Name: 2D en 3D Chromosoom schilderen in Malaria Muggen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Leer chromosoomschildering in 2D en 3D voor celbiologisch onderzoek bij malariamuggen. Deze methode combineert laser-microdissectie met FISH om chromosoomterritoria zichtbaar te maken zonder voorafgaande sequentiekennis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de subsidie van national institutes of health 1R21AI094289 aan Igor V. Sharakhov

1) Polytene chromosoom dia voorbereiding voor laser capture microdissection
<ol><li>Ontleed half-gravid Anopheles vrouwtjes op 25 uur post-bloed voeding. Fixeer eierstokken van ongeveer vijf vrouwtjes in 500 μl vers gemodificeerde Carnoy's oplossing (100% methanol: ijsazijnzuur, 3:1) bij kamertemperatuur gedurende 24 uur. Breng de eierstokken over naar -20 °C voor langdurige opslag.</li>
	<li>Bereid carnoy's oplossing (100% ethanol: ijsazijnzuur, 3:1) en 50% propionzuur vlak voor het maken van chromosoomdia's.</li>
	<li>Plaats een paar eierstokken in één druppel Carnoy's oplossing op een Zeiss 1.0 PET membraanschuif. Afhankelijk van de grootte, splits eierstokken in ongeveer 2-4 secties met ontleden naalden en plaats ze in een druppel van 50% propionzuur op schone dia's onder een dissectiemicroscoop.</li>
	<li>Scheid de follikels en verwijder het resterende weefsel met keukenpapier onder een dissectiesteremicoscoop. Voeg een nieuwe druppel van 50% propionzuur toe aan de follikels en laat ze 3-5 minuten op kamertemperatuur zitten.</li>
	<li>Plaats een gesiliconiseerde afdeklip op de druppel. Laat de schuif ongeveer 1 minuut staan.</li>
	<li>Bedek de dia met een absorberend materiaal (filterpapier wordt voor deze methode gebruikt) en oefen tijdens het gebruik van de gumzijde van een potlood een royale hoeveelheid druk uit op de afdeklip door er herhaaldelijk op te tikken met de gum.</li>
	<li>Verwarm de dia tot 60 °C op een diadenaturatie/hybridisatiesysteem gedurende 15-20 minuten om te helpen bij het afvlakken van de polytene chromosomen. Plaats dia's 's nachts in een vochtige kamer bij 4 °C om het zuur de chromosomen verder af te vlakken.</li>
	<li>Plaats dia's 10 minuten in koude 50% ethanol. Verwijder voorzichtig de afdeklip en vervang in koude 50% ethanol gedurende nog 10 minuten.</li>
	<li>Dehydrateer dia's in 70%, 90%, 100% ethanol gedurende elk 5 minuten. Luchtdroge dia's.</li>
	<li>Bereid een oplossing van GURR-bufferoplossing voor door een enkele buffertablet toe te voegen aan 1 L gedestilleerd water. autoclaaf.</li>
	<li>Bereid de Giemsa-oplossing door 1 ml Giemsa-kleuroplossing toe te voegen aan 50 ml GURR-buffer.</li>
	<li>Plaats luchtgedroogde dia's in Giemsa-oplossing gedurende 10 minuten en was driemaal in 1X PBS. Luchtdroge glijdt opnieuw in een gecontroleerd steriel klimaat om verontreiniging te voorkomen.</li>
</ol>2) Laser capture microdissection van een enkele polytene chromosoom arm
In deze sectie wordt het gebruik van de PALMRobo-software behandeld, die wordt geleverd met het PALM MicroBeam Laser Microdissection-systeem. 
<ol><li>Reinig de microscoop met 100% ethanol. Steriliseer handschoenen en tubes met een UV-licht in een UV-crosslinker.</li>
	<li>Zet de PALM MicroBeam Laser Microdissection microscoop aan en schakel laser in. Open de laserdissectiesuite, PALMRobo, en configureer indien nodig de instellingen "Power" en "Focus".</li>
	<li>Zoek naar polytene chromosoom arm van belang.</li>
	<li>Schets met het gereedschap Potlood het geselecteerde gebied.</li>
	<li>Open het venster "Elementen" in de menubalk.</li>
	<li>Selecteer het element 'Getekend', zorg ervoor dat u 'Knippen' hebt geselecteerd.</li>
	<li>Installeer de zelfklevende dopbuis in de houder en plaats deze boven de glijbaan, laat een kleine opening <1 mm groot en start de lasersnede.</li>
	<li>Plaats de "Katapultselectie" binnen de snijplaats en laat ruimte tussen de rand en het chromosoom.</li>
	<li>Selecteer "LPC" in de vervolgkeuzelijst en begin met katapulteren.</li>
	<li>Controleer of het monster in de dop is gekatapulteerd door op het pictogram "Oog" te drukken.</li>
</ol>3) Zuivering van DNA uit een enkele microdissecte polytene chromosoomarm
Volg de instructies van de QIAamp DNA Micro Kit om het verzamelde DNA vrij te geven en te zuiveren. Stap 3.1 is aangepast aan de omgekeerde buis. 
<ol><li>Voeg 15 μl Buffer ATL en 10 μl proteïnase K toe aan de omgekeerde buis (in de dop) en incubeer bij 56 °C gedurende 3 uur.</li>
	<li>Voeg 25 μl buffer ATL, 50 μl buffer AL en 1 μl drager RNA toe; mix. Voeg 50 μl 100% EtOH toe; mengen.</li>
	<li>Lysaat overbrengen naar qiaamp-kolom; centrifuge. Wassen door toevoeging van 500 μl buffer AW1; centrifuge. Plaats de kolom in de nieuwe opvangbuis, voeg 500 μl buffer AW2 toe; centrifuge. Plaats de kolom in een nieuwe buis; centrifugeer om overtollige vloeistof te verwijderen.</li>
	<li>Plaats de kolom in een microcentrifugebuis van 1,5 μl en voeg 20 μl water toe aan elute; centrifuge.</li>
	<li>Verdampt vers geëuteerd DNA tot een eindvolume van 9 μl met behulp van een vacuümfuge.</li>
</ol>4) Versterking van DNA uit een enkele microdissecte polytene chromosoomarm
Voor de WGA van een enkele chromosoomarm werden twee verschillende protocollen gebruikt. 
<ol><li>DNA-versterking en sondevoorbereiding via GenomePlex WGA<ol>
<li>Volg het GenomePlex Single Cell WGA4 Kit-protocol om de eerste batch versterkt DNA te produceren:<ol>
<li>Voeg vers bereide Proteinase K-oplossing toe aan het monster van 9 μl; mix. Incubeer DNA bij 50 °C gedurende 1 uur en verwarm vervolgens tot 99 °C gedurende 4 min. Blijf op ijs.</li>
			<li>Voeg 2 μl 1x eencellige bibliotheekvoorbereidingsbuffer en 1 μl bibliotheekstabilisatieoplossing toe; mengen. Verwarm het monster gedurende 2 minuten op 95 °C. Koel af op ijs en centrifugeer.</li>
			<li>Voeg 1 μl bibliotheekpreparaatenzym toe; mengen en centrifugeren. Incubeer als volgt: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq1.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Voeg 7,5 μl 10X Amplification Master Mix, 48,5 μl water toe. 5,0 μl WGA DNA-polymerase; mengen en centrifugeren.</li>
			<li>Thermocycle als volgt: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq2.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zuiver DNA met behulp van de Genomic DNA Clean &Concentrator Kit. Het protocol is als volgt:<ol>
<li>Voeg 5:1 DNA-bindingsbuffer toe: DNA-monster (specifiek voor genomisch DNA van minder dan 2 kb. Als het DNA van het monster groter is dan 2 kb, gebruikt u een verhouding van 2:1) en wordt het overgedragen naar de meegeleverde spinkolom. centrifuge.</li>
			<li>Voeg 200 μl DNA Wash Buffer en centrifugeer toe. Herhaal de wasstap. Voeg vervolgens 50 μl water toe en elute het DNA in een nieuwe buis van 1,5 ml.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Versterk het DNA van het monster opnieuw met behulp van de GenomePlex WGA3 Reamplification Kit als volgt:<ol>
<li>Voeg 10 μl DNA toe aan de PCR-buis (de kit beveelt 10 ng totaal DNA aan) met 49,5 μl water, 7,5 μl 10x Amplification Master Mix, 3,0 μl 10 mM DNTP-mix en 5,0 μl WGA DNA Polymerase. Mix en centrifugeer.</li>
			<li>Gebruik het volgende profiel voor de reactie: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Bewaar DNA bij -20 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Label DNA voor VIS met behulp van de GenomePlex WGA3 Reamplification Kit als volgt:<ol>
<li>Maak een mastermix van de GenomePlex WGA3 Reamplification Kit door 10 μl DNA toe te voegen aan pcr-buis met 49,5 μl water, 7,5 μl 10X Amplification Master Mix, 3,0 μl 1 mM dNTP-mix (1 mM dATP, dCTP, dGTP, 0,3 μl 1 mM dTTP- en 5,0 μl WGA DNA Polymerase.</li>
			<li>Gebruik het volgende profiel voor de reactie: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/51173/51173eq3.jpg" width="150" fo:content-width="1.5in">
</li>
			<li>Ethanol precipitaat de gelabelde sonde door 1/10 het uiteindelijke reactievolume (7,5 μl voor 75 μl reactie) van 3 M natriumacetaat pH 5,2 en 2-3 volumes van 100% ethanol toe te voegen. Koel dna-monster bij -80 °C gedurende ten minste 30 minuten.</li>
			<li>Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 4 °C om gelabelde pellets te maken en supernatante en luchtdroge pellets te verwijderen.</li>
			<li>Maak als volgt een hybridisatiebuffer: 0,2 g Dextransulfaat 1200 μl Gedeioniseerd formamide 580 μl H2O 120 μl 20X SSC</li>
			<li>Voeg 40 μl hybridisatiebuffer toe aan luchtgedroogde pellets.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>DNA-versterking en sondevoorbereiding via REPLI-G Single Cell WGA gevolgd door nick-translation<ol>
<li>Volg het REPLI-g Single Cell WGA Kit protocol om het versterkte DNA te produceren:<ol>
<li>Bereid Buffer D2 (3 μl van 1 M DTT + 33 μl Buffer DLB) voor.</li>
			<li>Meng 4 μl gezuiverd microdissected materiaal met 3 μl Buffer D2. Flick buis te mengen. Incubeer gedurende 10 minuten bij 65 °C. Voeg 3 μl Stop-oplossing toe; mengen.</li>
			<li>Voeg 9 μl H2O, 29 μl REPLI-g reactiebuffer en 2 μl REPLI-g DNA-polymerase toe aan het monster. Incubeer bij 30 °C gedurende 8 uur. Inactiveren DNA polymerase door verhitting tot 65 °C gedurende 3 min. Bewaar DNA bij -20 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Volg het nick vertaalprotocol om REPLI-g versterkt DNA te labelen:<ol>
<li>Bereid de volgende etiketteringsmix voor: 1 μg versterkt DNA 5 μl 10X DNA Polymerase Buffer 5 μl 10x dNTP 5 μl 1X BSA 1 μl 1 mM Gelabelde dNTP 4 μl 1 U/μl DNase I 1 μl 10 U/μl DNA Polymerase I H2O tot 50 μl</li>
			<li>Incubeer bij 15 °C gedurende 2 uur. Voeg 2 μl 0,5 M EDTA toe om de reactie te stoppen. Controleer de grootte van het DNA-fragment door op gel te lopen.</li>
			<li>Volg stappen van 4.1.4.3-4.1.4.6 om pellet te precipitaat en oplosbaar te maken.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>5) 2D FISH op polytene en mitotische chromosoompompoenpreparaten
Raadpleeg gedetailleerde protocollen voor FISH over preparaten van polytene squashen 47 en mitotische chromosoomdia's 48. Hier geven we korte protocollen.
<ol><li>VIS op polytene chromosoompompoenpreparaten<ol>
<li>Dompel dia's 20 minuten onder in 1X PBS bij RT. Bevestig dia's in 4% Paraformaldehyde in 1X PBS gedurende 1 min.</li>
		<li>Dehydrateer dia's door ethanolwassingen: 50%, 70%, 90%, 100% gedurende elk 5 min bij RT. Luchtdroge dia's.</li>
		<li>Verwarm de sonde voor in de hybridisatiebuffer bij 37 °C. Voeg 10-20 μl sonde toe om te schuiven. Deksel met 22 X 22 mm afdeklip. Druk eventuele luchtbellen uit met behulp van een pipetpunt.</li>
		<li>Denature chromosomen en sonde bij 90 °C gedurende 10 min. Afdichtingsranden van coverslip met rubbercement. Breng de schuif over naar de vochtige kamer en incubeer 's nachts bij 39 °C.</li>
