Name: Methodologie voor de efficiënte generatie van fluorescerend gelabeld Vaccinia Virus Eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Leer een modulaire methode voor het genereren van fluorescerend gelabelde recombinante vacciniavirussen met behulp van tijdelijke dominante selectie. Dit protocol vereenvoudigt genetische modificaties en verbetert de efficiëntie van virale plaque-isolatie voor virologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door de Australian Research Council Federation Discovery Project grant #1096623.

1. De recombinatievector maken
<ol><li>Identificeer 150 bp lange flankerende gebieden van homologie (aangeduid als de linker- en rechterarmen) die nodig zijn om het virale gen van belang N- of C-terminaal te labelen (zie figuur 1b).</li>
	<li>Ontwerp een oligonucleotidesequentie bestaande uit de linker- en rechterarmen van 150 bp, gescheiden door een paar beperkingsplaatsen naar keuze. Deze hele reeks moet ook worden geflankeerd door een tweede paar beperkingssites (anders dan het eerste paar) om opname in de TDS-vector mogelijk te maken zodra deze is gesynthetiseerd. Wees voorzichtig bij het ontwerpen van het oligonucleotide met beperkingssites dat de sequenties in beeld zijn met de gewenste invoegplaats.</li>
	<li>Neem bij het ontwerpen van het oligonucleotide voor synthese beperkingsplaatsen tussen de linker- en rechterarm op, die moeten overeenkomen met die welke het open leeskader van de fluorescerende tag naar keuze flankeren (zie figuur 1b). Het is mogelijk om een NotI-beperkingsplaats te gebruiken als een drie aminozuur linker tussen de linkerarm en het begin van de fluorescerende tag.</li>
	<li>Neem dezelfde beperkingssites op aan weerszijden van de fluorescerende tag door PCR (zie figuur 1c).</li>
	<li>Kloon het gesynthetiseerde fragment in de TDS-vector.</li>
	<li>Kloon de fluorescerende tag in de resulterende recombinatievector met behulp van de beperkingssites tussen de linker- en rechterarmgebieden van homologie (zie figuur 1d).</li>
</ol>2. Recombinant Virus Generatie
<ol><li>Volgens figuur 2,infecteer een monolaag van BS-C-1 cellen met vaccinia virus in serumvrije media bij een Multiplicity of Infection (MOI) > 1.</li>
	<li>1 uur na infectie, reddingscellen met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) en transfect met een mengsel van recombinatievectorplasmide en transfectiereagens in een verhouding van 3:1 in serumvrije media.</li>
	<li>Schraap en herstel na 24 uur cellen in DMEM die geen foetale runderserum (FBS) bevatten en voer drie vries-dooicycli uit om open cellen te breken en virusdeeltjes vrij te geven.</li>
	<li>Voer een plaquetest uit met een vloeibare overlay van 10% FBS DMEM en GPT selectiereagentia mycophenolzuur (25 μg/ml) en xanthine (250 μg/ml) als volgt:<ol>
<li>Zaai een 6-well plaat met een monolaag van BS-C-1 cellen.</li>
		<li>Infecteer 100% samenvloeiende celmonolagen met seriële verdunningen van de met bevriezing ontdooide cellen die virusdeeltjes bevatten om een adequate scheiding van individuele plaques te garanderen.</li>
		<li>Overlay met vloeibare 10% FBS die DMEM bevat die de GPT-selectiereagentia bevatten - mycophenolzuur en xanthine bij eindconcentraties van respectievelijk 25 μg/ml en 250 μg/ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwijder na een incubatie van 24 uur de vloeibare overlay en gebruik een fluorescerende microscoop om te zoeken naar plaques met diffuse rode fluorescentie die overeenkomen met de opname van mCherry uit de TDS-vector in het virus. Afhankelijk van het doelgen en de gekozen fluorescerende tag kan lokale fluorescentie van het gelabelde gen ook worden waargenomen in dezelfde rode plaque.</li>
	<li>Kies meerdere plaques voor elk recombinantvirus door gelokaliseerd schrapen met een pipetpunt en 100 μl 5% FBS met DMEM om cellen over te brengen naar een Eppendorf-buis, gevolgd door drie rondes vries-ontdooien van geschraapte cellen om recombinante virussen vrij te geven.</li>
	<li>Voeg de DMEM met freeze-thawed virus toe aan een monolaag van cellen in een 12-well plaat om recombinante virussen te versterken met GPT-selectiereagentia in de groeimedia. Schraap succesvolle versterkingen 24 uur na infectie.</li>
	<li>Voer een plaquetest uit van met succes versterkte plaques met rode fluorescentie, dit keer met een agarose-overlay en GPT-selectie, als volgt:<ol>
<li>Zaai een 6-well plaat met een monolaag van BS-C-1 cellen.</li>
		<li>Voer een seriële verdunning van de recombinante virussen uit en infecteer putten met een toenemende verdunning van virussen in FBS-vrije DMEM.</li>
		<li>1 uur na infectie, verwijder de vloeibare media en belaag elke put met 0,5% agarose in minimaal essentieel medium (MEM) met 2,5% FBS, 292 μg/ml L-glutamine, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine, samen met de GPT-selectiereagentia.</li>
	</ol></li>
	<li>2-3 dagen na infectie, kies plaques met fluorescentie die zowel rood is als de kleur van de gekozen fluorescerende tag om opnieuw te versterken, dit keer zonder GPT-selectie.</li>
	<li>Voer de volgende plaquetest uit met een agarose-overlay zonder selectie.</li>
	<li>Kies plaquettes die hun diffuse rode fluorescentie hebben verloren, maar de gelokaliseerde fluorescentie behouden die overeenkomt met de tag van keuze.</li>
	<li>Ga door met plaquezuiveren zonder selectie om een zuivere voorraad recombinante virussen te verkrijgen die de mCherry- en gpt-selectiegenen hebben verloren, maar de gelokaliseerde fluorescentie behouden die overeenkomt met de gekozen tag. Controleer of de voorraden zuiver zijn door plaquetest, alle plaques moeten een vergelijkbaar plaquefenotype hebben.</li>
	<li>Gebruik PCR-screening van genomisch DNA om ervoor te zorgen dat virale voorraden zuiver zijn.<ol>
<li>Ontwerp primers die de fluorescerende geninvoegplaats flankeren en primers die het ingevoegde fluorescerende gen zelf versterken. Verschillende combinaties van deze primers produceren PCR-amplicons die geninvoeging detecteren en zuiverheid aangeven.</li>
		<li>Versterken virale voorraden te worden PCR gescreend in een put van een 12-put plaat monolayer van BS-C-1 cellen.</li>
		<li>24 uur na infectie geïnfecteerde cellen in 250 μl DMEM schrapen.</li>
		<li>Centrifugeer geïnfecteerde cellen (18.000 x g gedurende 10 min, 4 °C), verwijder supernatans en resuspend celkorrel in 500 μl TE (10 mM Tris-HCl en 1 mM EDTA, pH 8) met 0,1% (v/v) SDS. Vortex aan lyse cellen.</li>
		<li>Voeg 500 μl fenol-chloroform-isoamyl acohol toe, omkeren om te mengen. Centrifugeer (18.000 x g gedurende 4 min, 4 °C). Neem de supernatant en herhaal.</li>
		<li>Voer een ethanolprecipitatie uit op het supernatant door 1 ml 100% ethanol (gekoeld) en 50 μl natriumacetaat toe te voegen, omkeren om te mengen.</li>
		<li>Laat 's nachts bij -20 °C of -80 °C gedurende 1 uur staan. Centrifugeer (18.000 x g gedurende 30 min, 4 °C), verwijder alle vloeistof en laat neergeslagen DNA aan de lucht drogen. Resuspend in 50 μl TE.</li>
		<li>Gebruik dit als sjabloon voor genomische DNA PCR-screening.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Generatie van recombinante virussen die meer dan één tag dragen
<ol><li>Coinfect dezelfde cel monolayer met fluorescerende recombinante virussen om dubbel- of triple-label virussen te creëren of herhaal procedure van Protocol 1) met een andere tag.</li>
	<li>Zuiver virussen op basis van plaquefenotype of PCR-screening van virusisolaat genomisch DNA.</li>
</ol>

