Name: Initiatie van gemetastaseerd borstcarcinoom door Targeting van de Ductaal Epitheel met adenovirus-Cre: A Novel transgeen muismodel van de Breast Cancer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Leer hoe je een muismodel van borstkanker ontwikkelt met adenovirus-Cre in het ductale epitheel. Deze methode maakt het mogelijk om metastase en tumor-immuniteit te bestuderen met behoud van een gezond immuunsysteem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door NCI Subsidies RO1CA157664 en RO1CA124515, en een Breast Cancer Alliance award. We willen graag Jeffrey Faust, David Ambrose, en Scott Weiss bedanken van de Wistar flowcytometrie kernfaciliteit, James Hayden van de Wistar Imaging faciliteit, en het voltallige personeel van het Instituut Wistar Animal Facility voor hun waardevolle technische ondersteuning.

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite Wistar Institute. 1. Generatie en onderhoud van transgene muizen <ol><li> Ras LSL-K-ras tm4Tyj 26 en Trp53 tm1Brn 27 (verkregen van NCI muismodellen van kanker bij de mens consortium op een gemengde achtergrond) om een volledige C57BL / 6 achtergrond 28 door terugkruisen minstens 10 generaties met C57BL / 6 muizen. Op te sporen tumor metastase, ras B6.129X1-Gt (ROSA) 26Sor TM1 (EYFP) Cos / J (LSL-EYFP, verkregen uit het Laboratorium van Jackson op een volle C57BL / 6 achtergrond) met dubbel transgene LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP muizen. Opmerking: Transgene LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP muizen loxP plaatsen flankeren een transcriptioneel zwijgen allel van oncogene K-ras en endogene p53 locus, zodat na Cre gemedieerde excisie, overexpressie van een oncogene K-ras mutant en ablatie van p53 achiEved. Opmerking: De LSL-EYFP muis bevat een stopcodon flankeren een gen voor versterkt geel fluorescerend eiwit (YFP) dat bij Cre-gemedieerde excisie resulteert in de expressie van YFP in de weefsels waar de YFP stop cassette uitgesneden. <ol><li> Breed transgene muizen om LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP muizen of LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP LSL-EYFP muizen voor intraductale injecties krijgen. Opmerking: Muizen worden gefokt als homozygoot voor p53 loxP / loxP en heterozygoot voor LSL-K-ras G12D / + omdat muizen met een homozygote deletie van K-ras sterven in de baarmoeder. Gebruik naïef maagdelijke vrouwtjes ten minste zes weken oud voor intraductale injecties. Opmerking: De primers voor genotypering floxed homozygote p53 allel p53 - T010-DSN (5&#39;-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3 &#39;) en p53-T011-rev (5&#39;-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3&#39;). Ze produceren een wild-type allel op 391 bp en de p53 floxed allel op 461 bp 29,30. Opmerking: De primers voor de mutante vorm van K-ras detecteren zijn oIMR8273 (5&#39;-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3 &#39;) en oIMR8274 (5&#39;-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3&#39;). Ze produceren de mutant band ontdekt op 600bp. Opmerking: Voor YFP reporter drievoudige transgene muizen, de primers voor het detecteren ROSA cassette (5&#39;-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3 &#39;), het wildtype allel (5&#39;-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3&#39;) en een gemeenschappelijke allel (5&#39;-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT -3 &#39;) resulteren in de versterking van de banden bij 320 bp voor floxed allel en 600 bp voor het wild type allel. </li></ol></li></ol> 2. Chirurgische Voorbereiding <ol><li> Schone chirurgische materialen met 75% EtOH en autoclaaf hen voor en na alle injecties. </li><li> Voer een operatie aan een schoon opgeruimd laboratorium bank in een gesaneerde ruimte binnen een dier faciliteit. Veeg alle oppervlakken van de fase en wijzerplaten van de chirurgische microscoop met een breed-spectrum desinfecterende oplossing, gevolgd door 75% EtOH. </li><li> Weeg en verdoven muizen door intraperitoneale injectie van een mengsel van ketamine (80-100 mg / kg) en xylazine (8-10 mg / kg) in steriele zoutoplossing. </li><li> Plaats voorzichtig muizen terug in hun kooien ongestoord gedurende 5 minuten terwijl ze gaan onder verdoving. Gedurende deze tijd genereren virus neerslagen (zie Protocol nr. 3). </li><li> Controleer gebrek aan reactie op pijn door teen knijpen. Zachtjes de ogen te bedekken van verdoofde muizen met veterinaire zalf aan overmatige hoornvlies uitdroging te voorkomen. </li><li> Om onderkoeling te voorkomen, plaatst verdoofde muizen op een verwarming pad ingesteld op laag vuur tijdens de chirurgische procedure en totdat ze beginnen te herstellen. </li><li> Voor het beheer van pijn toedienen muizen subcutaan meloxicam 1 mg / kg voor de operatie en 24 uur na. </li></ol> 3. Generatie virus Neerslagen LET OP: Adenovirusvectoren, hoewel zij werden aangepast en zijn niet in staat om te repliceren, houden een risico opinfectie. Handvat adenovirus met de nodige voorzichtigheid. Alle personeelsleden moeten naar behoren worden opgeleid volgens de richtlijnen van de instelling voor de omgang BSL2 stoffen Na intraductale injectie, gooi adenovirus volgens BSL2 richtlijnen. <ol><li> WINKEL adenovirus geconcentreerd virus voorraden bij -80 ° C in porties van 4 x 10 8 pfu elk voldoende bevroren voor het injecteren 16 van dieren met 3 ml 2,5 x 10 7 pfu van adenovirus deeltjes. </li><li> Slaan adenovirus monsters op droog ijs tot ongeveer 15-20 minuten voor het begin van de injecties. Opmerking: Vermijd herhaalde vries dooi cycli, zoals virus titer daalt aanzienlijk tussen elke cyclus. Opmerking: Adenovirus neerslagen worden gevormd door het wijzigen van een protocol eerder beschreven 31. </li><li> Reconstitueer 504 mg MEM poeder met 50 ml steriel water moleculaire klasse, supplement met 244 mg natriumbicarbonaat en filter in steriele omstandigheden en bewaar bij 4 ° C. <ol> &lt;li&gt; Bereid de calciumchlorideoplossing door het toevoegen van 1,5 g calciumchloride 50 ml moleculaire kwaliteit water en filter in steriele omstandigheden en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Meng monsters met 4 x 10 8 pfu adenovirus-Cre voldoende 3% sucrose in steriel water om een eindvolume van 10 ml. Voeg 34 ml MEM met het virus en meng. Voeg vervolgens 4 ml van de CaCl2-oplossing, meng en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15-20 minuten. </li><li> Store adenovirus op droog ijs tot klaar om neerslagen te vormen. Vermijd ontdooien van het adenovirus en opslaan op ijs of bij kamertemperatuur gedurende langere tijd, tenzij precipitaten gevormd. Opmerking: Het is ook mogelijk de sucrose, MEM en CaCl2 vóór de operaties mengen als het niet mogelijk is de hoeveelheid adenovirus ontdooien en beginnen maken precipiteert onmiddellijk na verwijdering van -80 ° C. Deze hoeveelheid sucrose, MEM, en calcium kunnen worden opgeslagen op droog ijs pas klaar voor het adenovirus voegen. Opmerking: Virus deeltjes stabiel gedurende ongeveer 1 uur. </li><li> Voorafgaand aan elke injectie, tik zachtjes tegen de buis om ervoor te zorgen virusdeeltjes worden gemengd. Opstellen van 3 ml (2,5 x 10 7 pfu) virusdeeltjes in de spuit 10 ml en voorbereiden van de muis voor de intraductale injectie. </li></ol></li></ol> 4. Intraductale Injectie van virusdeeltjes <ol><li> Plaats voorzichtig de muis op zijn rug op het verlichte podium van een schone dissectie microscoop. Verlichten de buik kant met een extra lichtbron en zoek links 4 e of rechts 9 e inguinale borstklier door de kleine witte vlekken van bont (zichtbaar op C57BL / 6 vrouwtjes) rond elke tepel. </li><li> Wrijf de nippel voorzichtig met een steriele ethanol gedrenkt wattenstaafje om haar uit de buurt van de tepel te wissen en om de injectieplaats te steriliseren. Als ze moeilijk te vinden, zachtjes breng dan een dikke laag van een ontharingscrème of het gebruik schaar om de tepels bloot. </li&gt; <li> Verwijder de keratine plug, een laag van dichte dode huidcellen, die over de tepel. Zodra de tepel wordt blootgesteld, moet de keratine stekker gemakkelijk zichtbaar zijn onder de microscoop dissectie. </li><li> Beveilig de tepel met fijne chirurgische pincet en trek met lichte kracht om de keratine stekker verwijderen. </li><li> Stabiliseren van de tepel tussen de tang. </li><li> Duw de naald tussen de tang, cannulating het kanaal kanaal bij 90 °. Voer de nippel iets voorbij de schuine kant van de naald (niet meer dan 2 mm) om de penetratie te voorkomen door het borstweefsel en in de sereuze membranen van de ventrale lichaamsholte. <ol><li> Steek de naald te diep. Voor een goede diepte van de injectie te garanderen, trek de naald omhoog na het insteken in het lumen van het kanaal, het tekenen van de tepel langs de randen van de naald als het wordt opgetrokken. Opmerking: Visualisatie van de injectie is moeilijk, daarom practice voor deze stap wordt aanbevolen volgens trypanblauw. </li></ol></li><li> Als de naald op de juiste wijze is geplaatst in de borstklier kanaal, laat de 3 ml virus neerslagen (2,5 x 10 7 pve adenovirus-Cre) door voorzichtig kelderen de spuit met de duim van de hand die de spuit. De tepel dient iets opgeblazen als de vloeistof wordt toegevoegd. </li></ol> 5. Herstel van Muizen <ol><li> Plaats de muis weer op het verwarmingselement na de injectie totdat het begint te herstellen van de anesthesie. </li><li> Zodra de muis wordt teruggewonnen, plaats het terug in een schone kooi en monitor voor volledig herstel en beweging. </li><li> 24 uur na de intraductale injectie, subcutaan meloxicam 1 mg / kg. </li></ol> 6. Monitoring tumorprogressie <ol><li> Palpeer de geïnjecteerde borstklier op dag 30 voor de uitbreiding en zwelling. <ol><li> Monitor tumorprogressie elke 5-7 dagen een keer een gezwollen en vergrote borstklieren gland wordt waargenomen. </li></ol></li><li> Meet tumorvolumina om de 3-4 dagen voor tumorgroei kinetiek eenmaal voelbare tumoren verschijnen (ongeveer 50-60 dagen na adenovirale injectie). </li><li> Euthanaseren muizen, indien tumorvolumes bedraagt ​​dan 10% van het lichaamsgewicht van de muizen. </li></ol>

