Name: Het bepalen van de IJsbindende Vlakken van Antivries eiwitten door Fluorescentie-gebaseerde Ice Plane Affiniteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-15T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Leer hoe je fluorescerend gelabelde antivrieseiwitten visualiseert op ijskristallen met behulp van fluorescentie-gebaseerde ijsvlakaffiniteitsanalyse. Deze methode onthult bindingsmechanismen en structurele kenmerken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

PLD bekleedt de Canada Research Chair in Protein Engineering. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de Canadian Institutes of Health Research aan PLD. Dit werk werd ook ondersteund door een Grant-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek van de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (nr. 23310171) en van de Japan Bio-oriented Technology Research Advancement Institution (BRAIN). We zijn Drs. Chris Marshall en Mike Kuiper dankbaar voor het pionierswerk dat heeft geleid tot FIPA. We zijn dr. Sakae Tsuda ook dankbaar voor het leveren van faciliteiten voor een deel van dit werk en aan Dr. Laurie Graham voor het opzetten van de fluorescerende lichtopwekkers en emissiefilters.

1. Het kweken van Enkele Ijskristallen
<ol><li>Neem een schone metalen pan (15 cm diameter, 4,5 cm hoog) die in een koelbad met ethyleenglycol past en erop kan drijven.</li>
	<li>Bereid polyvinylchloride (PVC) cilindrische mallen (4,5 cm diameter, 3-4 cm hoog, 4 mm dik), door secties uit een pijp te zagen.<ol>
<li>Snijd een inkeping (1 mm breed, 2 mm hoog) aan één kant (afbeelding 1A).</li>
		<li>Bereid zoveel mogelijk mallen die comfortabel in de pan passen (figuur 1B). Opmerking: Een studie toonde aan dat polyvinylalcohol (PVA) ijskernen kan beïnvloeden22. In ons pvc-systeem met open schimmels zijn we echter geen problemen met atypische ijsvorming tegengekomen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Breng een lichte film vacuümvet aan op de onderste oppervlaktering van elke mal, het oppervlak met de inkeping uitgesneden. Sluit dit ingevette, gekerfde oppervlak af op een metalen pan met de inkepingen weg van het midden van de pan. Zorg ervoor dat u de inkepingen niet met vet vult of belemmert.</li>
	<li>Voeg 0,22 μm gefilterd en ontgast/gedeioneerd water toe aan het midden van de pan, maar buiten de mallen, en laat het water langzaam in de mallen komen via de inkepingen. Zorg ervoor dat u geen bubbels introduceert. De waterlaag moet ongeveer 5 mm diep zijn.</li>
	<li>Plaats de pan in een temperatuurgestuurd ethyleenglycolbad gekoeld tot -0,5 °C. De pan moet perfect waterpas staan. Voeg indien nodig ballastgewichten toe aan de zijkanten van de pan.</li>
	<li>Nadat de pan en het water -0,5 °C hebben bereikt, voegt u een klein stukje ijs toe aan het midden van de pan, buiten de mallen.<ol>
<li>Dit zal de ijsgroei in het onderkoelde water over de pan en in de mallen kernen. De kleine inkeping aan de onderkant van elke mal zorgt ervoor dat slechts één ijskristal zich kan voortplanten, wat resulteert in een enkel ijskristal in elke mal.</li>
		<li>Incubeer 's nachts om een laag ijs te vormen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg in de komende drie dagen eenmaal daags 13 ml ontgast/gedeioneerd water van 4 °C toe aan elke mal en laat de temperatuur van het ethyleenglycolbad na elke toevoeging dalen tot -0,8 °C op dag één, tot -1,1 °C op dag twee en tot -1,5 °C op dag drie.<ol>
<li>Incubeer 's nachts bij die temperaturen.</li>
		<li>Op dag vier moeten de mallen volledig gevuld zijn met ijs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trek de mallen van de pan, duw de ijskristallen uit de mallen en bewaar ze op een schoon oppervlak, zoals een weegboot, ongeveer 1 uur in een vriezer van -20 °C voordat u ze gebruikt.</li>
	<li>In plaats van veel kleine enkele ijskristallen te bereiden, kan een groot enkel ijskristal van enkele liters in volume worden bereid in een incubator met constante temperatuur zoals beschreven door Knight23. Het grote ijskristal kan een jaar of langer worden bewaard als het bedekt wordt gehouden in een vriezer van -15 tot -20 °C. Delen van enkel kristal kunnen naar wens met een zaag uit het ijsblok worden gesneden.</li>
</ol>2. Singulariteit en oriëntatie van het ijskristal bepalen
<ol><li>Bepaal of het ijs dat uit de mal wordt verdreven een enkel kristal is door in een vriesruimte te observeren, tussen twee gekruiste polaroïden (figuur 1D).<ol>
<li>Als het ijskristal enkelvoudig is, mogen er geen scheuren of discontinuïteiten worden gezien en mag de lichtrichting in het ijskristal niet veranderen. Opmerking: Als er geen vriesruimte beschikbaar is, kan in plaats daarvan een koelruimte worden gebruikt in alle vereiste stappen, waarbij u voorzichtig bent om snel te werken en spaarzaam met het ijs om te gaan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Door de ijsbirefringentie kan men tegelijkertijd de oriëntatie van de c-asbepalen. Gebruik de volgende informatie om de oriëntatie te bepalen:<ol>
<li>Wanneer de c-asprecies evenwijdig is aan het invallende licht, zal er in theorie geen licht door de gekruiste polaroïden gaan. Als het invallende licht iets parallel met de c-aswordt betiteld, wordt een uniform veelkleurig spectrum van licht door het kristal overgebracht wanneer het tussen de gekruiste polaroïden wordt gedraaid. Deze uniforme transmissie ontstaat door de optische inactiviteit van ijs Ih langs zijn c-as24. Het basale vlak van het ijskristal is normaal voor de c-as.</li>