<ol><li>Fenner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adventures+with+poxviruses+of+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Adventures with poxviruses of vertebrates.</a> FEMS Microbiol. Rev. 24, 123-133 (2000).</li>
<li>Goebel, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Complete+DNA-Sequence+of+Vaccinia+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The Complete DNA-Sequence of Vaccinia Virus.</a> Virology. 179, 247-266 (1990).</li>
<li>Smith, G. L., Chan, Y. S., Howard, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide-sequence+of+42+kbp+of+vaccinia+virus-strain+WR+from+near+the+right+inverted+terminal+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide-sequence of 42 kbp of vaccinia virus-strain WR from near the right inverted terminal repeat.</a> J. Gen. Virol. 72, 1349-1376 (1991).</li>
<li>Roberts, K. L., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+morphogenesis+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus morphogenesis and dissemination.</a> Trends Microbiol. 16, 472-479 (2008).</li>
<li>Gammon, D. B., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3+%27-to-5+%27+Exonuclease+Activity+of+Vaccinia+Virus+DNA+Polymerase+Is+Essential+and+Plays+a+Role+in+Promoting+Virus+Genetic+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The 3 '-to-5 ' Exonuclease Activity of Vaccinia Virus DNA Polymerase Is Essential and Plays a Role in Promoting Virus Genetic Recombination.</a> J. Virol. 83, 4236-4250 (2009).</li>
<li>Yao, X. D., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+DNA+structure+and+homology+length+on+vaccinia+virus+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of DNA structure and homology length on vaccinia virus recombination.</a> J. Virol. 75, 6923-6932 (2001).</li>
<li>Ward, B. Ch. 16 Vaccinia Virus and Poxvirology Vol. 269 Methods in Molecular Biology. Isaacs, S. N. 16, Humana Press. 205-218 (2004).</li>
<li>Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+Poxvirus+Vectors+Have+Capacity+for+at+Least+25%2C000%5BTitle%5D)+AND+%22Base-Pairs+of+Foreign+DNA.+Gene%22%5BJournal%5D)">Infectious Poxvirus Vectors Have Capacity for at Least 25,000.</a> Base-Pairs of Foreign DNA. Gene. 25, 21-28 (1983).</li>
<li>Heuser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep-etch+EM+reveals+that+the+early+poxvirus+envelope+is+a+single+membrane+bilayer+stabilized+by+a+geodetic+%26%2334%3Bhoneycomb%26%2334%3B+surface+coat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep-etch EM reveals that the early poxvirus envelope is a single membrane bilayer stabilized by a geodetic &#34;honeycomb&#34; surface coat.</a> J. Cell Biol. 169, 269-283 (2005).</li>
<li>Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., Mercer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+host+cell+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Virol%22%5BJournal%5D)">Poxvirus host cell entry.</a> Curr. Opin. Virol. 2, 20-27 (2012).</li>
<li>Ward, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+characterization+of+the+intracellular+movement+of+vaccinia+virus+intracellular+mature+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visualization and characterization of the intracellular movement of vaccinia virus intracellular mature virions.</a> J. Virol. 79, 4755-4763 (2005).</li>
<li>Carter, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+cores+are+transported+on+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus cores are transported on microtubules.</a> J. Gen. Virol. 84, 2443-2458 (2003).</li>
<li>Ward, B. M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+intracellular+movement+of+vaccinia+virus+virions+containing+a+green+fluorescent+protein-B5R+membrane+protein+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera.</a> J. Virol. 75, 4802-4813 (2001).</li>
<li>Rodriguez, J. F., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+size+phenotype+as+a+selectable+marker+to+generate+vaccinia+virus+recombinants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Plaque size phenotype as a selectable marker to generate vaccinia virus recombinants.</a> J. Virol. 63, 997-1001 (1989).</li>
<li>Blasco, R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+recombinant+vaccinia+viruses+on+the+basis+of+plaque-formation%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque-formation.</a> Gene. 158, 157-162 (1995).</li>
<li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+-+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus - a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7415-7419 (1982).</li>
<li>Panicali, D., Grzelecki, A., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+vectors+utilizing+the+beta-galactosidase+assay+for+rapid+selection+of+recombinant+viruses+and+measurement+of+gene-expression%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus vectors utilizing the beta-galactosidase assay for rapid selection of recombinant viruses and measurement of gene-expression.</a> Gene. 47, 193-199 (1986).</li>
<li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia-coli+gpt+gene+provides+dominant+selection+for+vaccinia+virus+open+reading+frame+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Escherichia-coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors.</a> J. Virol. 62, 1849-1854 (1988).</li>
<li>Liu, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+recombinant+vaccinia+viruses+%28Tian-Tan+strain%29+expressing+hepatitis-B+virus+surface-antigen+by+using+beta-galactosidase+as+a+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+China+Ser.+B-Chem%22%5BJournal%5D)">Selection of recombinant vaccinia viruses (Tian-Tan strain) expressing hepatitis-B virus surface-antigen by using beta-galactosidase as a marker.</a> Sci. China Ser. B-Chem. 33, 188-197 (1990).</li>
<li>Domínguez, J., Lorenzo, M. D. M., Blasco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+expressed+by+a+recombinant+vaccinia+virus+permits+early+detection+of+infected+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein expressed by a recombinant vaccinia virus permits early detection of infected cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 220, 115-121 (1998).</li>
<li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> J. Virol. 64, 3108-3111 (1990).</li>
<li>Cordeiro, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F11-Mediated+Inhibition+of+RhoA+Signalling+Enhances+the+Spread+of+Vaccinia+Virus+In+Vitro+and+In+Vivo+in+an+Intranasal+Mouse+Model+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">F11-Mediated Inhibition of RhoA Signalling Enhances the Spread of Vaccinia Virus In Vitro and In Vivo in an Intranasal Mouse Model of Infection.</a> Plos One. 4, (2009).</li>
<li>Jensen, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+major+membrane+and+core+proteins+of+vaccinia+virus+by+two-dimensional+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of the major membrane and core proteins of vaccinia virus by two-dimensional electrophoresis.</a> J. Virol. 70, 7485-7497 (1996).</li>
<li>Hirt, P., Hiller, G., Wittek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+Fine-Structure+of+a+Vaccinia+Virus+Gene+Encoding+an+Envelope+Antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Localization and Fine-Structure of a Vaccinia Virus Gene Encoding an Envelope Antigen.</a> J. Virol. 58, 757-764 (1986).</li>
<li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">An improved cyan fluorescent protein variant useful for.</a> 22, 445-449 (2004).</li>
<li>Shu, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells%2C+Tissues%2C+and+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Biol%22%5BJournal%5D)">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> Plos Biol. 9, (2011).</li>
<li>Wong, Y. C., Lin, L. C. W., Melo-Silva, C. R., Smith, S. A., Tscharke, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+recombinant+poxviruses+using+a+compact+GFP-blasticidin+resistance+fusion+gene+for+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering recombinant poxviruses using a compact GFP-blasticidin resistance fusion gene for selection.</a> J. Virol. Methods. 171, 295-298 (2011).</li>
<li>Broder, C. C., Earl, P. L. 62, 173-197 (1997).</li>
<li>Blasco, R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vaccinia+virus+formation+and+cell-to-cell+virus+transmission+are+prevented+by+deletion+of+the+gene+encoding+the+37%2C000-dalton+outer+envelope+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vaccinia virus formation and cell-to-cell virus transmission are prevented by deletion of the gene encoding the 37,000-dalton outer envelope protein.</a> J. Virol. 65, 5910-5920 (1991).</li>
<li>Newsome, T. P., Marty, A. J., Lynn, H., Procter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ch.+Navigating+the+subcellular+space%3A+Lessons+from+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Transport%2C+Assembly+and+Egress%22%5BJournal%5D)">Ch. Navigating the subcellular space: Lessons from vaccinia virus.</a> Viral Transport, Assembly and Egress. Diefenbach, R. J., Cunningham, A. L. , Research Signpost. 155-177 (2011).</li>
<li>Jeshtadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Poxvirus+Intracellular+Mature+Virion+Proteins+with+the+TPR+Domain+of+Kinesin+Light+Chain+in+Live+Infected+Cells+Revealed+by+Two-Photon-Induced+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Interaction of Poxvirus Intracellular Mature Virion Proteins with the TPR Domain of Kinesin Light Chain in Live Infected Cells Revealed by Two-Photon-Induced Fluorescence Resonance Energy Transfer Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy.</a> J. Virol. 84, 12886-12894 (2010).</li>
<li>Weisswange, I., Newsome, T. P., Schleich, S., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+N-WASP+exchange+limits+the+extent+of+ARP2%2F3-complex-dependent+actin-based+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The rate of N-WASP exchange limits the extent of ARP2/3-complex-dependent actin-based motility.</a> Nature. 458, (2009).</li>
<li>Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Vaccinia+reporter+viruses+for+rapid%2C+high+content+analysis+of+viral+function+at+all+stages+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression.</a> Antiviral Res. 91, 72-80 (2011).</li>
<li>Dénes, B., Fodor, N., Obenaus, A., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+oncolytic+Vaccinia+viruses+for+non-invasive+optical+imaging+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Engineering oncolytic Vaccinia viruses for non-invasive optical imaging of tumors.</a> Open Biotechnol. J. 2, 252-261 (2008).</li>
<li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin+Potentiates+Vaccinia-Induced+Actin+Polymerization+to+Facilitate+Viral+Spread%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Clathrin Potentiates Vaccinia-Induced Actin Polymerization to Facilitate Viral Spread.</a> Cell Host Microbe. 12, 346-359 (2012).</li>
<li>Horsington, J., Turnbull, L., Whitchurch, C. B., Newsome, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-viral+imaging+of+vaccinia+virus+using+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-viral imaging of vaccinia virus using super-resolution microscopy.</a> J. Virol. Methods. 186, 132-136 (2012).</li>
<li>Horsington, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A36-dependent+Actin+Filament+Nucleation+Promotes+Release+of+Vaccinia+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A36-dependent Actin Filament Nucleation Promotes Release of Vaccinia Virus.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten aangegeven.