<ol><li>Youlden, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+descriptive+epidemiology+of+female+breast+cancer%3A+an+international+comparison+of+screening%2C+incidence%2C+survival+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">The descriptive epidemiology of female breast cancer: an international comparison of screening, incidence, survival and mortality.</a> Cancer Epidemiol. 36, 237-248 (2012).</li>
<li>Siegel, R., Naishadham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2012.</a> Cancer J. Clin. 62, 10-29 (2012).</li>
<li>Sorlie, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+patterns+of+breast+carcinomas+distinguish+tumor+subclasses+with+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10869-10874 (2001).</li>
<li>Gatza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway-based+classification+of+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A pathway-based classification of human breast cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6994-6999 (2010).</li>
<li>Bastien, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAM50+breast+cancer+subtyping+by+RT-qPCR+and+concordance+with+standard+clinical+molecular+markers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genom%22%5BJournal%5D)">PAM50 breast cancer subtyping by RT-qPCR and concordance with standard clinical molecular markers.</a> BMC Med. Genom. 5, 44(2012).</li>
<li>Montagna, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+triple-negative+breast+cancer%3A+histologic+subtyping+to+inform+the+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Breast+Cancer%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of triple-negative breast cancer: histologic subtyping to inform the outcome.</a> Clin. Breast Cancer. 13, 31-39 (2013).</li>
<li>Karrison, T. G., Ferguson, D. J., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dormancy+of+mammary+carcinoma+after+mastectomy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Dormancy of mammary carcinoma after mastectomy.</a> J. Natl. Cancer Inst. 91, 80-85 (1999).</li>
<li>Rakha, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prognostic+significance+of+lymphovascular+invasion+in+invasive+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">The prognostic significance of lymphovascular invasion in invasive breast carcinoma.</a> Cancer. 118, 3670-3680 (2012).</li>
<li>Kim, I., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 394, 443-447 (2010).</li>
<li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+breast+cancer%3A+one+size+does+not+fit+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nat. Cancer. 7, 659-672 (2007).</li>
<li>Archer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+hormone+receptor+status+defines+the+MMTV+promoter+chromatin+structure+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Steroid hormone receptor status defines the MMTV promoter chromatin structure in vivo.</a> J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 53, 421-429 (1995).</li>
<li>Cato, A., Henderson, D., Ponta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hormone+response+element+of+the+mouse+mammary+tumour+virus+DNA+mediates+the+progestin+and+androgen+induction+of+transcription+in+the+proviral+long+terminal+repeat+region%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The hormone response element of the mouse mammary tumour virus DNA mediates the progestin and androgen induction of transcription in the proviral long terminal repeat region.</a> EMBO J. 6, 363-368 (1987).</li>
<li>Schoenenberger, C., Zuk, A., Groner, B., Jones, W., Andres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+endogenous+whey+acidic+protein+%28Wap%29+gene+and+a+Wap-myc+hybrid+gene+in+primary+murine+mammary+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of the endogenous whey acidic protein (Wap) gene and a Wap-myc hybrid gene in primary murine mammary organoids.</a> Dev. Biol. , 327-337 (1990).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+Pten+accelerates+mammary+oncogenesis+in+MMTV-Wnt-1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Deficiency of Pten accelerates mammary oncogenesis in MMTV-Wnt-1 transgenic mice.</a> BMC Mol. Biol. 2, 2(2001).</li>
<li>Martelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+lymph+node+migration+of+MNP-+and+%28111%29In-labeled+dendritic+cells+in+a+transgenic+mouse+model+of+breast+cancer+%28MMTV-Ras%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of lymph node migration of MNP- and (111)In-labeled dendritic cells in a transgenic mouse model of breast cancer (MMTV-Ras).</a> Mol. Imaging Biol. 14, 183-196 (2012).</li>
<li>Klover, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+STAT1+from+mouse+mammary+epithelium+results+in+an+increased+Neu-induced+tumor+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Loss of STAT1 from mouse mammary epithelium results in an increased Neu-induced tumor burden.</a> Neoplasia. 12, 899-905 (2010).</li>
<li>Moody, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+activation+of+Neu+in+the+mammary+epithelium+of+transgenic+mice+results+in+reversible+pulmonary+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Conditional activation of Neu in the mammary epithelium of transgenic mice results in reversible pulmonary metastasis.</a> Cancer Cell. 2, 451-461 (2002).</li>
<li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+analysis+of+mutations+and+translocations+across+breast+cancer+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sequence analysis of mutations and translocations across breast cancer subtypes.</a> Nature. 486, 405-409 (2012).</li>
<li>Miyakis, S., Sourvinos, G., Spandidos, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+and+mutation+of+the+ras+family+genes+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Differential expression and mutation of the ras family genes in human breast cancer.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 251, 609-612 (1998).</li>
<li>Malaney, S., Daly, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ras+signaling+pathway+in+mammary+tumorigenesis+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mammary+Gland+Biol.+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">The ras signaling pathway in mammary tumorigenesis and metastasis.</a> J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 6, 101-113 (2001).</li>
<li>Loboda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+signature+of+RAS+pathway+dependence+predicts+response+to+PI3K+and+RAS+pathway+inhibitors+and+expands+the+population+of+RAS+pathway+activated+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A gene expression signature of RAS pathway dependence predicts response to PI3K and RAS pathway inhibitors and expands the population of RAS pathway activated tumors.</a> BMC Med. Genomics. 3, 26(2010).</li>
<li>von Lintig, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+activation+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Ras activation in human breast cancer.</a> Breast Cancer Res. Treat. 62, 51-62 (2000).</li>
<li>Downward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+RAS+signalling+pathways+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 11-22 (2003).</li>
<li>Eckert, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Ras+activation+in+human+breast+cancer+cell+signaling%2C+invasion%2C+and+anoikis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of Ras activation in human breast cancer cell signaling, invasion, and anoikis.</a> Cancer Res. 64, 4585-4592 (2004).</li>
<li>Hollestelle, A., Elstrodt, F., Nagel, J., Kallemeijn, W., Schutte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-3-OH+kinase+or+RAS+pathway+mutations+in+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-3-OH kinase or RAS pathway mutations in human breast cancer cell lines.</a> Mol. Cancer Res. 5, 195-201 (2007).</li>
<li>Jackson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+lung+tumor+initiation+and+progression+using+conditional+expression+of+oncogenic+K-ras%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras.</a> Genes Dev. 15, 3243-3248 (2001).</li>
<li>Jonkers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+tumor+suppressor+activity+of+BRCA2+and+p53+in+a+conditional+mouse+model+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer.</a> Nat. Genet. 29, 418-425 (2001).</li>