		<li>Was de dia's met 1X SSC op 39 °C gedurende 20 min. Was de dia's met 1X SSC bij RT gedurende 20 min. Spoel dia's af in 1X PBS en voeg vervolgens Prolong anti-fade toe met DAPI. Dek af met een afdeklip en bewaar deze ten minste een uur voor visualisatie in een diavak bij 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>VIS op mitotische chromosoompompoenpreparaten<ol>
<li>Extract mitotische chromosomen uit imaginale schijven van 4e instar larve van An. gambiae.</li>
		<li>Bereid chromosoomdia's voor die geschikt zijn voor FISH.</li>
		<li>Voeg 2-3 μl gelabelde DNA-sonde toe aan de hybridisatiebuffer in een buis en meng voorzichtig door pipetten.</li>
		<li>Breng 10 μl van het sondemengsel aan op de glijbaan en dek af met een afdeklip van 22 x 22 mm. Druk eventuele luchtbellen uit met behulp van een pipetpunt.</li>
		<li>Voor counterstaining en detectie past u Prolong anti-fade met DAPI toe op het preparaat en blijft u ten minste een uur voor visualisatie in het donker.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6) 3D VISSEN op geheel-onderstel ovariumweefsel
<ol><li>Bereid de volgende Buffer A mix voor: 60 mM KCl 15 mM NaCl 0,5 mM Spermidine 0,15 mM Spermine 2 mM EDTA 0,5 mM EGTA 15 mM BUIZEN</li>
	<li>Bereid dia's voor op nucleaire visualisatie door een laag nailpolish toe te voegen in een vierkant patroon dat overeenkomt met de grootte van de coverslips. Dit creëert een verhoogd oppervlak om verplettering van kernen te voorkomen bij het plaatsen op de afdeklip in de toekomst.</li>
	<li>Ontleed verse eierstokken van Christopher's stadium 3 vrouwtjes en bewaar in een oplossing van 150-250 μl Buffer A met 0,5% digitonine. Voer grotere dissectienaald over follikels (in buis met buffer A met 0,5% digitonine) om folliculaire membraan te vernietigen.</li>
	<li>Vortex gedurende 5-10 minuten om de follikels verder te verstoren. Schraap alle grote folliculaire stukken en centrifugebuis gedurende 30 seconden bij de laagste instelling van ~ 500 omwentelingen per minuut (RPM). Breng supernatant over naar een nieuwe Eppendorf-buis van 2 ml en voeg 100 μl buffer A toe. Herhaal stap 6.3 tussen 5-7 keer, totdat het zichtbare weefsel in kleine deeltjes is gebroken.</li>
	<li>Draai beide buizen 10 minuten bij 2.000 rpm. Gooi supernatant weg in beide buizen. Opmerking: Beide buizen worden gebruikt voor het maken van definitieve nucleaire visualisatiedia's. De buis met verzameld supernatans moet voornamelijk geëxtraheerde kernen bevatten, terwijl de oorspronkelijke buis met weefsel een mengsel van weefsel en kernen bevat die zijn ingebed in verpleegkundige cellen. Voeg 200 μl buffer A – 0,1% Triton toe en incubeer 's nachts bij 4 °C. Centrifugeer 5 min bij 10.000 RPM (10.621 x G) en verwijder supernatant.</li>
	<li>Voeg 200 μl 4% Paraformaldehyde toe aan PBS. Incubeer in thermomixer gedurende 30 minuten, mengen bij 450 RPM. Centrifugeer 5 min bij 5.000 RPM (2.655 x G) en verwijder supernatant. Wassen met Buffer A met 0,1% Triton gedurende 5 min, mengen bij 450 RPM in thermomixer. Centrifugeer 5 min bij 5.000 RPM (2.655 G) en verwijder supernatant.</li>
	<li>Voeg voorverwarmde sonde met een label van 37 °C toe aan de buis. Denature bij 95 °C in thermomixer, mengen bij 450 RPM, gedurende 10 min. Blijf gedurende 15 minuten bij 80 °C denatureren met voortdurend mengen. Incubeer bij 37 °C in thermomixer, met 450 RPM 's nachts mengen. Centrifugeer 5 min bij 5.000 RPM (2.655 x G). Verwijder supernatant.</li>
	<li>Wassen met Buffer A met 0,1% Triton gedurende 5 min. Centrifugeer 5 min bij 5.000 RPM (2.655 x G). Herhaal dit 2 keer. Breng drop van Prolong Anti-fade aan met DAPI.</li>
	<li>Pipet kernen/DAPI-oplossing voorzichtig uit (vermijd bubbels), breng aan op dia en dek af met een afdeklip.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Er zijn meerdere stappen cruciaal om DNA uit microdissecte polytene chromosoommonsters succesvol te versterken. Het protocol maakt gebruik van het gebruik van LCM, een methode die zowel de algehele efficiëntie verhoogt als de blootstelling aan vreemd DNA vermindert door de interactie van fysieke hulpmiddelen met het monster te verwijderen. De versterking van vreemd DNA is echter nog steeds de grootste potentiële valkuil van dit experiment. Daarom is het tijdens het hele proces essentieel om de monsters te beschermen tegen verontreiniging. Tijdens de diavoorbereidings- en microdissectiefasen is het essentieel om dissectienaalden, dia's, afdekstroken en de werkruimte te wassen.  Het wordt ook aangeraden om alle toepasselijke apparatuur (naalden, dia's, afdeklips) voor gebruik te UV-behandelen.
Het membraan op de dissectieglaasjes maakt het verspreiden van de chromosomen erg moeilijk.  Het is belangrijk om meer van de eierstok (half tot een volledig paar eierstokken) te gebruiken bij het maken van deze dia's, om een grotere kans te bieden op het vinden van een goed gespreide kern.  Het wordt ook aanbevolen om vers weefsel te gebruiken bij het maken van dia's, omdat de versterkingspercentages lijken te dalen naarmate weefsels 49 jaar oud worden en chromosoomverspreiding uitdagender wordt.  De voorbereiding van dia's voor microdissection is de meest tijdrovende stap in dit protocol.  Chromosomen moeten goed worden verspreid om onbedoelde verwerving van ongewenst materiaal te voorkomen.  Giemsa-kleuring stelt de gebruiker in staat om de verspreidingskwaliteit te controleren met een fasecontrastmicroscoop voordat het microdissectiesysteem wordt gebruikt.
De combinatie van microdissection en amplification biedt de mogelijkheid om chromosomale fragmenten te extraheren en te analyseren, variërend in grootte van kleine gebieden van belang tot een meerderheid van de armen.  Dit protocol stelt de gebruiker in staat om DNA te verkrijgen uit morfologisch verschillende gebieden zoals inversies, specifieke euchromatische banden en interbanden, telomerische, centromere en intercalaire heterochromatine. De gebruiker kan de gegenereerde schilderijsondes toepassen op het onderzoeken van afwijkende chromosomen, het bestuderen van inter-species homologie op bepaalde loci, of het karakteriseren van ruimtelijke organisatie van chromosomen in een intacte 3D-kern. Voor het ontwikkelen van chromosoomverven selecteerden we euchromatische segmenten om hybridisatie van repetitief DNA met meerdere chromosomale gebieden te voorkomen. Als gevolg hiervan hebben we armspecifiek schilderen verkregen zonder een concurrent te gebruiken, zoals totaal genomisch DNA of C0t-1 DNA-fractie.
We kozen ervoor om de GenomePlex WGA- en REPLI-G-kits te gebruiken op basis van beoordelingen die de efficiëntie en uitvalsnelheid van meerdere versterkingskits 40,44vergeleken.  Beide kits presteerden het beste onder de beschikbare methoden in beide uitvalpercentages (GenomePlex had een tarief van 12,5% in vergelijking met REPLI-g's 37,5%) en percentage versterkte markers (GenomePlex had een versterkingspercentage van 45,24% versus REPLI-g's 30,0%) 40. De GenomePlex-kit leverde ook een grotere hoeveelheid DNA en maakte het dus een betere kandidaat voor meerdere downstream-technieken.  Er is ook een re-amplificatiekit voor het GenomePlex-systeem beschikbaar, waardoor DNA verder kan worden versterkt. Het is echter belangrijk op te merken dat versterking niet perfect is.  De mogelijkheid blijft bestaan dat succesvolle versterking fouten kan veroorzaken of een voorkeur kan hebben voor specifieke loci in het doel-DNA. Het is belangrijk om de uiteindelijke fragmentgrootte van de beschikbare genoomversterkingsmethoden te overwegen.  GenomePlex-fragmentatie resulteert in een bibliotheek met fragmenten variërend van 200-500 bp, terwijl de REPLI-g-kit fragmenten produceert van ongeveer 10-20 kb groot. De beoogde downstream-toepassing van dit protocol is FISH, waardoor de GenomePlex-kit een meer haalbare optie is, omdat deze de gewenste fragmentgrootte en de mogelijkheid bood om DNA-fragmenten rechtstreeks via WGA te labelen. Lange DNA-moleculen geproduceerd door de REPLI-g-versterking moeten worden gefragmenteerd in de downstream nick-translation labeling reactie.
Dit protocol is aangepast om dna van een enkele polytene chromosoomarm met succes te versterken.  Andere protocollen vereisen het bundelen van veel (meestal 10-30) chromosoomfragmenten om het monster 7,11,28,40met succes te versterken .  Hoewel het bundelen van meerdere chromosomen mogelijk is met behulp van onze methode, benadrukt de verhoogde kans op monsterbesmetting het belang van het starten van het experiment met zo min mogelijk chromosomen. Als polytene chromosomen niet beschikbaar zijn, kan ons protocol worden aangepast voor gebruik in mitotische chromosomen. Het kan echter nodig zijn om 10-15 mitotische chromosomen te bundelen voordat ze worden versterkt voor succesvolle FISH 11. Versterkingsbias is lager bij grote hoeveelheden startsjabloon DNA 50. Polytene chromosomen leveren ongeveer 512 kopieën van een enkele DNA-sequentie en 1024 kopieën van twee homologe DNA-sequenties.  Het bundelen van mitotische chromosomen zal dus helpen om de algehele kwaliteit van dna-producten na versterking te verhogen.
Deze procedure heeft vele potentiële toepassingen in cytogenetische en genomische studies. Hier gebruikten we chromosoomverven om de correspondentie tussen euchromatische segmenten van polytene en mitotische chromosoomarmen in An. gambiaevast te stellen . Dezelfde schilderij sondes kunnen worden toegepast op cytogenetische karakterisering van An. gambiae cellijnen. Uitgebreide genomische herschikkingen en veranderingen in chromosoomnummers zijn gemeenschappelijke kenmerken van cellijnen 51,52. Aneuploïdie, polyploïdie en chromosomale herschikkingen zoals translocaties, inversies, deleties en ringchromosomen zijn gedetecteerd in verschillende muggencellijnen 53,54. Klassieke cytogenetische observaties 55 en fysieke mapping 56 hebben aangetoond dat chromosomale translocaties van de hele arm voorkomen in de evolutie van malariamuggen. Daarom kan microdissected materiaal worden gebruikt in combinatie met FISH-experimenten om homologie van chromosomale regio's tussen soorten te vergelijken. We hebben met succes 3D FISH uitgevoerd met de 2R-schilderende sonde op polytene chromosomen in hele berg eierstokverpleegkundige cellen. Deze methode zal het traceren van chromosoombanen vergemakkelijken en de nucleaire architectuur in Anophelesbestuderen . Technieken zoals DNA genotypering 57,58, next-generation genoom sequencing 26,27, fysieke en linkage kaart ontwikkeling, en generatie van sondes voor chromosoom schilderen 33,59 kunnen allemaal profiteren van arm- en regio-specifieke microdissection. Door LCM-technologie te combineren met het bevorderen van eencellige WGA, demonstreren we een efficiënte, praktische methode voor het produceren van redelijke hoeveelheden DNA uit een enkele polytene-chromosoomarm.