Deze techniek beschrijft een efficiënt en modulair protocol voor het creëren van recombinante virussen die fluorescerend gelabelde virale eiwitten uitdrukken. De methode zorgt ervoor dat de enige verandering in het virale genoom de toevoeging van een tag of marker is, waardoor er geen selectiemarkers achterblijven. De korte armlengte die nodig is voor homologe recombinatie maakt de directe synthese mogelijk, waardoor verschillende tijdrovende rondes PCR en klonen worden geëlimineerd, terwijl de fluorescentie van mCherry en metabole GPT-selectie worden gebruikt om virale recombinatie-tussenproducten te isoleren. Deze tussenproducten kunnen, na het verwijderen van de selectie, worden opgelost naar een virus met een gelabeld gen of terug naar het ouderlijk type. Een vergelijkbare methode met het gebruik van zowel fluorescerende als metabolische selectie is eerder beschreven27, hoewel de methode die in deze studie wordt gebruikt kortere, gesynthetiseerde gebieden van homologie gebruikt, waardoor de identificatie van het gewenste recombinante virus mogelijk is door de fluorescentie van het gelabelde gen van belang in beeld te brengen. Deze secundaire selectie is alleen van toepassing op het taggen van sterk uitgedrukte virale genen die voldoende fluorescentie produceren in een plaquetest. Als alternatief zou men kunnen overwegen om een complete expressiecassette in te voegen, bijvoorbeeld een fluorescerend eiwit onder een sterke virale promotor. In dit geval zouden de linker- en rechterarm het invoegpunt definiëren in plaats van het virale gen dat moet worden getagd.
Er zijn enkele belangrijke stappen die nuttig bleken tijdens de experimentele procedure. De hierboven beschreven vloeistofoverlay in stap 2.3.3 bleek cruciaal voor de detectie en isolatie van rood/groene fluorescerende plaquettes. Wij zijn van mening dat de combinatie van de GPT-selectiereagentia en agarose-overlay de groei van recombinante virussen afschrikte en daarom overschakelde op een vloeibare overlay voor de eerste stap van het versterken van virussen na transfectie. Het is ook belangrijk om fluorescerende plaques te kiezen met gelokaliseerde tagkleurfluorescentie voor verrijking en zuivering, omdat tussenproducten als gevolg van recombinatie van de linkerarm kunnen resulteren in diffuse fluorescentie waargenomen in plaques als de linkerarm ook een promotorsequentie bevat. Het mCherry-markergen in de TDS-vector kan ook worden vervangen door gfp,bijvoorbeeld om de eenvoudige integratie en selectie van mCherry als fluorescerende tag mogelijk te maken.
Sommige hierboven beschreven technieken verschillen enigszins van de vastgestelde methoden voor het creëren van recombinant vacciniavirus. De MOI van het virus dat wordt gebruikt om recombinanten te maken is bijvoorbeeld normaal gesproken minder dan 128, maar het gebruik van hogere MOIs is voldoende geweest voor het creëren van recombinant vaccinia-virus met deze methode. Het gebruik van GPT-selectiereagentia vereist normaal gesproken pre-incubatie van de cellen met selectiereagentia18, maar het toevoegen ervan tijdens de reddingsfase na infectie bood nog steeds voldoende selectie van gewenste recombinanten, vooral vanwege de aanwezigheid van een fluorescerende selectiemarker.
Zoals eerder vermeld, is een van de beperkingen van deze techniek dat de secundaire fluorescentieselectiestap afhankelijk is van het feit dat het gelabelde eiwit van belang sterk wordt uitgedrukt, op een niveau dat de detectie ervan door het oog in een plaquetest mogelijk maakt. Zonder dit zou het mogelijk zijn om virussen te zuiveren die alleen mCherry fluorescentie vertoonden, waarvan ten minste 50% de gewenste recombinante virussen zou bevatten, die kunnen worden geïdentificeerd door moleculaire strategieën zoals PCR beschreven in stap 2.12 hierboven. Een andere beperking zou de inactivatie van bepaalde eiwitten kunnen zijn als gevolg van hun tagging. De fluorescerende tag kan mutaties ondergaan of door het recombinante virus worden verwijderd met passaging in de loop van de tijd. Daarom wordt regelmatige bemonstering van recombinante virusvoorraden door microscopie en PCR aanbevolen. Ten slotte kan er een limiet zijn aan het aantal fluorescerend gelabelde eiwitten dat in één virus kan worden opgenomen. Een aspect hiervan is het vermogen om ze allemaal tegelijkertijd te visualiseren; gezien de overlappende aard van emissiespectra van beschikbare fluorescerende tags, is het belangrijk om ze zorgvuldig te selecteren om een minimale spectrale doorbloeding te garanderen. Bovendien opent het gebruik van nauw verwante tags zoals GFP en Cerulean de mogelijkheid van recombinatie tussen de twee, afhankelijk van hun locaties in het recombinante genoom.
Het modulaire karakter van deze techniek maakt het mogelijk om fluorescerende tags eenvoudig te vervangen op basis van compatibiliteit met andere kleurings- en/of tagkeuzes. Door selecteerbare markers te exciseren, maakt de TDS-methode de seriële toevoeging van verschillende fluorescerende eiwitten of de combinatie van TDS-gebaseerde tagging met op TDS gebaseerde gendeleties voor fenotypische analyses29mogelijk. Als voorbeeld voor het nut van deze aanpak werd een dubbel gelabeld fluorescerend virus gegenereerd dat viruskernen en het WV-membraan labelt. Beeldvormingsstudies met dit virus kunnen worden gebruikt om beweging, morfogenese en verpakking van het virus tijdens virusreplicatie te bestuderen. Tot nu toe kunnen niet-gekarakteriseerde vaccinia virale eiwitten ook worden getagd en bestudeerd door deze techniek.
Vaccinia virus is uitgebreid gebruikt in beeldvormingsstudies als gevolg van vele kenmerken van het virus die gunstig zijn voor live-cell microscopie. Fluorescerende tags worden uitgedrukt uit het virale genoom, waardoor transfectie niet nodig is, waardoor primaire cellen afkomstig van geïnfecteerde dieren of niet-overdraagbare cellen gemakkelijk kunnen worden geanalyseerd. Aanvankelijk werden fluorescerende VACV's gebruikt voor eenvoudige subcellulaire tracking van virusbeweging30, maar recentere benaderingen hebben hun nut uitgebreid met FRET-studies31, FRAP bij enkele virusdeeltjes32, promotorverslaggevers33, intravitale beeldvorming34en structurele studies35-37. Al deze technieken kunnen binnen een gemakkelijker en dichter bereik in combinatie met deze methode van het creëren van recombinante fluorescerende virussen.