		<li>Wanneer de c-asverder van parallel aan het invallende licht is en het ijskristal tussen de gekruiste polaroids wordt gedraaid, wisselt het overgedragen licht af tussen 0-100% overdracht met elke 90° rotatie van het kristal.</li>
		<li>Meestal zal de c-asnormaal zijn voor het cirkelvormige vlak van het cilindrische ijskristal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bepaal de oriëntatie van de a-assendoor ijsputjes 25 die wordt gedaan door het ijskristal stevig in aluminiumfolie te wikkelen, een klein gaatje met een naald door de folie in het ijs op het basale vlak te steken (normaal voor de c-as)en het gedurende 20 minuten onder vacuüm te plaatsen.<ol>
<li>Deze behandeling zal een ets met zeshoekige symmetrie op het basale vlak produceren, waarbij de a-assendoor de hoekpunten van de zeszijdige ster lopen (figuur 2A).</li>
		<li>Indien gewenst kan het ijskristal worden gesneden met een zaag parallel of loodrecht op één kant van de zeshoek om het te monteren met een primair of secundair prismavlak loodrecht op de koude vinger (figuur 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Adsorptie van fluorescerend gelabelde antivrieseiwitten tot een enkel ijskristal
<ol><li>Monteer een enkel ijskristal op de koude vinger (figuur 1C) door eerst een holte in de bovenkant van het kristal te boren. Om dit te doen, wisselt u het smelten van het ijs af met twee aluminium staven met een iets andere diameter, maar vergelijkbaar met de diameter van de koude vinger, om de holte te vormen waarin de koude vinger kan passen.</li>
	<li>Koel de koude vinger af tot -0,5 °C, plaats deze in de ijsholte en houd het ijskristal op zijn plaats totdat het bevriest tot het metaal bevriest (afbeelding 2B). Vermijd luchtbellen bij het bevestigen van het kristal aan de vinger, omdat ze een efficiënte overdracht van warmte van de vinger naar de staaf belemmeren.</li>
	<li>Vul een hemisferische beker met een diameter van ongeveer twee keer de diameter van het ijskristal met gefilterd gedeïoniseerd water of buffer, gekoeld tot ongeveer 4 °C. Dompel het koude vingergebonden ijskristal onder in de beker en verwijder overtollig water of buffer zodanig dat de bovenkant van het ijskristal ongeveer waterpas staat met de vloeistoflaag en het ijs de bekerwanden niet raakt.<ol>
<li>Bedek de beker met isolatie en verlaag de temperatuur tot -5 °C.</li>
		<li>Wacht ongeveer 1 uur tot het ijskristal zich vormt tot een halfrond en controleer de status ongeveer elke 20 minuten (figuur 2C).</li>
		<li>Het ijs zal de vorm aannemen van de hemisferische beker door het smelten en laten groeien van het ijskristal, maar het mag nooit overgroeien om de bekerwanden aan te raken. Er moet minstens 1 cm opening zijn tussen de muur en de hemisfeer en de koude vinger mag niet uit het ijs steken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder de beker uit het ijskristal en voeg de fluorescerende eiwitoplossing toe aan een eindvolume van 25-30 ml en de gewenste analyseconcentratie, waarbij u voorzichtig moet zijn om het totale vloeibare volume in de beker ongewijzigd te houden. Een typische AFP-concentratie is 0,1 mg/ml.<ol>
<li>Breng het ijskristal opnieuw in de beker zodat de bovenkant van het ijskristal op niveau is met de vloeistof en het ijskristal de bekerwanden niet raakt (afbeelding 2D).</li>
		<li>Laat de koude vingertemperatuur zakken tot -8 °C en laat de eiwitoplossing 2-3 uur invriezen in het ijskristal, waardoor de oplossing vaak wordt geroerd. Het ijs gevormd uit de eiwitoplossing moet ten minste 5 mm zijn voordat de ijsgroei wordt gestopt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder het ijskristal uit de beker terwijl het nog aan de koude vinger is bevestigd. Maak het ijs los van het laatste door het koelmiddel via de koude vinger op te warmen tot net boven 0 °C en wacht tot het ijskristal smelt.</li>
	<li>Plaats de kristalvlakte kant naar beneden op een schoon oppervlak, zoals een weegschaal, en zorg ervoor dat u het nieuw gevormde ijs niet aanraakt en bewaar het ten minste 20 minuten bij -20 °C voordat u het inlevert.</li>
</ol>4. Visualisatie van antivries-eiwitgebonden ijsvlakken
<ol><li>Visualisatie van fluorescentie gebeurt in een verduisterde vriezer of koude kamer, door de ijskristal platte kant naar beneden te plaatsen onder lampen met golflengtespecifieke excitatiefilters om het fluorescerende label en camera-emissiefilters te prikkelen om ander niet-specifiek licht te blokkeren. Op basis van het patroon kunnen de ijsvlakken die door ASP's zijn gebonden, worden geschat (figuur 4).</li>
	<li>Als golflengtespecifieke lichten niet beschikbaar zijn, kan in plaats daarvan een UV-lichtbak worden gebruikt.</li>
	<li>Traditionele ijs etsen kunnen ook eenvoudig worden uitgevoerd door de ijshelft gedurende ten minste 3 uur te laten sublimeren bij -20 °C, waarna resteiwitpoeder zichtbaar kan worden op het ijsoppervlak (figuur 5).</li>
	<li>Stap 2.3 kan worden herhaald om de oriëntatie van de a-assenvan de voltooide ijshelft te bepalen.</li>
</ol>