<li>Scarlett, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+progression+is+controlled+by+phenotypic+changes+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer progression is controlled by phenotypic changes in dendritic cells.</a> Exp. Med. 209, 495-506 (2012).</li>
<li>Vooijs, M., Jonkers, J., Berns, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+ligand-regulated+Cre+recombinase+mouse+line+shows+that+LoxP+recombination+is+position+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">A highly efficient ligand-regulated Cre recombinase mouse line shows that LoxP recombination is position dependent.</a> EMBO Rep. 2, 292-297 (2001).</li>
<li>Young, N., Crowley, D., Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+cancer+mutations+reveals+critical+timing+of+p53+loss+in+sarcomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Uncoupling cancer mutations reveals critical timing of p53 loss in sarcomagenesis.</a> Cancer Res. 71, 4040-4047 (2011).</li>
<li>Dinulescu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+K-ras+and+Pten+in+the+development+of+mouse+models+of+endometriosis+and+endometrioid+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Role of K-ras and Pten in the development of mouse models of endometriosis and endometrioid ovarian cancer.</a> Nat. Med. 11, 63-70 (2005).</li>
<li>Landua, J., Visbal, A., Lewis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+preparing+fluorescent+and+neutral+red-stained+whole+mounts+of+mouse+mammary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mammary+Gland+Biol.+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Methods for preparing fluorescent and neutral red-stained whole mounts of mouse mammary glands.</a> J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14, 411-415 (2009).</li>
<li>Barham, W., Sherrill, T., Connelly, L., Blackwell, T. S., Yull, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraductal+injection+of+LPS+as+a+mouse+model+of+mastitis%3A+signaling+visualized+via+an+NF-kappaB+reporter+transgenic%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraductal injection of LPS as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an NF-kappaB reporter transgenic.</a> J. Vis. Exp. , e4030(2012).</li>
<li>Murata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ductal+access+for+prevention+and+therapy+of+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors.</a> Cancer Res. 66, 638-645 (2006).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Het succes van deze procedure hangt af van de juiste techniek tijdens intraductal injecties, die moeilijk voor ongeoefende onderzoekers zullen zijn. Ervaren onderzoekers in ons laboratorium meestal verkrijgen borsttumor massa&#39;s 79% van de keren dat ze toedienen adenovirale injecties. Problemen met de injectie kan resulteren in aanzienlijk vertraagd, variabele of afwezig tumorontwikkeling. Als de naald te diep of op een ongeschikt hoek wordt geplaatst, kan de ductale kanaal worden gemist. Het is belangrijk om de tepel voeren iets voorbij de schuine kant van de naald (niet meer dan 2 mm), penetratie te voorkomen door het borstweefsel en in de sereuze membranen van de ventrale lichaamsholte. Ook kan te ondiep plaatsing van de naald of de injectie van meer dan 3 ml virus precipitaten leiden gemorst virale prep buiten de borstklier en de inductie van onbedoelde tumoren. Een manier om deze problemen te overwinnen is om de naald in de tepel lichtjes deeper dan 3 mm, en langzaam trek de spuit terug uit het kanaal tot 2 mm van het uiteinde van de schuine kant. Hierdoor zullen borstweefsel is gericht in plaats van de spieren rond de peritoneale holte van muizen (figuur 1A). Dit zal ook de tepel uitstrekken langs de randen van de spuit zodat wanneer het virus wordt uitgestoten in het kanaal, is er geen morsen en het virus-precipitaten. Visualisatie van de injectie is moeilijk en praktijk deze stap wordt aanbevolen. We hebben een toename succesvolle injectie waargenomen na praktijk resulteert in een hogere penetratie van tumorontwikkeling. Omdat deze techniek maakt gebruik nonlactating maagdelijke vrouwtjes, is het essentieel om de keratine stekker die de tepel aan de onderliggende kanaal kanaal onthullen verwijderen. Wij raden aan het beoefenen van deze stap door het injecteren trypaanblauw of een andere steriele traceerbaar kleurstof binnenkant van het kanaal en het voorbereiden van hele borstklier mounts te bevestigen targeting van de ductale tree. Daarnaast zijn andere protocols beschreven intraductal injectie van reagentia gepubliceerd 33,34, die nuttig zijn voor de ontwikkeling van geschikte techniek kan worden. Problemen met virale preparaat of infectie van het ductale lumen kan worden onderzocht door een mCherry expressie adenovirus. Transgene muizen kunnen worden gebruikt voor elk van deze doeleinden tot Injecteer geoptimaliseerd. Hoewel elk uier kan worden gebruikt om tumoren te leiden, hebben we doelwit borstklier 4 of 9, waarvan wij geloven dat omdat het gemakkelijker is om goede injecties uitvoeren van deze klieren, resulteert in een efficiëntere targeting van de meest consistente groei gerealiseerd duct. De nabijheid van de linker 4e of rechts 9e lies borstklieren wegvloeien inguinale lymfeklier is ook nuttig om anti-tumor immuunreacties in verschillende temporele betrekking tot tumorprogressie te onderzoeken. Te modelleren en te volgen latente metastase naar distale plaatsen, transgenic muizen werden gekruist met LSL-EYFP muizen. Als de tumor vordert, zal de tumor vasculatuur verbinden de axillaire lymfeklieren enigszins gezwollen ongeveer 5 weken worden, voordat de tumor begint exponentieel groeien (Figuur 3A). Uiteindelijk, na 7-8 weken, lymfovasculaire invasie leiden tot tumorgroei in de axillaire lymfeklieren (Figuren 3A en 3B). Met behulp van reporter muizen en Cre-loxP technologie, integratie van YFP creëert een platform om tumorcellen uitzaaiingen naar distale plaatsen door progressie van de tumor te volgen. Dit kan studies gericht op het ophelderen van de cellulaire en epigenetische mechanismen die latent metastase bevorderen vergemakkelijken. In onze handen, borsttumorcellijnen expressie cytokeratine-8, mesothelin, oestrogeen receptor-α en Her2/neu bevestigt gerichtheid van de ductale epitheel. Echter, afhankelijk van de geïnduceerde mutaties en door de moeilijkheid en de variabiliteit van injecties, aanbevolenhistologische karakterisering van tumoren wanneer het model is goed ingeburgerd in het laboratorium. Omdat borstkanker dergelijke dodelijke ziekte en doordringende 1,2, is het belangrijk te diermodellen die nauwkeurig recapituleren de complexe wisselwerking tussen tumor en gastheer gebruiken. Hier beschrijven we een volledig teruggekruist C57BL / 6 muizen model van borstkanker. Eerste, door het induceren van tumoren van inheemse cellen, zodat we de tumor op een natuurlijke manier evolueren in een volledige immuun micromilieu. Het immuunsysteem micromilieu in de geavanceerde muis borsttumoren recapituleert de populaties van αβ en γδ T-cellen, myeloide suppressor cellen en macrofagen vaak waargenomen in humane borstkanker (Figuur 4). Zoals we eerder hebben gepubliceerd met behulp van adenovirus-Cre ovariële tumoren te induceren, vonden we dat de virale injectie had een verwaarloosbaar effect op de betreffende tumor infiltreert en tumorprogressie 28. Ten tweede, endocriene onafhankelijkeexpressie van oncogenen zorgt tumorcellen aanhoudend hoge niveaus van expressie van het doelwitgen. Ten derde, door gebruik te maken van latente mutaties, kunnen we de timing van tumorigenese controle om nauwkeurige tijd bijhouden tumor ontwikkeling vergemakkelijken. Toepassingen van dit model omvatten onderzoek op tumorcel biologie, studies van factoren in de tumor micro-omgeving, anti-tumor immuunrespons en zelfs werkzaamheid evaluatie van nieuwe therapeutica. Door de beschikbaarheid van het Cre-loxP systeem, kan deze techniek worden gebruikt als een platform voor het onderzoeken van een uiteenlopende reeks van aanvullende mutaties in de ontwikkeling en progressie van borsttumoren. We hopen dat het gebruik van dit model het begrip van borstkanker biologie zal verbeteren en uiteindelijk leiden tot nieuwe therapieën gericht op het behandelen van metastatische borstkanker.