Vacciniavirus (VACV) is het prototypische poxvirus en zeer verwant aan het variolavirus, de veroorzaker van pokken. Beide virussen zijn leden van het orthopokkengeslacht dat andere opmerkelijke pathogenen omvat, zoals monkeypox en ectromeliavirus (mousepox)1. Orthopoxvirussen hebben grote dubbelstrengs DNA-genomen (180-220 kb) die meer dan 200 voorspelde open leesframescoderen 2,3. Replicatie van deze virussen omvat de vorming van een perinucleaire virusfabriek, waar volwassen virussen (MV) worden gemaakt, en het trans-Golgi-netwerk waar een subset van MV twee extra membranen verwerft om verpakte virussen (WV) te genereren (beoordeeld door Roberts en Smith4). Orthopox-genomen zijn zeer vatbaar voor genetische manipulatie vanwege de hoge mate van genetische recombinatie die een kenmerk is van VACV-genoomreplicatie en wordt gemedieerd door het virale DNA-polymerase5. Het genereren van recombinante virussen is afhankelijk van homologe recombinatie en lineaire DNA-moleculen met homologieën zo klein als 12 bp die voldoende zijn om recombinatie in vaccinia met het virus geïnfecteerde cellen te bemiddelen6. Fluorescerende etikettering van vacciniavirus kan extreem heldere virusdeeltjes opleveren vanwege de grote omvang van orthopokkendeeltjes, waardoor veel fluorescerende eiwitten per virion kunnen worden opgenomen7. Vaccinia heeft de capaciteit om grote fragmenten van vreemd DNA8 te vervoeren en bovendien kan het ontbreken van rigide capsid-symmetrie een zekere mate van flexibiliteit mogelijk maken bij het uitdrukken van virale eiwitgenfusies uit hun endogene loci9. Fluorescerende tagging van VACV-eiwitten is van onschatbare waarde gebleken voor de studie van gastheer-pathogene interacties op subcellulair niveau, met name op het gebied van virusinvoer10, transport11-13, en morfogenese, met name van verpakte virionen7.
Recombinante virussen kunnen worden geselecteerd door redding van een verzwakt groeifenotype14,15, metabolische selectie16-18, of door expressie van een markergen(bijv. X-gal19 of fluorescerend eiwit13,20). Hier beschrijven we de selectie van fluorescerende virussen met behulp van een krachtige combinatie van fluorescerende en metabolische selectie. Transient dominant selection (TDS) vectoren, ontwikkeld door Faulkner en Moss (1990)21, maken het mogelijk markers te integreren samen met het gewenste fluorescerend gelabelde gen van belang. Wanneer metabolische selectie wordt verwijderd, kan een secundaire recombinatiegebeurtenis optreden die de selectiegenen verwijdert, maar het fluorescerend gelabelde viruseiwit intact laat. Figuur 2 hieronder geeft een overzicht van de experimentele procedure. De selectiegenen die in deze studie worden gebruikt, zijn mCherry en het Escherichia coli guanine phosphoribosyltransferase (gpt) gen, beide uitgedrukt uit een synthetische vroege/late virale promotor en eerder gebruikt door Cordeiro et al. 22 Bovendien is er fluorescentie van het getagde fusie-eiwit van belang. Wanneer metabolische selectie wordt verwijderd, worden de selecteerbare markers (mCherry en gpt ) verwijderd, waardoor alleen de fluorescentie van het gelabelde gen overblijft,waardoor de juiste recombinante virussen kunnen worden geïdentificeerd. De excisie van de selectiemarkers biedt de mogelijkheid om meerdere fluorescerende tags te combineren, waardoor we virussen kunnen maken met de mogelijkheid om meerdere virale eiwitten tegelijkertijd fluorescerend te labelen. Eerdere studies hebben de minimale homologische vereisten bepaald voor vaccinia recombinatie van lineaire en circulaire DNA-moleculen getransfecteerd in vaccinia virus geïnfecteerde cellen6. We wilden de recombinatie-efficiëntie bepalen van verschillende homologielengtes van flankerende armen in de gpt-mCherry TDS-vector door de opname ervan in het vaccinia virale genoom. Er werd vastgesteld dat homologe gebieden van 100 bp in de TDS-vector voldoende zijn om het inbrengen van recombinant DNA in het VACV-genoom te richten en te bemiddelen door homologe recombinatie (figuur 4). Terwijl kleinere homologielengtes ook recombinatie mogelijk zouden maken, zorgden homologielengtes van 100 bp voor voldoende recombinante virussen die gemakkelijk konden worden geïdentificeerd met metabolische en fluorescerende selectie. DNA-fragmenten van deze grootte kunnen commercieel worden gesynthetiseerd tegen relatief lage kosten en vergemakkelijken de productie van meerdere vectoren voor de creatie van recombinante virussen aanzienlijk. We hebben ervoor gekozen om de homologielengte te verhogen tot 150 bp om een grotere recombinatiefrequentie te bieden en tegelijkertijd de kosten van synthese van de oligonucleotidesequentie van flankerende regio's te beperken.