<ol><li>Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifreeze+peptides+and+glycopeptides+in+cold-water+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes.</a> Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).</li>
<li>Sidebottom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytochemistry+-+heat-stable+antifreeze+protein+from+grass%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phytochemistry - heat-stable antifreeze protein from grass.</a> Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).</li>
<li>Tomczak, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+stabilization+of+membranes+at+low+temperatures+by+an+antifreeze+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein.</a> Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).</li>
<li>Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+Ca-dependent+antifreeze+protein+in+an+antarctic+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Hyperactive Ca-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium.</a> FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).</li>
<li>Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anchored+clathrate+waters+bind+antifreeze+proteins+to+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).</li>
<li>Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+a+bacterial+antifreeze+protein+as+an+adhesin+with+ice-binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity.</a> Plos One. 7 (11), (2012).</li>
<li>Raymond, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algal+ice-binding+proteins+change+the+structure+of+sea+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).</li>
<li>Raymond, J. A., Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+inhibition+as+a+mechanism+of+freezing+resistance+in+polar+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).</li>
<li>Baardsnes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+ice-binding+face+for+type+i+antifreeze+protein%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">New ice-binding face for type i antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).</li>
<li>Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+ice-binding+face+of+a+plant+antifreeze+protein%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).</li>
<li>Garnham, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compound+ice-binding+site+of+an+antifreeze+protein+revealed+by+mutagenesis+and+fluorescent+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging.</a> Biochemistry. 49 (42), 9063-9071 (2010).</li>
<li>Nutt, D. R., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+function+of+the+hydration+layer+around+an+antifreeze+protein+revealed+by+atomistic+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).</li>
<li>Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+alpha-helical+antifreeze+peptides+on+specific+ice+crystal-surface+planes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes.</a> Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).</li>
<li>Antson, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+mechanism+of+ice+binding+by+type+iii+antifreeze+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins.</a> J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).</li>
<li>Graether, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-helix+structure+and+ice-binding+properties+of+a+hyperactive+antifreeze+protein+from+an+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect.</a> Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).</li>
<li>Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+spruce+budworm+antifreeze+protein+interacting+with+ice+crystals%3A+Basal+plane+affinity+confers+hyperactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity.</a> Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).</li>
<li>Middleton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifreeze+protein+from+freeze-tolerant+grass+has+a+beta-roll+fold+with+an+irregularly+structured+ice-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site.</a> J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).</li>
<li>Scotter, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basis+for+hyperactivity+of+antifreeze+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">The basis for hyperactivity of antifreeze proteins.</a> Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).</li>
<li>Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+biomolecules+to+ice+and+their+effects+upon+ice+growth.+1.+Measuring+adsorption+orientations+and+initial+results%5BTitle%5D)+AND+%22Crys.+Growth+Des%22%5BJournal%5D)">Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results.</a> Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).</li>
<li>Hakim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+an+insect+antifreeze+protein+and+its+implications+for+ice+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding.</a> J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).</li>
<li>Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+naturally+inactive+isoform+of+type+iii+antifreeze+protein+into+one+that+can+stop+the+growth+of+ice%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice.</a> FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).</li>