A correction was made to <a href="/video/51171">Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer</a>. Protocol sections 3.1, 3.3.2, 3.4, and 4.7 were updated. The materials table was also updated.
Protocol section 3.1 was updated from:
3.1) Store adenovirus concentrated virus stocks at -80&#176;C frozen in aliquots of 4 x 108 pfu each, sufficient for injecting 16 animals with 3 ml of 2.5 x 107 pfu of adenovirus particles.
to:
3.1) Store adenovirus concentrated virus stocks at -80&#176;C frozen in aliquots of 4 x 108 pfu each, sufficient for injecting 16 animals with 3 &#181;l of 2.5 x 107 pfu of adenovirus particles.
Protocol section 3.3.2 was updated from:
Mix aliquots containing 4 x 108 pfu adenovirus-Cre with sufficient 3% sucrose in sterile water for a final volume of 10 ml. Add 34 ml of MEM to the virus and gently mix. Then add 4 ml of the CaCl2 solution, gently mix, and incubate at room temperature for 15-20 min.
to:
Mix aliquots containing 4 x 108 pfu adenovirus-Cre with sufficient 3% sucrose in sterile water for a final volume of 10 &#181;l. Add 34 &#181;l of MEM to the virus and gently mix. Then add 4 &#181;l of the CaCl2 solution, gently mix, and incubate at room temperature for 15-20 min.
Protocol section 3.4 was updated from:
Prior to each injection, gently flick the tube to make sure virus particles are mixed. Draw up 3 ml (2.5 x 107 pfu) of virus particles into the 10 ml syringe and prepare the mouse for the intraductal injection.
to:
Prior to each injection, gently flick the tube to make sure virus particles are mixed. Draw up 3 &#181;l (2.5 x 107 pfu) of virus particles into the 10 &#181;l syringe and prepare the mouse for the intraductal injection.
Protocol section 4.7 was updated from:
When the needle is appropriately placed into the mammary duct, release the 3 ml of virus precipitates (2.5 x 107 pfu of adenovirus-Cre) by gently plunging the syringe with the thumb of the hand holding the syringe. The nipple should slightly inflate as the liquid is added.
to:
When the needle is appropriately placed into the mammary duct, release the 3 &#181;l of virus precipitates (2.5 x 107 pfu of adenovirus-Cre) by gently plunging the syringe with the thumb of the hand holding the syringe. The nipple should slightly inflate as the liquid is added.
Item 15 in the Materials table under Comments was updated from:
10ml syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
to:
10&#181;l syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.