<table><tbody><tr><td>Mycovenzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3536-50MG</td><td>Oplossen in 0,1 N NaOH</td></tr><tr><td>Xanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X0626-5G</td><td>Oplossen in 0,1 N NaOH</td></tr><tr><td>FuGENE HD transfectie reagens</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop voorzien van Chroma filters 31001, 31002</td><td>Olympus, Chroma</td><td>BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

methodologie voor de efficiënte generatie van fluorescerend gelabeld vaccinia virus eiwitten

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Het taggen van virale eiwitten met fluorescerende eiwitten is een onmisbare aanpak gebleken om ons begrip van virus-gastheerinteracties te bevorderen. Vaccinia-virus (VACV), het levende vaccin dat wordt gebruikt bij de uitroeiing van pokken, is bijzonder vatbaar voor fluorescerende levendcellige microscopie vanwege de grote viriongrootte en het gemak waarmee het op genoomniveau kan worden ontworpen. We rapporteren hier een geoptimaliseerd protocol voor het genereren van recombinante virussen. De minimale vereisten voor gerichte homologe recombinatie tijdens vacciniareplicatie werden bepaald, wat de vereenvoudiging van de constructgeneratie mogelijk maakt. Dit stelde de alliantie van transient dominant selection (TDS) met een fluorescerende reporter en metabolische selectie in staat om een snelle en modulaire benadering van fluorescerende virale eiwitten te bieden. Door de generatie van fluorescerende recombinante virussen te stroomlijnen, zijn we in staat om downstream-toepassingen te vergemakkelijken, zoals geavanceerde beeldvormingsanalyse van veel aspecten van het virus-host-samenspel dat optreedt tijdens virusreplicatie.

