Methodologie voor de efficiënte generatie van fluorescerend gelabeld Vaccinia Virus Eiwitten

Dit experiment genereert fluorescent gelabelde recombinante vacciniavirussen via een modulaire en snelle methode gebaseerd op transiënte dominante selectie. Creëer eerst een recombinante vector die een fluorescent label bevat, omringd door gesynthetiseerde minimale homologieregio's, evenals markers voor metabole en fluorescentie-selectie. Transfecteer deze recombinatievector in geïnfecteerde cellen en amplificeer de recombinante virussen middels metabole selectie en fluorescentie. Verwijder vervolgens de metabole selectie om de marker-cassette uit te snijden en isoleer de cellen die recombinante virussen bevatten door middel van selectie op de fluorescentie-marker. De resultaten van virale plaques op cellagen maken de visualisatie mogelijk van individuele viruspartikels die kenmerkend zijn voor het fluorescent gelabelde gen.

We hebben deze methode ontwikkeld omdat we recombinante virussen met meerdere genetische modificaties wilden genereren met behulp van een selectiemethode die herhaaldelijk en universeel kon worden toegepast, ongeacht de tag. Hoewel het principe van transiënte dominante selectie eerder is beschreven, wilden we dit op grotere schaal en op modulaire wijze toepassen om meer flexibiliteit te verkrijgen bij het aanbrengen van genomische modificaties. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de screening en isolatie van recombinante virale plaques complex kunnen zijn. De frequentie hiervan kan laag zijn, waardoor specifieke methoden nodig zijn voor een efficiënt herstel van het virus.

Label het virale gen van belang aan de N- of C-terminus van het eiwit. Identificeer dienovereenkomstig flankerende homologieregio's van 150 basenparen lang. Ontwerp vervolgens een oligonucleotide-sequentie bestaande uit de linker- en rechterarmen van 150 basenparen, gescheiden door een paar restrictieplaatsen naar keuze. Flankeer deze regio tevens met een tweede paar restrictieplaatsen die verschillen van het eerste paar, om inbouw in de TDS-vector na synthese mogelijk te maken. Verifieer nu of het oligonucleotide met de restrictieplaatsen zo is ontworpen dat het in frame is met de gewenste insertieplaats. Zorg bij de oligonucleotidesynthese dat de restrictieplaatsen die tussen de linker- en rechterarmen zijn ingebouwd, overeenkomen met de plaatsen die het open leesraam van de gekozen fluorescentietag flankeren. Voeg dezezelfde restrictieplaatsen aan weerszijden van de fluorescentietag toe via PCR. Clone het gesynthetiseerde fragment in de TDS-vector. Clone tevens de fluorescentietag in de resulterende recombinatievector met behulp van de restrictieplaatsen tussen de linker- en rechterarmen van de homologieregio's. Infecteer een monolaag BS-C-one-cellen met vacciniavirus in serumvrij medium.

Eén uur na infectie worden de cellen gered met Dulbecco's modified eagle medium. Transfecteer met een mengsel van recombinatievector-plasmide en transfectiereagentia in een verhouding van drie op één in serumvrij medium. Na 24 uur worden de cellen afgeschraapt en hersteld in DMEM zonder foetaal runderserum. Onderwerp de cellen aan drie vries-dooi-cycli om de cellen open te breken en de viruspartikels vrij te laten. Om vervolgens een adequate scheiding van individuele plaques te verkrijgen, worden 100% confluente cellagen van BS-C-1-cellen geïnfecteerd met seriële verdunningen van de preparatie van viruspartikels. Bedek dit met een overlay van vloeibaar 10% FBS en DMEM plus de GPT-selectiereagentia en incubeer gedurende 24 uur.

Zuig de vloeibare overlay af en gebruik een fluorescentiemicroscoop om te zoeken naar plaques die diffuse rode fluorescentie vertonen, wat overeenkomt met de incorporatie van M-cherry van de TDS-vector in het virus. Afhankelijk van het doelgen en de gekozen fluorescentietag kan er in dezelfde rode plaque ook gelokaliseerde fluorescentie van het tag-gen worden waargenomen.

Select nu meerdere plaques voor elk recombinant virus, schraap deze met de pipetpunt en breng de cellen over naar een Eppendorf-buis met 100 µL DMEM bevattend 5% FBS. Voer drie vries-dooi-cycli uit met de afgeschraapte cellen om de recombinante virussen vrij te maken.