Chromosoomschilderen is een nuttige techniek voor het bestuderen van de evolutie van karyotypes 1-5 en voor het visualiseren van cytogenetische afwijkingen via hybridisatie van fluorescerend gelabeld chromosoom-DNA 1,6-8. Deze methode wordt ook toegepast op het bestuderen van de 3D-dynamiek van chromosoomgebieden in ontwikkeling 9 en pathologie 10. Differentieel gelabelde chromosoomverven worden gebruikt voor de visualisatie van individuele mitotische 11,12, meiotische 13,14, of interfase niet-polytene 15,16 en polytene 9,11,17 chromosomen. Een eenvoudig en robuust protocol om chromosoomverven te verkrijgen zou zeer nuttig zijn bij het uitbreiden van deze techniek naar niet-modelorganismen, zoals muggen. Het Anopheles gambiae complex is een groep van zeven morfologisch niet te onderscheiden muggen die variëren in gedrag en aanpassing, waaronder het vermogen om malaria over te brengen.  Deze muggen dienen als een uitstekend model om de evolutie van nauw verwante soorten die sterk verschillen in hun vectoriële capaciteit beter te begrijpen.  De meeste cytogenetische studies bij malariamuggen zijn gedaan met behulp van goed ontwikkelde, sterk gepolyteniseerde chromosomen (beoordeeld in 18,19). De leesbare banderollerenpatronen van polytene chromosomen stelden onderzoekers in staat om de associatie tussen polymorfe inversies en ecologische aanpassingen in Anopheles gambiae 20aan te tonen. Ook weefselspecifieke 21 en soortspecifieke 22 kenmerken van 3D-polytene-chromosoomorganisatie zijn gekarakteriseerd in het An. macullipennis-complex. Het bestuderen van mitotische chromosomen kan echter aanvullende belangrijke informatie opleveren. Bijvoorbeeld, een hoger niveau van heterochromatine polymorfisme waargenomen in mitotische chromosomen is gecorreleerd met verminderde paringsactiviteit en vruchtbaarheid in An. gambiae 23. De overeenstemming tussen euchromatische segmenten van polytene en mitotische chromosoomarmen kan moeilijk vast te stellen zijn door alleen hun relatieve lengtes te vergelijken. Dit komt omdat heterochromatine een aanzienlijk deel van de mitotische chromosomen uitmaakt, maar ondervertegenwoordigd is in polytene-chromosomen 24. De beschikbaarheid van chromosoomverven voor malariamuggen zou onderzoekers in staat stellen om cytogenetische studies aanzienlijk uit te breiden door extra soorten op te neemt, terwijl de kosten en tijd aanzienlijk worden verminderd in de analyses van karyotypische evolutie en 3D-dynamiek van chromosomen in deze groep epidemiologisch belangrijke insecten.
Om grote delen van chromosomen te verkrijgen, is microdissection een integrale techniek geworden om specifieke gebieden van belang van de chromosomale aanvulling te manipuleren en te isoleren.  In combinatie met whole genome amplification (WGA) resulteert microdissection in krachtige downstream toepassingen, waaronder FISH 11,12 en next-generation genome sequencing 25-27. Voorheen vereiste de techniek het gebruik van gespecialiseerde microdissectienaalden die handmatig moesten worden bediend door een ervaren gebruiker 28.  De vooruitgang van laser capture microdissection (LCM) heeft geresulteerd in een vereenvoudigd hulpmiddel dat beter geschikt is voor het isoleren van enkele cellen 29,30 of individuele chromosomen 31-33 met een verminderd risico op besmetting. Deze aanpak stelt de gebruiker in staat om de genetische heterogeniteiten en chromosomale afwijkingen te bestuderen die optreden in afzonderlijke cellen, in plaats van een consensuslandschap dat het resultaat is van het bundelen van meerdere cellen 34-36. Er zijn meerdere methoden gebruikt om het DNA van microdissection te versterken.  DOP-PCR, een techniek die nuttig is voor de versterking van zeer repetitieve sequenties, is gebruikt om microdissected chromosomen van soorten te versterken, waaronder de sprinkhaan 37, de stekelige paling 38, en de Nijl tilapia 39.  Meer recentelijk zijn de PCR-gebaseerde GenomePlex WGA4 Single Cell kit en multiple displacement amplification based (MDA) Repli-G Single Cell kit waardevolle tools geworden voor experimenten met genetische analyse van enkelvoudige menselijke cellen en chromosomen40-42, waaronder de B-chromosoomsystemen in sprinkhanen 37 en sprinkhanen 43. Deze twee kits hebben elk voor- en nadelen, maar hun schijnbare superioriteit ten opzichte van andere beschikbare versterkingssystemen is aangetoond 44.
De hoeveelheid DNA die kan worden verkregen uit een enkel chromosoom of een chromosoomsegment is aanzienlijk kleiner dan die van een hele kern. Daarom zijn microdissection, amplificatie en daaropvolgende analyse van een enkel chromosoom veel uitdagender, vooral bij organismen met kleine genomen zoals in Drosophila of Anopheles.  Hoewel verven zijn ontwikkeld uit enkele microdissected chromosomen van een mens 33 en een wesp 45, vereiste een succesvol FISH-experiment meerdere (ten minste 10-15) microdissected mitotische chromosomen van een fruitvlieg 11. Het vermogen om een enkel chromosoom te microdisectie en te versterken zou echter belangrijk zijn voor (i) het verminderen van de kans op besmetting met materiaal van een ander chromosoom, (ii) het minimaliseren van het aantal chromosomale preparaten dat nodig is voor microdissection, (iii) het verlagen van nucleotide en structureel polymorfisme van het microgedisseceerde monster in zowel FISH- als sequencing downstreamtoepassingen. Polytene chromosomen gevonden in veel Dipteran soorten bieden een unieke kans om een veel hogere starthoeveelheid DNA te verwerven. Ze bieden ook een hogere resolutie en chromosoomstructuur die niet kan worden bereikt door het gebruik van mitotische chromosomen. Deze toegevoegde resolutie kan van cruciaal belang zijn bij het visualiseren van chromosomale herschikkingen, chromatinestructuur en chromosomale segmenten die moeten worden gemicrodissecteerd 28,46.
Hier presenteren we een procedure om een euchromatisch segment efficiënt te isoleren van een enkele polytene chromosoomarm, het DNA te versterken en te gebruiken in downstream FISH-toepassingen bij malariamuggen.  Eerst passen we LCM toe om een enkele chromosoomarm te isoleren en te extraheren uit speciaal voorbereide membraanglijbanen. Ten tweede wordt WGA gebruikt om het DNA van het microdissected materiaal te versterken. Ten derde hybridiseren we het versterkte DNA in FISH-experimenten tot polytene squashpreparaten 47,metafase en interfasechromosoomdia's 48,evenals 3D-eierstokmonsters. Deze procedure is gedaan om met succes een meerderheid van de euchromatine te schilderen in chromosomale armen van An. gambiae.