Figuur 1 geeft een overzicht van de verschillende constructies die nodig zijn voor deze procedure, die ofwel worden gesynthetiseerd (figuren 1b en 1c) of worden gemaakt door kloonstappen (figuur 1d). Figuur 2 geeft een overzicht van de experimentele procedure met representatieve fluorescerende plaquettebeelden van een A3-GFP recombinant VACV afgebeeld voor elke stap van het selectieproces. In figuur 3worden recombinante vacciniavirussen weergegeven die eiwitten uitdrukken die zijn gelabeld met fluorescerende markers gericht op virale structurele eiwitten A3 en F13, die respectievelijk deel uitmaken van de binnenste viruskern23 en buitenste envelop24. Waarnemingen van virale plaques en geïnfecteerde cellen voor elk van de gecreëerde recombinante virussen worden afgebeeld. De efficiëntie van homologe recombinatie van vectoren met het VACV-genoom, dat slechts 70 bp-gebieden van homologie bevat, werd getest en de resultaten zijn weergegeven in figuur 4. Het relatieve succes van het identificeren van virale plaques gemaakt van recombinatie met vectoren die homologie van 100 bp bevatten, was de redenering achter de keuze om 150 bp lengte linker- en rechterarmen van homologie te synthetiseren naar het doelgen.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1.jpg" width="400px"> Figuur 1. Transient Dominant Selection (TDS) recombinatievector. (a) TDS-vector met gpt- en mCherry-selectiemarkeringen. ( b) Linker- en rechterarmen van homologie zijn ontworpen met specifieke beperkingsplaatsen tussen en flankerend van de armen van homologie. Beperkingsplaatsen tussen de linker- en rechterarmen die bij deze methode werden gebruikt, waren NotI en BamHI, waarbij de NotI-site ook werd gebruikt als linker tussen het gen en de fluorescerende tag. (c) Fluorescerende tags die compatibel zijn met deze methode worden geflankeerd door overeenkomstige beperkingssites. Enkele gebruikte tags zijn GFP (groen fluorescerend eiwit), RFP (rood fluorescerend eiwit), Cerulean (een verbetering ten opzichte van ECFP, een cyaan fluorescerend eiwit, door site-directed mutagenese25) en mini-SOG, een fluorescerend eiwit ontworpen uit GFP dat een product creëert dat door EM kan worden opgelost op verlichting26. d) Kloonstappen die betrokken zijn bij het genereren van de uiteindelijke TDS-recombinatievector. Het gesynthetiseerde oligonucleotide met de linker- en rechterflankarmen wordt eerst gekloond in de TDS-vector. Dit biedt een recombinatievector waarin elke tag naar keuze in en uit kan worden geshuwd door te klonen naar de beperkingssites die tussen de linker- en rechterarm zijn opgenomen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2.jpg" width="500px"> Figuur 2. Overzicht van de experimentele procedure om een recombinant vacciniavirus te creëren. Gebeurtenissen die zich voordoen op genetisch en cellulair niveau worden afgebeeld, samen met representatieve plaque-afbeeldingen die de stappen na de creatie van een A3-GFP-gelabeld fluorescerend vacciniavirus weergeven. (A) Cellen die besmet zijn met het vacciniavirus worden getransfecteerd met de TDS-recombinatievector. (B) In deze afbeelding wordt alleen het resultaat van linkse recombinatie weergegeven en in het voorbeeld wordt GFP gebruikt als de fluorescerende tag naar keuze. Rechtse recombinatie zou ertoe leiden dat de gehele TDS plasmide op een vergelijkbare manier in het genoom wordt opgenomen, behalve dat de tag in de tussenstap, d.w.z. stap C, wordt versmolten met het hele doelgen. Een plaquetest wordt uitgevoerd op een celmonolaag met de recombinatiemix en onderworpen aan GPT-selectie. (C) Plaquettes met zowel rode als groene fluorescentie, die overeenkomen met respectievelijk mCherry- en GFP-expressie, worden geplukt en versterkt. Zodra de selectie is verwijderd, zal er verlies van rode fluorescentie zijn die overeenkomt met het verlies van de gpt- en mCherrygenen (D) en plaques met uitsluitend groene fluorescentie worden geplukt en versterkt (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3.jpg" width="500px"> Figuur 3. Representatieve resultaten van het TDS-recombinatiesysteem. Afbeeldingen tonen hele plaques van recombinante VACV-infecterende cellen na 48 uur (a, c, e; schaalbalk 100 μm), vergezeld van een afbeelding van een enkele cel die na 8 uur is geïnfecteerd door het overeenkomstige recombinantvirus (b, d, f; schaalbalk 10 μm). Genen die overeenkomen met virion-gelokaliseerde eiwitten werden geselecteerd om virusdeeltjes te visualiseren. A3 is een kerneiwit van de vaccinia virion (a, b) en F13 (c, d) is een virale envelop eiwit. Er wordt ook een dubbel gelabeld virus met zowel fluorescerend gelabeld A3 als F13 (e, f) weergegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4.jpg" width="500px"> Figuur 4. Kwantitatieve analyse van recombinatie-efficiëntie tussen recombinante vectoren en het VACV-genoom. BS-C-1 monolagen werden geïnfecteerd met VACV en 1 uur na infectie getransfecteerd met drie recombinatievectoren die homologiegebieden van 500 bp, 100 bp of 70 bp bevatten naar het VACV-genoom. Elke vector bevatte ook de TDS-cassette bestaande uit gpt- en mCherry-selectiegenen. Cellen werden 24 uur na infectie hersteld en gelyseerd om de gevormde recombinante virussen vrij te geven. Plaquetesten werden uitgevoerd op cellysaten met GPT-selectiemedia en plaques met mCherry-fluorescentie werden geteld als succesvolle recombinanten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5.jpg" width="500px"> Figuur 5. Kaart van de gpt-mCherry TDS vector die de meervoudige kloonsite toont. De vector is eerder beschreven22 en de vectorkaart is gemaakt met behulp van EZ Plasmid Map v1.9 van de Zhang Lab Group (SCU). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" target="_blank">Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.</a>

Een snel en modulair protocol voor het genereren van recombinante vacciniavirussen die fluorescerend gelabelde eiwitten tegelijkertijd uitdrukken met behulp van de methode van voorbijgaande dominante selectie wordt hier beschreven.