A correction was made to <a href="/video/51171">Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer</a>. Protocol sections 3.1, 3.3.2, 3.4, and 4.7 were updated. The materials table was also updated.

Erratum: Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Borstkanker is de meest voorkomende maligniteit bij vrouwen over de hele wereld 1,2 en de tweede belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen 2. Complexe genetische 3,4, 5 histologische en klinische fenotypen 6 worden gebruikt om de verschillende subtypes van borstkanker karakteriseren en vaak worden gebruikt als een middel om te overleven voorspellen. Analyse van een grote groep vrouwen met borstkanker aangegeven dat de meeste (ongeveer 80%) van de patiënten die stierven binnen 10 jaar na verwijdering van de primaire tumor 7 was teruggekomen. Voor een meerderheid van invasieve borstcarcinomen, is lymfovasculaire invasie aangetoond sterk gecorreleerd te zijn aan een slechte afloop en agressiever klinisch beloop van de ziekte 8. Vanwege de genetische en fenotypische complexiteit van borstkanker, is er geen diermodel dat het gehele verloop van de ziekte recapituleert. Humane borsttumor cellijnen herhaaldelijkgebruikt als xeno-of orthotopic 9 modellen van invasieve en metastatische borstkanker in immuun deficiënte muizen. Hoewel informatief, deze modellen in afwezigheid van immuniteitsdruk en omdat het een kruis soort transplantaat, verstoren de werking van de gehele tumor micro. Induceerbare genetische mutaties veroorzaakt door mammaire promoters zoals muizen borsttumor virus (MMTV) en wei zuur proteïne (WAP) een enorme hoeveelheid kennis over de genetische aard van borstkanker bijgedragen. Echter, is de weefselspecifieke expressie van deze promotors aangetast door hun gevoeligheid voor het endocriene systeem 10-16, waardoor de variabele expressie van geïnduceerde genetische mutaties die de expressie van oncogenen typisch tot overexpressie in menselijke borstkanker kan weerspiegelen. Endocriene controle van MMTV gedreven expressie van oncogenen te overwinnen, Moody et al.. Genereerde een voorwaardelijk, doxycycline induceerbare model overexpressie Neu in de borst17 epitheel. Dit model is handig voor deinducing Neu na tumorvorming tot regressie en herhaling te studeren, maar vereist constante doxycycline administratie voor een consistente, lange termijn oncogen expressie. Een uitgebreide bespreking van de vele relevante borsttumor modellen zijn te vinden in de beoordeling door Vargo-Gogola et al.. 10 Ons doel was om een ​​muismodel van traceerbare borstkanker op een volledig C57BL / 6 achtergrond dat na de permanente inductie van mutatie gebeurtenissen, modelleert de vorming van een ontluikende tumor in aanwezigheid van immuniteitsdruk. We introduceerden een adenovirus tot expressie Cre-recombinase in de borstklier kanalen van transgene muizen die floxed allelen van TP53 en een oncogene vorm van K-ras en YFP. Cre expressie ablateert TP53, een frequent gemuteerde gen in vele borstkankers 18 en veroorzaakt een oncogene allel van K-ras naast YFP expressie specifiekin de borstklier ductaal epitheel. Hoewel mutaties in K-ras zijn zeldzaam bij borstkanker, die zich in slechts 6,5% van de borstkankerpatiënten 19,20, de overexpressie van bovenstroomse kinases zoals Her2/neu en EGFR resultaat in constitutieve activering van het Ras signaling pathway in menselijke borsttumoren 21-23. Activering van het Ras signaling pathway in vele borsttumor cellijnen is ook gemeld 24,25. We zullen de inleiding van tumorvorming en de techniek van intraductal injectie van een adenovirus in Cre-recombinase in geslachtsrijp, maagdelijke vrouwelijke muizen te beschrijven. Dit model van borstkanker ontwikkelt openlijke laesies die exponentieel groeien na ongeveer 8 weken van de trage progressie van de tumor, met lymfovasculaire invasie en metastase naar de okselklier met 7-8 weken. Omdat deze muizen zijn op een volledige C57BL / 6 achtergrond en YFP expressie tumorcellen, traceerbaar zijn distale lymfeklieren, dit model geeft een relevant instrument om de CE-studiellular en immunologische mechanismen van latente metastase en zal helpen om nieuwe therapeutische benaderingen voor de behandeling van metastatische ductale borstkanker.

<table><tbody><tr><td>Trp53tm1Brn Transgenic muizen K-rastm4Tyj Transgenic muizen</td><td>Verkregen van NCI muismodellen van menselijk kankerconsortium</td><td></td><td>Muizen werden tien keer terug gekruist naar een volledige C57BL/6 achtergrond</td></tr><tr><td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/JTransgenic muizen</td><td>Jackson Labs</td><td>006148</td><td></td></tr><tr><td>Primers p53loxP/loxP</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3' 5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'</td></tr><tr><td>Primers LSL-K-rasG12D/+</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3' 5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'</td></tr><tr><td>Primers voor LSL-EYFP om Rosa promotor te detecteren</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3' 5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3' 5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3'</td></tr><tr><td>Primers voor detectie van Mesotheline expressie</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3' 5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3'</td></tr><tr><td>Primers voor detectie van Progesterone Receptor expressie</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3' 5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3'</td></tr><tr><td>Primers voor detectie van Cytokeratin 8 expressie</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3' 5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3'</td></tr><tr><td>Primers voor detectie van Erbb2 expressie</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3' 5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3'</td></tr><tr><td>Primers voor detectie van Estrogen Receptor A expressie</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3' 5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3'</td></tr><tr><td>Primers voor detectie van Estrogen Receptor B expressie</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3' 5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3'</td></tr><tr><td>Primers voor detectie van B-Actin expressie</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3' 5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3'</td></tr><tr><td>Adenovirus-Cre</td><td>Gene Transfer Vector Core van de Universiteit van Iowa</td><td>Ad5CMVCre</td><td>Bewaar aliquoten van het virus (4 x 108 pfu/aliquot) op -80 &#176;C om herhaalde bevriezing en ontdooi cycli te vermijden.</td></tr><tr><td>Adenovirus-mCherry</td><td>Gene Transfer Vector Core van de Universiteit van Iowa</td><td>Ad5CMVmCherry</td><td>Bewaar aliquoten van het virus (4 x 108 pfu/aliquot) op -80 &#176;C om herhaalde bevriezing en ontdooi cycli te vermijden.</td></tr><tr><td>Hamilton spuit</td><td>Hamilton bedrijf</td><td>701RN</td><td>10 &#956;l spuit, RN-serie. Autoclaveer voor en na elk gebruik. Reinig met PBS en 75% ethanol.</td></tr><tr><td>Aangepaste naald</td><td>Hamilton bedrijf</td><td>7803-05</td><td>33 G 0,5 in lange RN-naald, met een 12&#176; bevel. Autoclaveer voor en na elk gebruik. Reinig met PBS en 75% ethanol.</td></tr><tr><td>Chirurgische tang</td><td>Dumont</td><td>52100-58</td><td>Dumostar No. 5 tang. Reinig met 75% ethanol na elk gebruik, gevolgd door autoclavage</td></tr><tr><td>MEM poeder</td><td>Cellgro</td><td>50 012 PB</td><td>Bewaar bij 4 &#176;C in poeder en gereconstitueerde vorm</td></tr><tr><td>Natrium Bicarbonaat</td><td>Fisher</td><td>S233</td><td>Voeg toe aan MEM en steriliseer met filter</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td>Minimaal 96%, watervrij</td></tr></tbody></table>

initiatie van gemetastaseerd borstcarcinoom door targeting van de ductaal epitheel met adenovirus-cre: a novel transgeen muismodel van de breast cancer