<table><tbody><tr><td>Azijnzuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>A491-212</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Propionzuur&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td></td></tr><tr><td>Membran slides 1.0 PET</td><td>Zeiss</td><td>415190-9051-000</td><td></td></tr><tr><td>Buffer tablets &ldquo;GURR&rdquo;</td><td>Life Technologies</td><td>10582-013</td><td></td></tr><tr><td>KaryoMAX Giemsa Stain</td><td>Life Technologies</td><td>10092-013</td><td></td></tr><tr><td>ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System</td><td>Abbott Molecular</td><td>30-144110</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge vacuum concentrator</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td></td></tr><tr><td>Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-89</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific NanoDrop</td><td>Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>REPLI-g Single Cell Kit</td><td>Qiagen</td><td>150343</td><td></td></tr><tr><td>GenomePlex Single Cell Kit (WGA4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WGA4-10RXN</td><td></td></tr><tr><td>GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WGA3-50RXN</td><td></td></tr><tr><td>MZ6 Leica stereomicroscoop</td><td>Leica</td><td>VA-OM-E194-354</td><td>Een ander stereomicroscoop kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Olympus CX41 Fase Microscoop</td><td>Olympus</td><td>CX41RF-5</td><td>Een andere fase microscoop kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>22670000</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Invitrogen</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhardt&rsquo;s oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>99% Formamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP227500</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfate natriumzout</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC buffer</td><td>Invitrogen</td><td>AM9765</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagens met DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td><td>Fermentas</td><td>R0141, R0151, R0161, R0171</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA53022, PA55022</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>DNA polymerase I</td><td>Fermentas</td><td>EP0041</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Spermine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3256-1G</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3581</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396-25G</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-25G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Digitonine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>AdhesiveCap 500 clear</td><td>Zeiss</td><td>415190-9211-000</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Micro Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>Genomic DNA Clean and Concentrator Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4010</td><td></td></tr><tr><td>37% Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td></td></tr></tbody></table>