Methodologie voor de efficiënte generatie van fluorescerend gelabeld Vaccinia Virus Eiwitten

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Dit experiment genereert fluorescent gelabelde recombinante vacciniavirussen via een modulaire en snelle methode gebaseerd op transiënte dominante selectie. Creëer eerst een recombinante vector die een fluorescent label bevat, omringd door gesynthetiseerde minimale homologieregio's, evenals markers voor metabole en fluorescentie-selectie. Transfecteer deze recombinatievector in geïnfecteerde cellen en amplificeer de recombinante virussen middels metabole selectie en fluorescentie. Verwijder vervolgens de metabole selectie om de marker-cassette uit te snijden en isoleer de cellen die recombinante virussen bevatten door middel van selectie op de fluorescentie-marker. De resultaten van virale plaques op cellagen maken de visualisatie mogelijk van individuele viruspartikels die kenmerkend zijn voor het fluorescent gelabelde gen.We hebben deze methode ontwikkeld omdat we recombinante virussen met meerdere genetische modificaties wilden genereren met behulp van een selectiemethode die herhaaldelijk en universeel kon worden toegepast, ongeacht de tag. Hoewel het principe van transiënte dominante selectie eerder is beschreven, wilden we dit op grotere schaal en op modulaire wijze toepassen om meer flexibiliteit te verkrijgen bij het aanbrengen van genomische modificaties. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de screening en isolatie van recombinante virale plaques complex kunnen zijn. De frequentie hiervan kan laag zijn, waardoor specifieke methoden nodig zijn voor een efficiënt herstel van het virus.Label het virale gen van belang aan de N- of C-terminus van het eiwit. Identificeer dienovereenkomstig flankerende homologieregio's van 150 basenparen lang. Ontwerp vervolgens een oligonucleotide-sequentie bestaande uit de linker- en rechterarmen van 150 basenparen, gescheiden door een paar restrictieplaatsen naar keuze. Flankeer deze regio tevens met een tweede paar restrictieplaatsen die verschillen van het eerste paar, om inbouw in de TDS-vector na synthese mogelijk te maken. Verifieer nu of het oligonucleotide met de restrictieplaatsen zo is ontworpen dat het in frame is met de gewenste insertieplaats. Zorg bij de oligonucleotidesynthese dat de restrictieplaatsen die tussen de linker- en rechterarmen zijn ingebouwd, overeenkomen met de plaatsen die het open leesraam van de gekozen fluorescentietag flankeren. Voeg dezezelfde restrictieplaatsen aan weerszijden van de fluorescentietag toe via PCR. Clone het gesynthetiseerde fragment in de TDS-vector. Clone tevens de fluorescentietag in de resulterende recombinatievector met behulp van de restrictieplaatsen tussen de linker- en rechterarmen van de homologieregio's. Infecteer een monolaag BS-C-one-cellen met vacciniavirus in serumvrij medium.Eén uur na infectie worden de cellen gered met Dulbecco's modified eagle medium. Transfecteer met een mengsel van recombinatievector-plasmide en transfectiereagentia in een verhouding van drie op één in serumvrij medium. Na 24 uur worden de cellen afgeschraapt en hersteld in DMEM zonder foetaal runderserum. Onderwerp de cellen aan drie vries-dooi-cycli om de cellen open te breken en de viruspartikels vrij te laten. Om vervolgens een adequate scheiding van individuele plaques te verkrijgen, worden 100% confluente cellagen van BS-C-1-cellen geïnfecteerd met seriële verdunningen van de preparatie van viruspartikels. Bedek dit met een overlay van vloeibaar 10% FBS en DMEM plus de GPT-selectiereagentia en incubeer gedurende 24 uur.Zuig de vloeibare overlay af en gebruik een fluorescentiemicroscoop om te zoeken naar plaques die diffuse rode fluorescentie vertonen, wat overeenkomt met de incorporatie van M-cherry van de TDS-vector in het virus. Afhankelijk van het doelgen en de gekozen fluorescentietag kan er in dezelfde rode plaque ook gelokaliseerde fluorescentie van het tag-gen worden waargenomen.Select nu meerdere plaques voor elk recombinant virus, schraap deze met de pipetpunt en breng de cellen over naar een Eppendorf-buis met 100 µL DMEM bevattend 5% FBS. Voer drie vries-dooi-cycli uit met de afgeschraapte cellen om de recombinante virussen vrij te maken.Voeg het DMEM met het ontdooide virus toe aan een monolaag cellen in een plaat met 12 putjes om de recombinante virussen te amplificeren met GPT-selectiereagentia in het groeimedium. Schraap vervolgens de succesvolle amplificaties 24 uur na infectie af. Zaai voor een plaque-assay van succesvol geamplificeerde plaques, die rode fluorescentie vertonen, een plaat met zes putjes met een monolaag BS-C-one cellen.Voer een seriële verdunning van de recombinante virussen uit en infecteer de wells met een toenemende verdunning van de virussen in FBS-vrij DMEM. Verwijder 1 uur na infectie het vloeibare medium en bedek elke well met 0,5% agarose in compleet minimal essential medium. Selecteer drie dagen na infectie de plaques die zowel rode fluorescentie als de kleur van de gekozen fluorescentie-tag vertonen.Amplificeer deze opnieuw zonder GPT-selectie. Selecteer plaques die hun diffuse rode fluorescentie hebben verloren, maar de gelokaliseerde fluorescentie behouden die overeenkomt met de gekozen tag. Zet de plaque-zuivering voort zonder selectie om een zuivere voorraad recombinante virussen te verkrijgen die de M-cherry- en GPT-selectiegenen hebben verloren, maar de gelokaliseerde fluorescentie behouden die overeenkomt met de gekozen tag.Evalueer de zuiverheid van de voorraden met een plaque-assay, waarbij wordt gestreefd naar plaques met een vergelijkbaar plaquefenotype. Amplificeer de testvirale voorraden in een monolaag van BS-C-one cellen. Schraap de geïnfecteerde cellen 24 uur na infectie in 250 µL DMEM. Centrifugeer de geïnfecteerde cellen, verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 500 µL 0,1% SDS in TE-buffer. Vortex om de cellen te lyseren. Voeg vervolgens 500 µL fenol, chloroform en isoamylalcohol toe en keer het buisje om om te mengen. Centrifugeer. Oogst de bovenfase en herhaal de extractie.Voeg vervolgens één milliliter gekoelde, 100% ethanol en 50 µL natriumacetaat toe om het DNA uit de waterige laag te precipiteren. Meng door inversie en bewaar het monster gedurende de nacht bij -20 °C. Nadat het DNA door centrifugatie is gepelletteerd, wordt alle vloeistof verwijderd, wordt de DNA-pellet aan de lucht gedroogd en wordt deze opnieuw gesuspendeerd in 50 µL TE-buffer. Gebruik dit genomische DNA-template voor PCR-screening op virale insertie. Genereer recombinante virussen met meerdere tags zoals gedetailleerd in het tekstprotocol.Deze recombinante vacciniavirussen brengen eiwitten tot expressie die zijn gelabeld met fluorescentiemarkers gericht op virale structurele eiwitten, A3 en F13, die respectievelijk deel uitmaken van de binnenste viruskern en de buitenste envelop. Genen die corresponderen met virion-gelokaliseerde eiwitten werden geselecteerd om viruspartikels te visualiseren. A3 is een kerneiwit van het vacciniavirion en F13 is een viraal envelopeiwit.Ook een dubbel gelabeld virus met zowel fluorescentielabel A3 als F13 wordt getoond. Realtime fluorescentiemicroscopie kan worden uitgevoerd met een dubbel gelabeld virus. In dit geval gaat het om het innerlijke kerneiwit van het vacciniavirus. A3 is rood gelabeld en het buitenste envelop-eiwit F13 is groen gelabeld.Onomhulde virusdeeltjes uit de virusfabriek zijn in het rood gevisualiseerd en omhulde virionen worden weergegeven door colocalisatie van de rode en groene kanalen. Kwantitatieve analyse werd gebruikt om de recombinatie-efficiënties tussen recombinante vectoren en het genoom van het vacciniavirus te bepalen. De efficiëntie van homologe recombinatie van vectoren met het genoom van het vacciniavirus kan worden gedetecteerd met homologieregio's van slechts 70 baseparen.Deze methode is gebruikt om virussen te creëren met meerdere fluorescerende markers en/of meerdere gen-deleties. Deze zijn ingezet bij de studie naar de infectieuze levenscyclus van het virus, de rol van virale eiwitten bij het ondermijnen van de afweersystemen van de gastheer, en interacties met signaleringsprocessen van de gastheer. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het genereren van recombinante vacciniavirussen met behulp van een methode die modulair is in de gebruikte markers, nauwkeurig is in het isoleren van de gewenste recombinanten en toepasbaar is in diverse onderzoekcontexten.

