Het bepalen van de IJsbindende Vlakken van Antivries eiwitten door Fluorescentie-gebaseerde Ice Plane Affiniteit

Het algemene doel van het volgende experiment is om de ijsvlakken te visualiseren die worden begrensd door fluorescent gelabelde antivrieseiwitten. Dit wordt bereikt door het laten groeien van enkele ijskristallen waaraan de antivrieseiwitten zich als tweede stap kunnen binden. Elke kristal wordt bekeken door middel van gekruiste polarisatoren om zijn singulariteit en oriëntatie vast te stellen.

Vervolgens wordt een ijskristal op een temperatuur gecontroleerde koude vinger gemonteerd en gevormd tot een halfronde. Het wordt vervolgens ondergedompeld in een oplossing van fluorescent gelabelde antivrieseiwitten om het antivrieseiwit op specifieke bindingsvlakken van de groeiende halfronde te absorberen. Ijsresultaten worden verkregen door ijs gebonden door fluorescent gelabelde antivrieseiwitten te visualiseren en te beeldvormen, met behulp van golflengte specifiek licht en filters in een verduisterde koude kamer.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals ijs etsen, is dat de antivrieseiwitten fluorescent gelabeld zijn Om onmiddellijke visualisatie van de eiwit gebonden ijsvlakken mogelijk te maken. Begin met het kweken van kristallen door een temperatuur gecontroleerd ethyleenglycolbad voor te bereiden bij min 0,5 graden Celsius en een schone metalen pan te vinden die er in past en erop kan drijven. De kristallen worden gevormd in mallen. Gebruik cilindrische mallen van drie tot vier centimeter hoog, gesneden uit een polyvinylchloride pijp.

Elke mal moet een een millimeter brede, twee millimeter hoge inkeping aan één kant hebben. Breng een lichte laag vacuümvet aan op de zijkant van de ring waar de inkeping is gesneden. Verzegeld deze ingevetde gekartelde oppervlakte op de metalen pan met de inkeping gericht weg van het midden van de pan.

Zorg ervoor dat de inkepingen niet met vet worden gevuld of geblokkeerd. Bereid zoveel mallen voor als er in de pan passen. Voeg vervolgens gefilterd Degas en gedeïoniseerd water toe aan het midden van de pan buiten de mallen.

Pas op dat u geen luchtbellen introduceert. Terwijl de waterlaag naar vijf millimeter wordt verhoogd, zou het water langzaam de mallen moeten binnendringen via de inkepingen. Wanneer dit klaar is, plaatst u de pan perfect vlak in het ethyleenglycolbad.

Nadat de pan en het water min 0,5 graden Celsius hebben bereikt, voegt u een klein stukje ijs toe aan het midden van de pan buiten de mallen. Incubeer een nacht om een laag ijs te vormen over de komende drie dagen. Keer terug naar het bad om water aan de mallen toe te voegen.

Deponeer 13 milliliter vier graden Celsius, Degas en gedeïoniseerd water in elke mal. Een keer per dag na het toevoegen van het water, verlaag de temperatuur van het ethyleenglycolbad. Tegen de vierde dag zouden de mallen volledig gevuld moeten zijn met ijs.

Haal de mallen op en bereid een schone oppervlakte voor het ijs. Trek elke mal van de pan en duw het ijskristal eruit. Plaats de schone oppervlakte met de mallen een uur lang in een min 20 graden Celsius vriezer.

Voor het hanteren. Wanneer het ijs klaar is, brengt u het naar een vrieskamer of koude kamer om te bepalen of het een enkel kristal is. Plaats het ijs tussen twee gekruiste polarisatoren.

Als het ijs een enkel kristal is, zouden er geen scheuren of ononderbrokenheden zichtbaar moeten zijn en de lichtrichting zou binnen het kristal niet mogen veranderen. Met de polarisator nog steeds op zijn plaats, bepaal de oriëntatie van de C-as door het licht te observeren dat wordt overgedragen wanneer het ijs wordt geroteerd. Om de oriëntatie van de A AEs te bepalen, wikkel het ijs strak in aluminiumfolie.

Richt een naald loodrecht op de zee-as en prik een klein gaatje door de folie en in het ijs. Plaats vervolgens het ijs gedurende 20 minuten in een vacuüm van 0,5 milibar. Zodra het kristal is opgehaald, ontdekt u het in de koude kamer.

Observeer het hexagonale ets op het basale vlak. De A AEs lopen door de hoekpunten van de zespuntige ster. Dit kristal zal in tweeën worden gesneden langs een lijn parallel aan tegenoverliggende punten op de ster.

Om een primair prismavlak bloot te leggen, houd het kristal stevig vast op een werkbank. Gebruik een decoupeerzaag om het kristal doormidden te snijden. Verzamel de stukken voor montage op een koude vinger.

Het ijskristal moet verder worden voorbereid voor montage op een koude vinger, zoek twee aluminium staven met iets verschillende diameters, maar vergelijkbaar in grootte met de koude vinger. Gebruik de staven om een holte in de bovenkant van het kristal te smelten, stop wanneer er een holte is waarin de koude vinger past. Koel de koude vinger af tot min 0,5 graden Celsius en plaats deze in de ijsholte.

Houd het kristal op zijn plaats totdat het aan het metaal bevriest. Vul vervolgens een halfronde beker met ongeveer tweemaal de diameter van het ijskristal met gefilterd gedeïoniseerd water gekoeld tot vier graden Celsius. Dompel het ijskristal gebonden aan de koude vinger in de beker, verwijder overtollig water zodat de bovenkant van het ijskristal ongeveer op gelijke hoogte is met de vloeistof en het ijs niet raakt.

De bekerwanden bedekken de beker met isolatie en verlagen de temperatuur tot min vijf graden Celsius. Laat het ijs ongeveer een uur lang een halfronde vormen. Bereid u voor om het fluorescente eiwit toe te voegen.

Wanneer de halfrond klaar is. Verwijder het ijskristal uit de beker, verwijder water uit de beker. Voeg vervolgens 25 tot 30 milliliter voorgekoelde fluorescent gelabelde eiwit oplossing toe op de gewenste concentratie.

Terwijl het totale vloeistofvolume onveranderd blijft, dompel het ijskristal weer in de beker. Zorg er weer voor dat de bovenkant van het kristal op gelijke hoogte is met de vloeistof en niet tegen de bekerwanden aanraakt. Laat de temperatuur van de koude vinger zakken tot min acht graden Celsius en laat de eiwit oplossing gedurende