Cerebrospinale vloeistof MicroRNA Profiling Met behulp van kwantitatieve real time PCR
January 22nd, 2014
We beschrijven een protocol van real time PCR om microRNA profileren in de cerebrospinale vloeistof (CSF). Met uitzondering van RNA-extractie protocollen kan de procedure worden uitgebreid tot RNA geëxtraheerd uit andere lichaamsvloeistoffen, gekweekte cellen of weefselmonsters.
Het algemene doel van deze procedure is om microRNA's in hersenvocht te profileren door middel van kwantitatieve PCR en de gegevens te analyseren met behulp van Gen X professionele software. Dit wordt bereikt door eerst totaal RNA te isoleren uit hersenvochtmonsters. De tweede stap is om reverse transcriptie uit te voeren om de RNA's in CDNA's te transcriberen.
Vervolgens worden de CDNA's gemengd met een cyber groen master mix, geladen in 384-well platen die primers voor 742 unieke sequenties bevatten en geamplificeerd met behulp van real-time PCR. De laatste stap is het analyseren van de gegevens verkregen uit de real-time amplificatie. Uiteindelijk kunnen de resultaten worden uitgedrukt als een voudverschil, toename of afname ten opzichte van een controle, en worden gevisualiseerd in verschillende grafische weergaven.
Het belangrijkste voordeel van onze techniek boven bestaande methoden zoals chip arrays is dat onze methode zeer gevoelig is en minimale hoeveelheden RNA vereist. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen vanwege de grote hoeveelheid gegenereerde gegevens en het gebruik van de software voor gegevensanalyse. Eerst spuit je het werkgebied en de pipetten met RNA Zap.
Om te beginnen, verdun CDNA-synthese de template RNA-monsters tot een concentratie van vijf nanogram per microliter met nuclease-vrij water. Plaats vervolgens de vijf x reactiebuffer voorzichtig op ijs om te ontdooien. Voeg vervolgens 40 microliter nuclease-vrij water toe aan de RNA spike in om het reagens te resuspenderen, draai de buis in een vortex en laat het 15 tot 20 minuten op ijs staan.
Vervolgens haalt u de enzymen uit de vriezer, klapt de buizen open en plaatst ze op ijs. Zorg er ook voor dat alle reagentia zijn ontdooid en centrifugeer ze snel. Bereid de werkende oplossing voor reverse transcriptase in een 1,5 milliliter eph-buis door de vijf x reactiebuffer enzym toe te voegen.
Meng nuclease-vrij water en RNA spike in template met de verhoudingen zoals aangegeven in tabel een. Meng vervolgens de werkende oplossing door deze een tot twee seconden op maximale snelheid in een vortex te draaien. Draai de oplossing kort in een centrifuge gedurende 10 seconden en verdeel vervolgens de werkende oplossing in nuclease-vrije PCR-buisjes.
Voeg vervolgens het template RNA direct toe aan de PCR-buisjes. Draai de reactie voorzichtig een tot twee seconden in een vortex om ervoor te zorgen dat alle reagentia grondig zijn gemengd en centrifugeer de buisjes gedurende 10 seconden. Plaats het monster in de PCR-machine en voer de instellingen in die hier worden weergegeven.
Start vervolgens het programma na retro transcriptie. De CDNA is klaar voor real-time PCR-amplificatie en kan tot vijf weken worden bewaard bij min twintig graden Celsius. Om real-time PCR-amplificatie te starten, plaatst u eerst de CDNA en de PCR master mix op ijs.
Om te ontdooien beschermt u de PCR master mix-vialen tegen licht door ze te bedekken met aluminiumfolie terwijl ze ontdooien. Zodra ontdooid, vortex de PCR master mix gedurende een tot twee seconden. Combineer vervolgens 2000 microliter van twee XPCR master mix en 1.980 microliter water in een 15 milliliter conische buis.
Voeg 20 microliter van de CDNA toe aan het mengsel en draai de oplossingen voorzichtig een tot twee seconden in een vortex. Centrifugeer vervolgens de oplossingen in een gekoelde centrifuge bij 1.500 keer G gedurende één minuut bij vier graden Celsius. Plaats vervolgens de PCR-reactiemix in een multikanaals pipet reservoir.
Centrifugeer de kant-en-klare platen kort in een gekoelde centrifuge bij 1.500 keer G voordat u het platen zegel verwijdert. Verdeel vervolgens 10 microliter van de PCR master mix met CDNA in elk putje van een 384-well plate. Gebruik een 16-kanaals pipet en verzegel de plaat met een optische verzegelingsfolie.
Na het toevoegen van de master mix, centrifugeer de plaat kort in een gekoelde centrifuge bij 1.500 keer G om de oplossing naar de bodem van de putjes te trekken. Meng de monsters en verwijder luchtbellen om het experiment te pauzeren. Bewaar de reacties op dit punt op een plaats beschermd tegen licht bij vier graden Celsius gedurende maximaal 24 uur.
Voer vervolgens real-time PCR-amplificatie en smeltcurve-analyse uit volgens de parameters in tabel twee. Selecteer om de analyse te beginnen de tweede afgeleide analysemethode in de Roche light cycler. Bereken vervolgens de kwantificeringscyclus of CQ-waarden.
Exporteer de gegevens als een tabel en sla ze op als tekstbestand. Importeer vervolgens de gegevens in Gen X door eerst op de gon import wizard knop te klikken en vervolgens op start in het volgende venster. Selecteer het formaat instrument en plate layout bestanden. Plate layout Excel bestanden kunnen worden gedownload van de GON-website.