2d en 3d chromosoom schilderen in malaria muggen

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) van hele armchromosoomsondes is een robuuste techniek voor het in kaart brengen van genomic regio's van belang, het detecteren van chromosomale herschikkingen en het bestuderen van driedimensionale (3D) organisatie van chromosomen in de celkern. De komst van laser capture microdissection (LCM) en whole genome amplification (WGA) maakt het mogelijk om grote hoeveelheden DNA uit enkele cellen te verkrijgen. De verhoogde gevoeligheid van WGA-kits bracht ons ertoe om chromosoomverven te ontwikkelen en deze te gebruiken voor het verkennen van chromosoomorganisatie en evolutie in niet-modelorganismen. Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het isoleren en versterken van de euchromatische segmenten van enkele polytene chromosoomarmen uit eierstokverpleegkundige cellen van de Afrikaanse malariamug Anopheles gambiae. Deze procedure biedt een efficiënt platform voor het verkrijgen van chromosoomverven, terwijl het algehele risico op het introduceren van vreemd DNA in het monster wordt verminderd. Het gebruik van WGA maakt verschillende rondes van re-amplificatie mogelijk, wat resulteert in grote hoeveelheden DNA die kunnen worden gebruikt voor meerdere experimenten, waaronder 2D en 3D FISH. We hebben aangetoond dat de ontwikkelde chromosoomverven met succes kunnen worden gebruikt om de overeenstemming tussen euchromatische delen van polytene en mitotische chromosoomarmen in An. gambiaevast te stellen . Over het algemeen biedt de vereniging van LCM en WGA met één chromosoom een efficiënt instrument voor het creëren van aanzienlijke hoeveelheden doel-DNA voor toekomstige cytogenetische en genomische studies.