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Borstkanker is een heterogene ziekte met een complexe cellulaire interacties tussen de ontwikkelende tumor en het immuunsysteem, uiteindelijk resulterend in exponentiële tumorgroei en metastase distale weefsels en de ineenstorting van anti-tumor immuniteit. Veel nuttige dierlijke modellen bestaan ​​om borstkanker te studeren, maar geen volledig recapituleren de progressie van de ziekte die bij mensen optreedt. Om een ​​beter begrip van de cellulaire interacties die leiden tot de vorming van latente metastase en verminderde overleving krijgen, hebben we een induceerbare transgene muismodel van YFP-expressie ductaal carcinoom die ontstaat na seksuele volwassenheid in immuun-competente muizen en wordt aangedreven gegenereerd door consistente, endocriene-onafhankelijke oncogene expressie. Activering van YFP, ablatie van p53, en expressie van een oncogene vorm van K-ras werd bereikt door de levering van een adenovirus in Cre-recombinase in de borstklier kanaal van seksueel volwassen, maagdelijke vrouwelijke muizen. Tumorenbeginnen te verschijnen 6 weken na de start van oncogene gebeurtenissen. Na tumoren zichtbaar worden, vordert ze langzaam gedurende ongeveer twee weken voordat ze beginnen exponentieel groeien. Na 7-8 weken na adenovirus injectie wordt vasculatuur waargenomen verbindt de tumormassa distale lymfeklieren, met eventuele lymfovasculaire invasie van YFP + tumorcellen aan het distale axillaire lymfeklieren. Infiltrerende leukocyten populaties zijn vergelijkbaar met die gevonden in menselijke borst carcinomen, waaronder de aanwezigheid van αβ en γδ T-cellen, macrofagen en MDSCs. Dit unieke model zal de studie van cellulaire en immunologische mechanismen betrokken bij metastase en latente latentie bovendien nuttig voor het ontwerpen van nieuwe therapieën invasieve behandeling van borstkanker vergemakkelijken.

Succesvolle targeting van de borstklier ductaal boom kan worden gevisualiseerd door het bereiden van hele bergen van de borstklier, zoals eerder beschreven 32 na injectie van trypanblauw (om de juiste injectietechniek (Figuur 1A) of een adenovirus in mCherry (om een goede voorbereiding en virale infectie controleren controleren ductale epitheelcellen, figuur 1B). <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig1.jpg" /> Figuur 1. Intraductale doelgerichtheid van melkklieren door injectie met trypanblauw of adenovirus-mCherry. A) Een hele berg, zoals eerder gemeld 32, van de borstklier na injectie van borstklier # 4 met trypaanblauw werd bereid 3 uur na injectie aan visualiseren / bevestigen targeting van de gehele ductaleboom. Beelden zijn 4X vergroting. B) Infectie van de ductale epitheel met adenovirus door het injecteren van 2,5 x 10 7 pve adenovirus in mCherry. Muizen werden intraductally geïnjecteerd, en 4 dagen na de injectie, een hele berg van de melkklier was bereid om virale infectie van de ductale boom te bevestigen. Afbeelding is 4X vergroting. MG is borstklier, LD is de melkafscheidende of hoofdkanaal en TD is de terminal kanaal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding.</a> Wanneer tumoren worden geïnduceerd in p53 loxP / loxP LSL-K-ras G12D / + transgene muizen, tumoren zichtbaar zullen zijn tot rond dag 40 toen de melkklieren vergroot en gezwollen wordt. Er moet palpations beginnen wanneer dit zich voordoet, controleren tumorgroei elke 5-7 dagen. In onze handen, verharding van de borstklier vooraf altijd het begin van tumorontwikkeling. Tumoren langzaam vooruitgang gedurende nog 2 weken. Beginnend rond dag 56, zal tumoren beginnen exponentieel groeien (Figuur 2B). Op dit punt, is het essentieel om tumorvolumes elke 3 dagen meten als kinetische studies zijn gewenst omdat kleine muis muis variabiliteit zal in tumorprogressie, wat normaal (Figuren 2A en 3A). Grote abdominale massa zal duidelijk zijn dag 80 (Figuur 2A, 2B en 3A), waarna muizen worden gedood wanneer tumoren meer bedragen dan 10% van hun lichaamsgewicht. cDNA analyse van drie klonen van een tumor-dragende muizen bleek de expressie van mesothelin, cytokeratin-8, Her2/neu, en oestrogeen receptor-α (figuur 2C). <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig2.jpg" /> &gt; Figuur 2. Ontwikkeling van tumoren bij p53 loxP / loxP LSL-K-ras G12D / + muizen geïnjecteerd intraductally met adenovirus-Cre. A) Twee voorbeelden van tumoren 80 dagen na injectie met adenovirus Cre. Muizen kregen 2,5 x 10 7 PFU adenovirus Cre en 80 dagen na tumor-initiatie kunnen grote voelbare massa worden gevisualiseerd uitsteekt uit de buik van het dier. B) Typische tumor kinetiek en palpatie tijdschema voor tumoren geïnduceerd in p53 loxP / loxP LSL-K-ras G12D / + muizen. C) Karakterisatie van drie tumorcel klonen afgeleid van dezelfde gehomogeniseerde tumor van een p53 loxP / loxP LSL-K-ras G12D / + muis. RNA werd geëxtraheerd en cDNA gesynthetiseerd voor RT-PCR-analyse met primers specifiek voor β-actine, mesothelin, cytokeratine-8, Her2/neu, progesteronreceptor, oestrogeenreceptor-α en oestrogeenreceptor-β.tps :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik hier voor grotere afbeelding. Net als het cellulaire micromilieu in menselijke borstkanker hebben we infiltratie van αβ en γδ T-cellen en myeloide suppressor cellen en macrofagen in de tumor (figuur 4) waargenomen. Vaatstelsel uitputten okselklier zal beginnen om snel te vullen voordat de tumoren zijn uitgegroeid tot de gehele borstweefsel waar de injectie werd uitgevoerd (figuur 3A) omvatten. Lymfovasculaire invasie en metastase van tumorcellen kan worden gevolgd door het kruisen van LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP muizen met LSL-EYFP muizen. Na Cre gemedieerde excisie, zijn tumorcellen die YFP (zowel hoog als laag) gedetecteerd in de tumor en kan worden getraceerd metastaserende de drainerende axillaire lymfeklieren (Figuur 3B). Metastase de distale axillaire lymfeklieren werd bevestigddoor succesvol kweken van een tumorcellijn van deze site in tumordragende LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP muizen (gegevens niet getoond). <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig3.jpg" /> Figuur 3. Vorming van tumoren en latente metastase naar de oksel lymfeklieren. A) Voorbeeld van drie geavanceerde borsttumoren met verschillende tarieven van de progressie van de tumor. Een massief, aangeduid door de pijlpunt, vormen en uiteindelijk groeit tot de grootte van het gehele abdominale borstweefsel. De tumor blijft beperkt tot het borstweefsel en is niet waargenomen binnen te dringen of te hechten aan de spier die de peritoneale holte. Er is duidelijk stuwing van de oppervlakkige epigastrische ader tussen de lies en oksel lymfeklieren, aangeduid door witte pijlpunten. Na 7-8 weken, the axillaire lymfeklieren begint te worden vergroot door lymfovasculaire invasie van tumorcellen, aangegeven door pijl. B) Metastase van YFP positieve tumorcellen in de axillaire lymfeklieren worden gevisualiseerd door flowcytometrie. LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP LSL-EYFP muizen werden gebruikt om tumoren en activering van YFP induceren door intraductale afgifte van adenovirus-Cre. Om lymfovasculaire invasie van tumorcellen controleren in de oksel lymfeklieren, 80 dagen na adenovirale injectie werden de aangegeven lymfeklieren en organen geoogst en gekleurd voor lymfocyt markers en onderzocht op YFP expressie. CL vertegenwoordigt contralaterale nontumor drainerende lymfeklier. Resultaten vormen gating op CD45 negatieve tumorcellen, met vermelding van de tumorcellen zijn invasie van de distale okselklier. Getallen procent YFP positieve cellen van de totale bevolking. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om larg bekijken</a>afbeelding er. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig4.jpg" /> Figuur 4. Immune infiltreert in de muis transgene borsttumoren. Mouse borsttumoren werden gehomogeniseerd en gekleurd voor CD45, CD3, γδTCR, CD11b en GR1. Getallen geven percentage positieve leukocyten in hele tumor (63.5), de totale CD3 + (46,7), de totale CD3 negatief (40,1), totale CD3 + γδ + (γδ T-cellen, 13), CD3 + γδnegative (24), totaal GR1 hoog CD11b (MDSC, 28,6) en de totale CD11b GR1 laag (macrofagen, 18.5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding.</a> Vanwege de anatomie van de muis en de techniek van intraductal injecties, vinden we richten of borstklieren 4 en 9 (fig. 5) levert de meest consistente resultaten en betrouwbare injecties. Echter, elke klier worden gericht, afhankelijk van de voorkeur van de technicus uitvoeren van de operatie. <img alt="Figuur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51171/51171fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51171/51171fig5.jpg" /> Figuur 5. Nummering van de mamma-kanalen. Borstklieren kanalen 4 en 9 zijn rood gemarkeerd op het diagram en aangegeven met pijlen op de muis. In onze handen, vonden we dat de injecties waren makkelijkst uit te voeren op deze mamma-kanalen, maar alle andere borstweefsels dat we gerichte ontwikkelden tumoren met vergelijkbare kinetiek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51171/51171fig5highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding.</a>

