd voor dosis-responsanalyses.
- Schaalbaarheid: Een gestandaardiseerde workflow voor injectie en beeldvorming ondersteunt de reproduceerbaarheid in meerdere groepen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor de ziekte: bootst klinische patronen van multifocale hersenmetastasen na zoals gezien bij borstkanker in stadium IV.
- Translationele continuïteit: koppelt in vivo beeldvormingsbevindingen aan histopathologische validatie via H&E-kleuring.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: maakt longitudinale tracking mogelijk om het tijdstip en de effectiviteit van therapeutische interventies te bepalen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van modelvestiging tot therapeutische evaluatie, en ondersteunt vroege targetvalidatie via preklinische werkzaamheidstests.
- Ontdekkingsbiologie: Echogeleiding waarborgt een nauwkeurige injectie in de linker ventrikel, wat een betrouwbare initiatie van metastasen mogelijk maakt voor hypothesetoetsing.
- Screening: Op MRI gebaseerde laesiemetrieken leveren kwantitatieve eindpunten voor het beoordelen van de effecten van verbindingen op de tumorlast.
- Analytica: Longitudinale beeldvorming levert temporele gegevens over tumorgroei en laesieverdeling voor vergelijkende analyse.
- Translationeel onderzoek: Histologische bevestiging (H&E) stemt beeldvormingsbevindingen af op pathologische metastasenpatronen.
- Hergebruik binnen de organisatie: Het gestandaardiseerde protocol ondersteunt projectoverschrijdende toepassing in ontdekkingsprogramma's voor oncologie en neurowetenschappen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door technische variabiliteit bij de vestiging van het model te verminderen.
- Operationele waarde: Echogeleide injectie verhoogt de succespercentages en verlaagt de mortaliteit in vergelijking met handmatige injectie.
- Strategische waarde: Maakt een betere toewijzing van middelen mogelijk door de betrouwbaarheid van het model en de datakwaliteit te verbeteren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van reproduceerbare metastasefenotypes.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in echografie en de cardiale anatomie van kleine dieren.
- Afhankelijk van een hoogfrequent echotransducer en een MRI-compatibel platform voor dieren.
- Vereist standaardisatie van de celpreparatie en het injectievolume tussen verschillende operators.
- Aanpassing aan andere modellen vereist validatie van de vasculaire toegang en het celltropisme.
- Praktische beperking: Het succes is afhankelijk van de vaardigheid van de operator bij het visualiseren van de linker ventrikel onder echogeleiding.