Figuur 1 beschrijft de algehele doorstroming van het protocol dat in dit artikel wordt beschreven.  De gebruiker begint in eerste instantie met het microdissecteren van chromosoom-DNA-monsters van membraanglijbanen.  Microdissected materiaal wordt geëxtraheerd en gezuiverd. Het gezuiverde DNA wordt vervolgens versterkt, opnieuw versterkt, gelabeld en vervolgens gebruikt voor FISH om chromosoomspreads te labelen.
Het LCM-protocol kan worden onderverdeeld in drie algemene stappen: 1) Het vinden van interessechromosomen en het voorbereiden van het snijgebied(figuur 2A),2) Het snijden en katapulteren van het chromosoomgebied van belang via laser(figuur 2B) en 3) Controleren of het monster daadwerkelijk in kleefdop wordt gekatapulteerd (figuur 2C). Het proces van LCM dat wordt gebruikt op de Polytene chromosomen van de An. gambiae Sua stam wordt getoond in Video 1. De video beschrijft het hele proces vanaf het opstarten van het programma, inclusief belangrijke softwarefuncties en tips.
GenomePlex- en REPLI-g eencellige WGA-kits die in dit protocol worden gebruikt, verschillen sterk in de resulterende productgrootte en de algehele opbrengst.  Figuur 3 toont de resultaten van gel-elektroforese voor de GenomePlex- en REPLI-g-kits, evenals kwantificering van de monsters door Nanodrop.
Microdissected materiaal is gebruikt om FISH-sondes te maken die zich richten op euchromatische gebieden van een chromosoom.  Figuur 4 toont FISH van vijf sondes gegenereerd uit microdissected materiaal op polytene chromosomen van An. gambiae.  Vier autosomale armen werden gelabeld met drie fluoroforen met behulp van de WGA3-kit: het 3R-chromosoom is gelabeld in groen (fluoresceïne), het 3L-chromosoom is in een mengsel van rood (Cy-3) en geel (Cy-5), het 2R-chromosoom is geel (Cy-5) en het 2L-chromosoom is rood (Cy-3). Het X-chromosoom werd in een apart experiment in oranje (Cy-3) geëtiketteerd met behulp van nick-vertaling van het REPLI-g-materiaal. Om de overeenstemming tussen euchromatische delen van polytene en mitotische chromosoomarmen vast te stellen, zijn chromosoomverven gehybridiseerd tot interfase-, profase-, prometafase- en metafasechromosomen van An. gambiae (figuur 5).  Om de 3D-organisatie van een enkele polytene chromosoomarm in de celkern te visualiseren, werd whole mount FISH uitgevoerd op An. gambiae Sua stam ovariële verpleegkundige cellen (Video 2).  Verschillende chromosoomarmgebieden zijn duidelijk te zien in kernen met interfase (figuur 5D) en polytene (Video 2) chromosomen.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig1.jpg"> Figuur 1. Schematische weergave van de experimentele procedures voor de bereiding van chromosoomverven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig2.jpg"> Figuur 2. De belangrijkste stappen in chromosoommicrodsectie. A) Laserondersteund snijden van het chromosomale gebied van belang door het membraan. B) Het membraan met een gat na het katapulteren wordt uitgevoerd. C) Het zicht op het gekatapulteerde stuk van het membraan met daarin een chromosoomsegment bevestigd aan de kleefdop. De pijl geeft de heterochromatine van het X-chromosoom aan die op de dia bleef. Het sterretje toont een stuk van een ander chromosoom dat op de dia bleef. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig3.jpg"> Figuur 3. Agarose gel afbeeldingen tonen DNA na WGA. A) Laag moleculair gewicht (200-500 bp) DNA van arm 3R na gebruik van de WGA4- en WGA3 GenomePlex-kits. B) Hoog moleculair gewicht (10-20 kb) DNA van arm 2L na REPLI-g versterking. De 100 bp ladder is te zien in de linker rijstroken. De onderstaande gelafbeeldingen tonen DNA-concentraties gemeten door Nanodrop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig4.jpg"> Figuur 4. Het schilderen van polytenechromosomen van eierstokverpleegkundigecellen van An. gambiae met behulp van vier sondes gegenereerd uit microdissected materiaal. Het X-chromosoom is gelabeld in oranje (Cy-3) door nick-vertaling van het REPLI-g-materiaal. De 2R-arm is geel gelabeld (Cy-5); de 2L-arm is rood (Cy-3); de 3R-arm is groen gelabeld (fluoresceïne); de 3L-arm is gelabeld in een mengsel van rood (Cy-3) en geel (Cy-5). Autosomen zijn gelabeld met de WGA3-versterkingskit. Chromatine is blauw gekleurd (DAPI). Chromosoomnamen worden geplaatst in de buurt van telomerische gebieden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51173/51173fig5.jpg"> Figuur 5. Het schilderen van interfase (A), profase (B), prometafase (C) en metafase (D) chromosomen van larvale imaginele schijven van de An. gambiae Mopti stam met behulp van drie sondes gegenereerd uit microdissected materiaal gelabeld door WGA3. De 2R-arm is gelabeld in groen (fluoresceïne); de 2L-arm is niet gelabeld; de 3R-arm is in roze, een mengsel van rood (Cy-3) en oranje (Cy-5); de 3L-arm is oranje gelabeld (Cy-5). Het X-chromosoom heeft een rood label dat overeenkomt met de 18S rDNA-sonde. Chromatine is blauw gekleurd (DAPI). Felgekleurde gebieden van chromosomen komen overeen met de heterochromatine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/51173fig5highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>
Video 1. Het proces van LCM van de An. gambiae polytene chromosomen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Sharakhov_video1.mp4" target="_blank">Klik hier om Video 1 te bekijken.</a>
Video 2. Hele mount 3D FISH uitgevoerd op An. gambiae eierstokverpleegkundige cellen. De sonde is gelabeld in Cy-3 (afgebeeld in blauw) en is gemaakt van een microdissected 2R chromosoomarm.  Chromatine is gekleurd met DAPI en wordt afgebeeld door cyaan pseudo-kleuring (lichtblauw). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51173/Video2.avi" target="_blank">Klik hier om Video 2 te bekijken.</a>

Chromosoomschilderen is een handige methode voor het bestuderen van de organisatie van de celkern en de evolutie van het karyotype. Hier demonstreren we een aanpak om specifieke interessegebieden te isoleren en te versterken van enkele polytene chromosomen die vervolgens worden gebruikt voor twee- en driedimensionale fluorescerende in situ hybridisatie (FISH).