methodology-for-efficient-generation-fluorescently-tagged-vaccinia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Werkwijze voor het traceren van synaptisch verbonden neuronen beschreven. We maken gebruik van TVA specificiteit van een upstream cel te peilen of een cel populatie van belang synaptische input van genetische gedefinieerde celtypes ontvangt.

Virale Tracing van genetische gedefinieerde neurale circuits

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the expansion of plaque-derived recombinant virus in adherent mammalian cells. The virus carries a fluorescent reporter in place of a virulent gene, enabling infection tracking. Infected cells are harvested for PCR verification of the genetic modification.

Expansion of Mutant Vaccinia Virus in Mammalian Cells

Bron: Rozelle, D. K., et al. Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression. J. Vis. Exp. (2014)Deze video demonstreert een methode om de replicatie van het vacciniavirus te monitoren met behulp van fluorescente reporters die gereguleerd worden door fase-specifieke promotors. Sequentiële expressie van groene, rode en blauwe fluorescente eiwitten markeert de vroege, intermediaire en late fasen van de infectie, wat high-throughput analyse van...

Monitoring van stadiumspecifieke genexpressie in het vacciniavirus met behulp van fluorescente reporters

Bron: Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019)Deze video demonstreert de generatie van recombinante mazelvirussen met behulp van liposomen om plasmiden die het virale antigenoom en essentiële helper-eiwitten coderen, af te leveren in producentencellen. Het getranscribeerde en gerepliceerde RNA leidt tot de vorming van virale partikels die immunostimulerende en fluorescerende reporter-eiwitten tot...

Generatie van een recombinant mazelenvirus dat een immunostimulerend eiwit codeert

Bron: Marzook, N. B., et al., Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins. J. Vis. Exp. (2014)Deze video demonstreert de generatie van recombinante vacciniavirussen middels plasmide-gemedieerde homologe recombinatie in geïnfecteerde epitheelcellen. Fluorescente en metabole markers maken de selectie en identificatie mogelijk van virussen die getagde eiwitten tot expressie brengen.

Identificatie van met recombinant vacciniavirus geïnfecteerde cellen middels metabole en fluorescente selectie

We beschrijven het gebruik van een fluorescerende reporter koepokkenvirus die real-time meting van de virale besmettelijkheid en genexpressie in staat stelt door middel van het podium-specifieke expressie van spectraal verschillende reporter fluoroforen. We detail een plaat gebaseerde methode voor het nauwkeurig vaststellen van de fase waarin het virus replicatie wordt beïnvloed in reactie op kleine molecule remming.

Vaccinia Reporter Virussen voor kwantificeren Viral Functie in alle stadia van genexpressie

Hier presenteren we een protocol voor het synthetiseren van virusachtige deeltjes met behulp van baculovirus of zoogdierlijke expressiesystemen en ultracentrifugatie zuivering. Deze zeer flexibele aanpak wordt gebruikt om virale antigenen vaccin taakstellingen op veilige en soepele wijze.

Expressie en zuivering van virusachtige deeltjes voor vaccinatie

Vacciniavirus (VV) is op grote schaal gebruikt in biomedisch onderzoek en de verbetering van de volksgezondheid. Dit artikel beschrijft een eenvoudige, zeer efficiënte methode om de VV genoom bewerken met een CRISPR-Cas9 systeem.

Een eenvoudige en efficiënte aanpak Mutant Vaccinia Virus vectoren Construct

Herpesvirus van kalkoenen (HVT) wordt veel gebruikt als een vector-platform voor de generatie van recombinante vaccins tegen een aantal aviaire ziekten. Dit artikel beschrijft een eenvoudige en snelle aanpak voor de generatie van recombinante HVT-vectored vaccins met behulp van een geïntegreerde NHEJ-CRISPR/Cas9 en de Cre-Lox systeem.

Genereren van recombinante aviaire Herpesvirus vectoren met CRISPR/Cas9 Gene bewerken

Dit is een methode om "scarless" recombinant vaccinia virussen te genereren met behulp van host-range selectie en visuele identificatie van recombinante virussen.

Snelle, naadloze generatie recombinante poxvirussen met behulp van Host Range en Visuele Selectie

Leer een modulaire methode voor het genereren van fluorescerend gelabelde recombinante vacciniavirussen met behulp van tijdelijke dominante selectie. Dit protocol vereenvoudigt genetische modificaties en verbetert de efficiëntie van virale plaque-isolatie voor virologisch onderzoek.

Methodologie voor de efficiënte generatie van fluorescerend gelabeld Vaccinia Virus Eiwitten

Meer video's verkennen