Activering van latente mutaties met adenovirus-Cre in de borstklier ductale systeem een ​​klinisch relevante metastatische borstkanker. Opneming van een YFP promotor maakt het volgen van distale metastatische tumorcellen. Dit model is nuttig om latente metastase, anti-tumor immuniteit, en voor het ontwerpen van nieuwe immunotherapieën behandeling van borstkanker bestuderen.

Initiatie van gemetastaseerd borstcarcinoom door Targeting van de Ductaal Epitheel met adenovirus-Cre: A Novel transgeen muismodel van de Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om een muismodel van borstkanker te ontwikkelen dat uiteindelijk metastaseert in aanwezigheid van een gezond immuunsysteem. Dit wordt eerst bereikt door een Cree-expresserend adenovirus toe te dienen in de mammaire ductale kanaal van de experimentele dieren. De borstklier wordt vervolgens regelmatig gepalpeerd om de tumorprogressie te volgen.Uiteindelijk kunnen tumormetastase en leukocyten-infiltratie naar de okselklierknoop worden geëvalueerd door middel van flowcytometrische analyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande borsttumormodellen is dat het de nauwkeurige initiatie van tumoren mogelijk maakt die zich kunnen ontwikkelen in aanwezigheid van een volwassen immuunsysteem, en die kunnen worden gevolgd door YFP-expressie. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de introductie-injectiestappen moeilijk te leren zijn.De juiste plaatsing van de naald vereist precisie en oefening. Op de dag van het experiment, bewaar Eloqua van vier keer 10 van de achtste plaquevormende eenheden van adenovirus Cree op droog ijs, ontdooi het virus op kamertemperatuur en meng het met voldoende 3% sucrose in steriel water om het eindvolume op 10 microliters te brengen. Meng vervolgens voorzichtig 34 microliters mem en vier microliters vers bereid calciumchloride in het virus en incubeer de oplossing op kamertemperatuur.Na 15 tot 20 minuten zal het medium troebel worden, wat duidt op de vorming van de adenovirus-precipitaten. Flik voorzichtig met de buis om ervoor te zorgen dat de virusdeeltjes gelijkmatig verdeeld zijn in de suspensie, en trek vervolgens drie microliters van het virus op in een 10 microliter spuit om de virusdeeltjes te injecteren. Plaats vervolgens een verdoofde muis op zijn rug op het verlichte podium van een schone dissectiemicroscoop.Verlicht de buik met een extra lichtbron en lokaliseer de linker vierde of de rechter negende inguinale borstklier door de kleine witte vachtvlekken rond elke tepel. Wrijf nu voorzichtig met een steriele ethanol gedrenkte katoenen applicator over de tepel. Bevestig vervolgens de tepel met fijn chirurgisch forceps en trek met lichte kracht omhoog.Om de keratineprop te verwijderen, stabiliseer de tepel tussen de forceps en steek voorzichtig de naald tussen de uiteinden. Canuleer het ductkanaal in een hoek van 90 graden om de juiste injectiediepte te garanderen, trek voorzichtig de naald omhoog nadat deze in het lumen van het kanaal is gestoken, en trek de tepel langs de randen van de naald omhoog terwijl deze omhoog wordt getrokken. Wanneer de naald op de juiste plaats is, duwt u voorzichtig de hele inhoud van de spuit in.De tepel zou licht moeten opzwellen wanneer de vloeistof wordt toegevoegd. Plaats de muis na de injectie terug op de verwarmingsmat totdat hij begint te herstellen van de verdoving. Plaats het dier vervolgens terug in een schone kooi en controleer het totdat volledige herstel is waargenomen.Palpeer de geïnjecteerde borstklier op dag 30 voor beoordeling van de vergroting en zwelling van de klier. Controleer de tumorprogressie elke vijf tot zeven dagen. Zodra een gezwollen en vergrote borstklier wordt waargenomen, meet u de tumorvolumes elke drie tot vier dagen voor de tumorgroeikinetiek.Zodra palpabele tumoren verschijnen, kan succesvol targeten van de mammaire ductale boom worden gevisualiseerd door hele montages van de borstklier te bereiden na injectie van trip en blauw om de juiste injectie te verifiëren of na injectie van een adenovirus dat M-kerrie uitdrukt om de juiste virale bereiding en infectie van ductiele epitheelcellen te verifiëren. Wanneer tumoren worden geïnduceerd in F Fluxed P 53 LSLK RAs transgene muizen, zullen de eerste tumoren pas rond dag 40 duidelijk worden wanneer de borstklieren vergroot en gezwollen worden. Vanaf ongeveer dag 56 beginnen de tumoren exponentieel te groeien.Op dit punt is het van cruciaal belang om de tumorvolumes elke drie dagen te meten. Als kinetische studies gewenst zijn, zal er enige normale variatie tussen muizen zijn in de tumorprogressie, grote buikmassa's zullen duidelijk zijn tegen dag 80, waarna muizen moeten worden gedood als de tumoren meer dan 10% van het lichaamsgewicht van het dier overschrijden. CDNA-analyse van drie cellijnen afgeleid van borsttumoren in flux P 53 LSL KRAS transgene muizen toonde aan dat de tumoren mesotheline cytokeratine acht, HER twee nieuw en oestrogeenreceptor alfa tot expressie brengen, vergelijkbaar met de cellulaire micro-omgeving in humane borstkankerinfiltratie van alfa, bèta en gamma delta T-cellen, evenals myeloide afgeleide suppressorcellen en macrofagen in de tumoren wordt waargenomen.Het vatseldrainage naar de okselklier zal beginnen te zwellen voordat de tumoren zijn gegroeid en uiteindelijk het gehele geheugenweefsel omvat waar de injectie werd uitgevoerd. Er zal ook een duidelijke zwelling zijn van de oppervlakkige epigastrische ader tussen de inguinale en okselklierknoop. Na zeven tot acht weken zal de okselklierknoop vergroot raken als gevolg van de lymfo-vasculaire invasie van de tumorcellen.De lymfo-vasculaire invasie en metastase van de tumorcellen kunnen worden gevolgd door Flocked P 53 LSLK RAs transgene muizen te kruisen met L-S-L-E-Y-F-P muizen. Na pre-mediale excisie worden cellen die zowel hoge als lage niveaus van YFP tot expressie brengen gedetecteerd in de tumor en hun metastase kan worden getraceerd naar de drainerende okselklierknoop. Eenmaal beheerst, kan deze techniek worden uitgevoerd op een experimentele cohort van 20 muizen in twee tot drie uur als het correct wordt uitgevoerd.Volgens deze procedure kunnen andere tumormodellen worden ontwikkeld door muizen te fokken met aanvullende locks, p transgenen, om vragen te beantwoorden zoals hoe verschillende oncogenen de pathologie, het immuunmicro-omgeving en de metastatische invasie van borstkanker beïnvloeden.