Importeer vervolgens paneel een en klik op volgende. De tabel die na het importeren van het bestand is gegenereerd, bevat voorgedefinieerde kolommen, bewerk monsternamen en voeg of verwijder classificatiekolommen in deze stap. Klik op volgende als u klaar bent en sla de gegevens op.
Laad het vervolgens in de data editor. Kalibreer eerst de gegevens tussen de platen door INTERPLATE kalibratie te kiezen in het voorverwerkingsmenu om ervoor te zorgen dat alle platen worden berekend met dezelfde parameters. Definieer vervolgens een grenswaarde die gegevens hoger dan de drempelcyclus of ct zal verwijderen. Als een micro RNA een CT heeft die groter is voor één replica van de drie, wordt die meting vervangen door het gemiddelde van de CT van de twee andere sondes.
Definieer referentiegenen door een lijst van microRNA's te selecteren die vergelijkbare CQ-waarden hebben in alle monsters en voer gene norm uit. Normaliseer vervolgens de gegevens met behulp van de verkregen referentiegenen. De resulterende waarden komen overeen met de delta ct.
Verwijder lege en bijna lege kolommen door het voorverwerkingsvenster te openen en validate sheet te selecteren, en vervolgens Apply te selecteren op de remove empty columns regel in de regel hieronder. Kies het gewenste percentage geldige gegevens en klik op apply. Selecteer 100% als u alleen microRNA's wilt vergelijken die in alle monsters voorkomen.
Laad het definitieve MDF-bestand in
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft het gebruik van real-time PCR om microRNA's in hersenvocht (CSF) te profileren. De methode kan ook worden aangepast voor RNA geëxtraheerd uit andere lichaamsvloeistoffen, gekweekte cellen of weefselspecimens.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Moleculair biologie
- Genomics
Achtergrond
- MicroRNA's spelen een cruciale rol bij het reguleren van genexpressie.
- Hersenvocht is een waardevolle bron voor het bestuderen van neurobiologische processen.
- Real-time PCR maakt kwantitatieve analyse van RNA mogelijk.
- Het begrijpen van microRNA-profielen kan helpen bij het diagnosticeren van neurologische aandoeningen.
Doel van de studie
- MicroRNA's in CSF profileren met behulp van kwantitatieve PCR.
- Een betrouwbare methode bieden voor RNA-analyse in verschillende biologische monsters.
- Gegevensanalyse mogelijk maken met behulp van Gen X professionele software.
Gebruikte methoden
- Isolatie van totaal RNA uit CSF-monsters.
- Omgekeerde transcriptie om RNA's om te zetten in cDNA's.
- Amplificatie van cDNA's met behulp van een cyber green master mix in 384 well platen.
- Gegevensanalyse van real-time PCR-resultaten om voudwisselingen te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle profilering van 742 unieke microRNA-sequenties.
- Kwantitatieve resultaten uitgedrukt als voudwisselingen ten opzichte van controles.
- Gegevensvisualisaties leverden verschillende grafische weergaven op.
- De methode toonde aanpasbaarheid voor andere monstersoorten.
Conclusies
- Het protocol is effectief voor het profileren van microRNA's in CSF.
- Real-time PCR kan worden toegepast op andere biologische monsters.
- Resultaten kunnen het begrip van neurobiologische mechanismen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative real-time PCR profiling of cerebrospinal fluid microRNAs enables sensitive detection of disease-associated molecular signatures, supporting early-stage biomarker discovery in neurodegenerative and complex disorders. This workflow enhances predictive confidence in translational research by providing robust, quantitative data on extracellular miRNA expression. Integration of high-throughput miRNA profiling informs portfolio decisions at the biomarker validation and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of miRNA-mediated regulatory pathways relevant to disease mechanisms.
- Supports functional target validation by quantifying miRNA expression changes in disease versus control CSF samples.
- Facilitates biological de-risking through identification of stable reference miRNAs for normalization.
- Provides quantitative evidence to prioritize candidate biomarkers for further validation.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible miRNA quantification across 742 unique targets using validated PCR panels.
- Generates high-content, quantitative outputs suitable for downstream screening and comparative analyses.
- Enables assay scalability and platform reuse across diverse sample types, including CSF, plasma, and tissue.
- Supports robust compound evaluation by ensuring sensitive detection of low-abundance miRNAs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns miRNA profiling with disease-relevant biomarker discovery in neurological and oncological indications.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling cross-sample and cross-cohort comparisons.
- Provides risk-adjusted data to inform advancement of biomarker candidates into translational studies.
- Strengthens predictive de-risking by quantifying miRNA signatures associated with disease phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This quantitative PCR-based miRNA profiling method fits within the biomarker discovery and validation continuum, bridging early discovery, assay development, and translational research workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying miRNA expression changes in CSF.
- Screening: Provides reproducible, high-throughput assay readiness for large-scale miRNA profiling.
- Analytics: Delivers quantitative fold-change data and statistical outputs for robust condition comparisons.
- Translational Research: Enables biomarker alignment and continuity across preclinical and clinical sample types.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for miRNA profiling in multiple biological matrices.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in biomarker discovery.
- Operational Value: Standardizes miRNA quantification with high sensitivity and minimal RNA input requirements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, quantitative biomarker evaluation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biomarker candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, qPCR setup, and data analysis using specialized software.
- Demands access to high-throughput qPCR instrumentation and validated primer panels.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for data normalization and reference gene selection.
- Adaptable to various sample types but may require optimization for low-abundance or degraded RNA.
- Data analysis complexity and software proficiency are critical for accurate interpretation and visualization.