Voeg het DMEM met het ontdooide virus toe aan een monolaag cellen in een plaat met 12 putjes om de recombinante virussen te amplificeren met GPT-selectiereagentia in het groeimedium. Schraap vervolgens de succesvolle amplificaties 24 uur na infectie af. Zaai voor een plaque-assay van succesvol geamplificeerde plaques, die rode fluorescentie vertonen, een plaat met zes putjes met een monolaag BS-C-one cellen.

Voer een seriële verdunning van de recombinante virussen uit en infecteer de wells met een toenemende verdunning van de virussen in FBS-vrij DMEM. Verwijder 1 uur na infectie het vloeibare medium en bedek elke well met 0,5% agarose in compleet minimal essential medium. Selecteer drie dagen na infectie de plaques die zowel rode fluorescentie als de kleur van de gekozen fluorescentie-tag vertonen.

Amplificeer deze opnieuw zonder GPT-selectie. Selecteer plaques die hun diffuse rode fluorescentie hebben verloren, maar de gelokaliseerde fluorescentie behouden die overeenkomt met de gekozen tag. Zet de plaque-zuivering voort zonder selectie om een zuivere voorraad recombinante virussen te verkrijgen die de M-cherry- en GPT-selectiegenen hebben verloren, maar de gelokaliseerde fluorescentie behouden die overeenkomt met de gekozen tag.

Evalueer de zuiverheid van de voorraden met een plaque-assay, waarbij wordt gestreefd naar plaques met een vergelijkbaar plaquefenotype. Amplificeer de testvirale voorraden in een monolaag van BS-C-one cellen. Schraap de geïnfecteerde cellen 24 uur na infectie in 250 µL DMEM. Centrifugeer de geïnfecteerde cellen, verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 500 µL 0,1% SDS in TE-buffer. Vortex om de cellen te lyseren. Voeg vervolgens 500 µL fenol, chloroform en isoamylalcohol toe en keer het buisje om om te mengen. Centrifugeer. Oogst de bovenfase en herhaal de extractie.

Voeg vervolgens één milliliter gekoelde, 100% ethanol en 50 µL natriumacetaat toe om het DNA uit de waterige laag te precipiteren. Meng door inversie en bewaar het monster gedurende de nacht bij -20 °C. Nadat het DNA door centrifugatie is gepelletteerd, wordt alle vloeistof verwijderd, wordt de DNA-pellet aan de lucht gedroogd en wordt deze opnieuw gesuspendeerd in 50 µL TE-buffer. Gebruik dit genomische DNA-template voor PCR-screening op virale insertie. Genereer recombinante virussen met meerdere tags zoals gedetailleerd in het tekstprotocol.

Deze recombinante vacciniavirussen brengen eiwitten tot expressie die zijn gelabeld met fluorescentiemarkers gericht op virale structurele eiwitten, A3 en F13, die respectievelijk deel uitmaken van de binnenste viruskern en de buitenste envelop. Genen die corresponderen met virion-gelokaliseerde eiwitten werden geselecteerd om viruspartikels te visualiseren. A3 is een kerneiwit van het vacciniavirion en F13 is een viraal envelopeiwit.

Ook een dubbel gelabeld virus met zowel fluorescentielabel A3 als F13 wordt getoond. Realtime fluorescentiemicroscopie kan worden uitgevoerd met een dubbel gelabeld virus. In dit geval gaat het om het innerlijke kerneiwit van het vacciniavirus. A3 is rood gelabeld en het buitenste envelop-eiwit F13 is groen gelabeld.

Onomhulde virusdeeltjes uit de virusfabriek zijn in het rood gevisualiseerd en omhulde virionen worden weergegeven door colocalisatie van de rode en groene kanalen. Kwantitatieve analyse werd gebruikt om de recombinatie-efficiënties tussen recombinante vectoren en het genoom van het vacciniavirus te bepalen. De efficiëntie van homologe recombinatie van vectoren met het genoom van het vacciniavirus kan worden gedetecteerd met homologieregio's van slechts 70 baseparen.

Deze methode is gebruikt om virussen te creëren met meerdere fluorescerende markers en/of meerdere gen-deleties. Deze zijn ingezet bij de studie naar de infectieuze levenscyclus van het virus, de rol van virale eiwitten bij het ondermijnen van de afweersystemen van de gastheer, en interacties met signaleringsprocessen van de gastheer. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het genereren van recombinante vacciniavirussen met behulp van een methode die modulair is in de gebruikte markers, nauwkeurig is in het isoleren van de gewenste recombinanten en toepasbaar is in diverse onderzoekcontexten.