2D en 3D Chromosoom schilderen in Malaria Muggen

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Het algemene doel van deze procedure is om voldoende DNA-amplicon te produceren uit een enkele micro-gedissecteerde polytane chromosoomarm om direct te gebruiken voor visexperimenten. Dit wordt bereikt door eerst polytane chromosoom-squashes voor te bereiden op speciaal ontworpen membraanplaatjes voor microdissectie. De tweede stap van de procedure is het isoleren en opvangen van individuele polytane chromosoomarmen middels laser-microdissectie.De derde stap is het isoleren van DNA uit het micro-gesectioneerde monster en het amplificeren van het DNA met behulp van twee ronden whole genome amplification. De laatste stappen bestaan uit het labelen van het geamplificeerde DNA en het gebruik hiervan in fish-experimenten. Uiteindelijk kunnen de resultaten leiden tot een ruime hoeveelheid fluorescent gelabeld DNA voor een regio van interesse.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals fish met backclones of PCR-fragmenten, is dat grote delen van chromosomen fluorescent kunnen worden gemarkeerd met deze gelabelde probes. Bovendien hoeft de sequentie van de chromosoomkleuringen niet bekend te zijn, aangezien deze mechanisch worden geïsoleerd uit intacte chromosoomarmen. Isoleer eerst de chromosomen, in dit geval uit de ovaria van ongeveer vijf muggen die zijn gefixeerd in een verse carnoise-oplossing.Zodra een goede chromosoomspreiding is bevestigd, worden de chromosomen platgemaakt door denaturatie, gevolgd door een koude incubatie gedurende de nacht. De volgende dag worden de chromosomen gedehydrateerd en gewassen ter voorbereiding op de microdissectie. Zorg ervoor dat de microdissectiemicroscoop met ethanol wordt gereinigd en dat handschoenen en buisjes met uv worden gesteriliseerd.Microdisseceer vervolgens de chromosomen volgens de secundaire video die in het tekstprotocol wordt verstrekt. Verzamel het DNA met behulp van een cogen-kit, met een aanpassing om een omgekeerde buis te kunnen gebruiken. Volg dit met kolomzuivering en elutie in water.Er zijn twee routes voor genoomamplificatie van een enkele chromosoomarm. De ley g-route biedt aanvankelijk een hogere opbrengst, maar vereist NIC-translatie om het DNA te labelen. De genome plex-route heeft het voordeel dat meerdere replicatieronden mogelijk zijn, evenals directe labeling van de uiteindelijke probes.Zorg voor de meest steriele omstandigheden mogelijk, aangezien amplificatie van contaminanten zeer waarschijnlijk is. Voor de genome plex root: laat eerst de single cell WGA four kit de eerste batch geamplificeerd DNA produceren. Zuiver vervolgens het DNA met de genome clean and concentrator kit.Vergeet niet het gewassen DNA te elueren met water en niet met TE-buffer. Ten derde moet het DNA worden gereïficeerd en ten vierde gelabeld voor beide vissenstappen. Gebruik de WGA three re amplification kit.Het labelen van het DNA vereist het gebruik van een speciale dNTP-mix die een specifieke verhouding nucleotiden bevat, samen met het gelabelde dUTP. Bij het uitvoeren van de rege-kit gebruikte root eerst hun single cell WGA-kit met vers gesteriliseerd water en onlangs bereide D two-buffer. Volg vervolgens het NIC-translatieprotocol om het geamplificeerde DNA te labelen.Controleer zeker de grootte van het DNA-fragment op een gel. De fragmenten moeten ongeveer 200 tot 500 basenparen groot zijn. Om af te sluiten, precipiteer het gelabelde DNA met ethanol en centrifugeer de probe bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Laat het teruggewonnen pellet vervolgens aan de lucht drogen en voeg 40 µL hybridisatiebuffer toe. Bereid vooraf objectglazen voor met vierkante wandjes van nagellak waarop de dekglasjes kunnen rusten, zodat de kernen niet door het dekglasje worden platgedrukt. Dissekeer nu verse eierstokken uit Christopher's stage three half grave vrouwelijke muggen.Breng de eierstokken over naar een buis met 150 tot 250 µL buffer, met toevoeging van 0,5% digitonine in de buis. Gebruik een grote dissectienaald om de folliculaire membranen te vernietigen. Vortex de buis vervolgens gedurende vijf tot 10 minuten om de follikels verder te beschadigen.Schraap alle grote folliculaire fragmenten los en centrifugeer de buis gedurende 30 seconden bij een lage snelheid, ongeveer 500 RPM. Overbreng de supernatanten naar een nieuwe buis en voeg 100 µL buffer A toe aan de oorspronkelijke buis met de opgebroken follikels. Herhaal nu de stappen voor kernisolatie op de opgebroken follikels totdat het zichtbare weefsel slechts uit kleine partikels bestaat.Verzamel al het supernatant in dezelfde buis, aangezien deze grotendeels uit kernen zullen bestaan. Centrifugeer vervolgens de buis met het supernatant en de buis met het resterende weefsel, dat als voorzorg wordt verwerkt. Verwijder het supernatant en voeg 200 µL buffer A met 0,1% Triton toe. Vortex de buizen krachtig totdat de pellets zijn opgelost en incubeer de monsters vervolgens gedurende de nacht bij vier °C.Centrifuge de buizen de volgende dag gedurende vijf minuten bij 10.000 RPM, verwijder de supernatanten en voeg 200 µL 4% paraformaldehyde in PBS toe. Incubeer de buizen vervolgens 30 minuten in een thermomixer bij 450 RPM. Verwijder het fixatief door vijf minuten te centrifugeren bij 5.000 RPM, waarna de supernatanten worden weggegooid.Voeg vervolgens buffer A met 0,1% Triton toe en incubeer de buisjes vijf minuten in een thermomixer bij 450 RPM; centrifugeer de cellen vervolgens nog eens vijf minuten bij 5.000 RPM. Zorg dat de gelabelde probe voorbehandeld is en is opgewarmd tot 37 °C. Wanneer de cellen zijn gepelleteerd, wordt het supernatant vervangen door ten minste 20 µL van de gelabelde probe.Maak u geen zorgen over de concentratie. Denatureer vervolgens het DNA bij 95 °C in de Thermo mixer bij 450 RPM gedurende 10 minuten en zet de denaturatie voort bij 80 °C gedurende 15 minuten onder constant mengen. Verlaag daarna de temperatuur naar 37 °C en laat het monster gedurende de nacht mengen.Herstel de volgende dag de kernen door vijf minuten te centrifugeren bij 5.000 RPM (2.655 G). Vervang de supernatant door een wasbeurt met buffer die 0,1% tritton bevat. Laat de cellen vijf minuten wassen onder agitatie bij ongeveer 500 RPM op kamertemperatuur.Verwijder het wasmiddel met een volgende centrifugatie en herhaal het wasproces nog twee keer. Resuspendeer de kernen na het verwijderen van de derde wasbeurt direct in een druppel Prolong anti-fade met DPI. Sluit af door de kernen voorzichtig, zonder luchtbellen te vormen, over te brengen naar een voorbereid objectglas en breng een dekglas aan voor genome plex en ee.Single cell WGA-kits werden beide gebruikt zoals beschreven op muggenweefsel. Het resulterende DNA werd vergeleken via gelelektroforese. De opbrengst varieerde duidelijk aanzienlijk en dit werd ook via spectroscopie bevestigd.FISH werd uitgevoerd met vijf probes voor micro-gedissecteerd materiaal op polytene chromosomen van muggen. Vier autosomen werden gelabeld met drie fluoroforen met behulp van de WGA three kit. Het 3R-chromosoom is gelabeld met groen fluoresceïne.Het drie L-chromosoom bevindt zich in een mengsel van rood en geel. Het twee R-chromosoom is geel en het twee L-chromosoom is rood. Het X-chromosoom werd oranje gelabeld met behulp van NIC-translatie van het ley G-materiaal en een apart experiment om de correspondentie vast te stellen tussen de chromatische delen van de polytene en mitotische chromosoomarmen.Chromosoomkleuringen werden gehybridiseerd met interfasechromosomen. De rechterarm van chromosoom 2 is groen gelabeld. De rechterarm van chromosoom 3 is roze, en de linkerarm van chromosoom 3 is oranje gelabeld.Chromatine is blauw gekleurd door DPI en profasechromosomen werden waargenomen. Het X-chromosoom heeft een rode label die overeenkomt met de 18 S-R-D-N-A-sonde. Vervolgens werden prometafasechromosomen bekeken. Ook metafasechromosomen werden aangetroffen.De helder blauw gekleurde regio's komen overeen met heterochromatine om de 3D-organisatie van een enkele polytane chromosoomarm in de celkern te visualiseren. De hele-mount techniek voor vissen werd uitgevoerd op de sue-stam. De territoria van de chromosoomarmen in de eierstok-voedselcellen van muggen zijn duidelijk zichtbaar op de polytane chromosomen.Hetzelfde geldt voor de verschillende territoria van de chromosoomarmen, die duidelijk zichtbaar zijn in kernen in de interfase. Tijdens deze procedure is het belangrijk om alle stappen uit te voeren met oog op het risico op contaminatie. Het is zeer eenvoudig om de monsters te contamineren, wat leidt tot een lage amplificatieopbrengst van het beoogde DNA.