initiation-metastatic-breast-carcinoma-targeting-ductal-epithelium

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Deze video beschrijft een intraductale injectietechniek waarbij we injectiemix leveren in de kanalen van de borstklieren van muizen.

Intraductale injectie: het leveren van injectie mix in de kanalen van de muis borstklier

This video describes the generation of a colorectal mouse model by segmental adeno-cre infection. The infected colon segment leads to tumorigenesis within this segment of the mucosa, resulting in adenomas ultimately progressing to invasive and metastatic carcinoma. This model is an attractive platform for studies of cancer biology and preclinical therapeutic trials.

Segmental Adeno-Cre Infection: A Technique to Generate Isolated Colorectal Cancer using Genetically Engineered Mouse Models

This video demonstrates the establishment of a brain metastasis mouse model by intracarotid injection of fluorescently labeled cancer cells. The mouse model can be used to study the effects of novel therapeutics and the underlying physiological mechanisms.

Brain Metastasis Mouse Model: A Method to Generate Brain Metastasis Mouse Model by Intracarotid Cancer Cell Injection

Een orthotope borstkanker primaire tumor model en chirurgische verwijdering van de primaire tumor de muis het leven uit te breiden tot spontane metastase genereren beschreven. De tumorgroei en progressie worden gecontroleerd en gekwantificeerd luciferase fluorescentiebeeldvorming.

Een orthotope Muis Model van Spontane uitzaaiing van borstkanker

Preklinische modellen die adjuvante therapie beoordelen die gericht zijn op metastase van borstkanker, ontbreken. Om dit aan te pakken, ontwikkelden we een muizenmodel van de novo pulmonale mammary adenocarcinoma metastase, waarbij therapieën toegediend in de adjuvante omgeving (post-chirurgische resectie van primaire tumoren) kunnen worden geëvalueerd voor werkzaamheid bij het beïnvloeden van eerder gecoede pulmonale metastasen.

Chirurgische Procedures en Methodologie voor een Preklinisch Murine Model van De Novo Maagkanker Metastase

Er werd een chirurgische procedure ontwikkeld om mamma-tumorcellen via injectie in de poortader in de muizenlever af te leveren. Dit model maakt onderzoek naar late stadia van levermetastase mogelijk bij een volledig immuuncompetente gastheer, inclusief extravasatie van tumorcellen, zaaien, overleven en metastatische uitgroei in de lever.

Een poortader Injection Model op de studie van de lever metastase van borstkanker

Het doel van dit protocol is om een nieuwe borstkanker modellerings aanpak te beschrijven op basis van de intraductale injectie van CRE-uitdrukken van adenovirus in muizen borstklieren. Deze aanpak maakt zowel cel-type-en orgaan-specifieke manipulatie van oncogene gebeurtenissen op een tijdelijk gecontroleerde manier mogelijk.

Het modelleren van borstkanker via een Intraductale injectie van CRE-uitdrukken van adenovirus in de muis borstklier

Patient-derived xenograft (PDX) modellen en transplanteerbare genetisch gemanipuleerde muismodellen getrouw de menselijke ziekte samenvatten en zijn voorkeursmodellen voor fundamenteel en translationeel borstkankeronderzoek. Hier wordt een methode beschreven om borsttumorfragmenten orthotopisch in het borstvetkussen te transplanteren om tumorbiologie te bestuderen en de respons van geneesmiddelen te evalueren.

Orthotopische transplantatie van borsttumoren als preklinische modellen voor borstkanker

Intraveneuze injectie van kankercellen wordt vaak gebruikt in metastaseonderzoek, maar de gemetastaseerde tumorbelasting kan moeilijk te analyseren zijn. Hierin demonstreren we een staartaderinjectiemodel van metastase en nemen we een nieuwe benadering op om de resulterende gemetastaseerde longtumorbelasting te analyseren.

Pathologische analyse van longmetastase na laterale staartaderinjectie van tumorcellen

Een methode van intraductale injectie van reagentia voor een op ethanol gebaseerde ablatieve oplossing in de mamma-ductale boom van muizen voor in vivo beeldvorming en preventie van borstkanker wordt beschreven. Injectie direct in de tepelopening maakt het mogelijk om borstepitheelcellen te richten met minimale collaterale weefselschade.

Intraductale toediening en röntgenvisualisatie van op ethanol gebaseerde ablatieve oplossing voor preventie en lokale behandeling van borstkanker in muismodellen

Het huidige protocol beschrijft intraductale injectie van virale vectoren via de speen om genen van belang af te leveren in de borstepitheelcellen.

In Vivo Genafgifte in muisepitheelcellen via intraductale injectie van zmammas

Leer hoe je een muismodel van borstkanker ontwikkelt met adenovirus-Cre in het ductale epitheel. Deze methode maakt het mogelijk om metastase en tumor-immuniteit te bestuderen met behoud van een gezond immuunsysteem.

Initiatie van gemetastaseerd borstcarcinoom door Targeting van de Ductaal Epitheel met adenovirus-Cre: A Novel transgeen muismodel van de Breast Cancer (Video) | JoVE Journal

Initiatie van gemetastaseerd borstcarcinoom door Targeting van de Ductaal Epitheel met adenovirus-Cre: A Novel transgeen muismodel van de Breast Cancer

Meer video's verkennen