2d-and-3d-chromosome-painting-in-malaria-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Zodra een gen is geïdentificeerd als potentieel vuurvaste voor malaria, dient te worden geëvalueerd voor zijn rol in het voorkomen van Plasmodium besmettingen binnen de mug. Dit protocol illustreert hoe de mate van plasmodium infecties van muggen kunnen worden getest. De technieken voor de voorbereiding van de gametocyt cultuur, membraan voeden muggen menselijk bloed, en het testen van virale titers in de mug middendarm worden gedemonstreerd.

Protocol voor Plasmodium falciparum Infecties in Muggen en Infection Fenotype Bepaling

Genetische kruisen van knaagdieren malariaparasieten worden uitgevoerd door het voeren van twee genetisch verschillende parasieten aan muggen. Recombinant nakomelingen zijn gekloond van muizen bloed na waardoor muggen om geïnfecteerde muizen bijten. Deze video laat zien hoe de productie van genetisch kruisen...

Protocol voor de productie van een genetische Kruis van het knaagdieren malariaparasieten

Genoomassemblages op basis van massaal parallelle DNA-sequencingtechnologieën zijn doorgaans sterk gefragmenteerd. De ontwikkeling van fysieke chromosoomkaarten kan genoomassemblages potentieel verbeteren. Hier demonstreren we innovatieve benaderingen voor chromosoompreparatie, fluorescentie in situ hybridisatie en imaging die de doorvoer van de ontwikkeling van de fysieke kaart aanzienlijk verhogen.

High-throughput Fysische in kaart brengen van Chromosomen met Automatisch<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Fluorescerende<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie op Mitotische Chromosomen van muggen

This video demonstrates the generation of an experimental mouse model of cerebral malaria. Sporozoites isolated from Plasmodium berghei-infected female mosquitoes are injected into a restrained mouse's tail veins, leading to blood-brain barrier disruption and brain inflammation, causing cerebral malaria. This infected mouse model offers a valuable tool to study in vivo microvascular pathology associated with cerebral malaria.

Generation of a Mouse Model of Experimental Cerebral Malaria Using Host Mosquito-Derived Sporozoites

Muggen die malaria overdragen, hebben een aantal epidemiologisch belangrijke kenmerken die alleen kunnen worden gedetecteerd met behulp van moleculaire technieken. Door gebruik te maken van een MALDI-TOF-gebaseerde SNP-genotyperingsplatform, hebben we een test ontwikkeld voor het gelijktijdig detecteren van meerdere belangrijke eigenschappen (soorten, insecticideresistentie, parasietinfectie en gastheukeuze) van malariavectoren.

Een Multi-detectie test voor Malaria Zenden Muggen

We beschrijven een muismodel van experimentele cerebrale malaria en laten zien hoe inflammatoire en microvasculaire pathologie in vivo kunnen worden gevolgd met behulp van magnetische resonantie beeldvorming.

In vivo Tracking van Oedema Ontwikkeling En Microvasculaire Patologie In Een Model Van Experimentele Cerebrale Malaria Met Magnetic Resonance Imaging

Als gevolg van de opvallende gelijkenissen van de levenscyclus en de biologie van knaagdieren malariaparasieten voor menselijke malariaparasieten, knaagdieren malaria modellen zijn onmisbaar geworden voor malaria onderzoek. Hierin hebben we enkele van de belangrijkste technieken gestandaardiseerd die worden gebruikt in de fenotypische analyse van wild-type en transgene knaagdier malaria soorten.

Fenotypische analyse van knaagdieren malaria parasiet asexual en seksuele bloed stadia en muggen stadia

Het protocol beschrijft hoe locatiegerichte modificaties in het genoom van Anopheles malariamuggen kunnen worden bereikt met behulp van het φC31-systeem . De beschreven modificaties omvatten zowel de integratie als de uitwisseling van transgene cassettes in het genoom van attP-dragende koppelingslijnen.

Site-Directed φC31-gemedieerde integratie en cassette-uitwisseling in Anopheles Vectors of Malaria

Gezien hun eenvoudige anatomie bieden Anopheles-testikels een goed cytologisch model voor het bestuderen van spermatogenese. Dit protocol beschrijft whole-mount fluorescentie in situ hybridisatie, een techniek die wordt gebruikt om dit biologische proces te onderzoeken, evenals het fenotype van transgene stammen die mutaties herbergen in de genen die betrokken zijn bij de productie van sperma.

Whole-Mount Fluorescentie In Situ Hybridisatie om Spermatogenese in de Anopheles-mug te bestuderen

Chemische genetica omvat de vervanging van een poortwachterresidu door een aminozuur dat een andere zijketen bevat op de doellocus. Hier hebben we een mutante parasiet gegenereerd die een hypomorf allel van cdpk1 bevat en compenserende routes geïdentificeerd die door de parasiet in de mutante achtergrond zijn aangenomen.

Inzicht in de ontwikkeling van compenserende routes in een mutante malariaparasiet die een hypomorf allel van plantachtige kinasen herbergt

Leer chromosoomschildering in 2D en 3D voor celbiologisch onderzoek bij malariamuggen. Deze methode combineert laser-microdissectie met FISH om chromosoomterritoria zichtbaar te maken zonder voorafgaande sequentiekennis.

2D en 3D Chromosoom schilderen in Malaria Muggen

Meer video's verkennen