<li>Holt, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+antifreeze+proteins+and+poly%28vinyl+alcohol%29+on+the+nucleation+of+ice%3A+A+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Letters%22%5BJournal%5D)">The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study.</a> Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).</li>
<li>Knight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+growing+large%2C+optically+%27%27perfect%27%27+ice+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Glac%22%5BJournal%5D)">A simple technique for growing large, optically ''perfect'' ice crystals.</a> J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).</li>
<li>Hobbs, P. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHobbs%2C+PV+%22Ice+physics%22">Ice physics</a>. , Clarendon Press. Oxford. 200-248 (1974).</li>
<li>Knight, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+crystallographic+etch+pits+on+ice%2C+and+its+application+to+the+study+of+hailstones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Meteorol%22%5BJournal%5D)">Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones.</a> J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).</li>
<li>Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+an+antifreeze+polypeptide+and+its+mechanistic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications.</a> Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).</li>
<li>Sicheri, F., Yang, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-binding+structure+and+mechanism+of+an+antifreeze+protein+from+winter+flounder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder.</a> Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).</li>
<li>Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+glycopeptides+and+peptides+in+inhibition+of+crystallization+of+water+in+polar+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+T+Roy.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes.</a> Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).</li>
<li>Pertaya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+evidence+for+quasi-permanent+attachment+of+antifreeze+proteins+to+ice+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces.</a> Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).</li>
<li>Kondo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-binding+site+of+snow+mold+fungus+antifreeze+protein+deviates+from+structural+regularity+and+high+conservation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).</li>
<li>Mok, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+superior+activity+of+the+large+isoform+of+snow+flea+antifreeze+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein.</a> Biochemistry. 49 (11), 2593-2603 (2010).</li>
<li>Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+active+qae+isoform+confers+thermal+hysteresis+activity+on+a+defective+sp+isoform+of+type+iii+antifreeze+protein%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein.</a> FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).</li>
<li>Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+ice+growth+and+melting+modifications+by+antifreeze+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins.</a> J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).</li>
<li>Celik, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).</li>
<li>Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dimeric+beta-helical+model+of+an+ice+nucleation+protein+with+bridged+active+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites.</a> BMC Struct. Biol. 11, (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten aangegeven.

Ontwikkeling van de ijsetsmethode door Charles Knight voor de bepaling van AFP-gebonden ijsvlakken zeer geavanceerde studies over het mechanisme van ijsbinding door AFP's. Terwijl structuren van AFP's konden worden opgelost door röntgenkristallografie26,27, was er geen voor de hand liggende methode om het complementaire oppervlak op ijs af te leiden waaraan het AFP gebonden was. Toen type I AFP van winter bot aanvankelijk werd gekenmerkt, werd verondersteld te binden aan de primaire prismavlakken van ijs2...

De productie van antivrieseiwitten (ACP's) is een belangrijk overlevingsmechanisme van sommige organismen die in met ijs beladen omgevingen leven. Tot voor kort werd gedacht dat de enige functie van ASP's was om de groei van interne ijskristallen te voorkomen of te vertragen die de bloedsomloop zouden blokkeren, weefselschade en osmotische stress zouden veroorzaken. Organismen die geen enkele mate van bevriezing kunnen verdragen, zoals vissen, drukken ASP's uit om de groei van ijskristallen volledig te remmen1. Anderen, zoals gras, zijn vorsttolerant en drukken ACP's uit om ijsrestallisatie te remmen, wat de vorming van grote ijskristallen in hun weefsels vermindert2. Stabilisatie van membranen bij lage temperatuur is nog een andere functie die werd voorgesteld voor de APS3. Onlangs werd een nieuwe rol voorgesteld voor de AFP van een Antarctische bacterie, Marinomonas primoryensis, uit met ijs bedekte brakke meren4. Deze AFP maakt deel uit van een veel groter adhesine-eiwit5 waarvan wordt gedacht dat het de bacterie aan ijs hecht voor een betere toegang tot zuurstof en voedingsstoffen6. Van andere microben is bekend dat ze ASP's afscheiden, wat de structuur van het ijs waarin ze leven kan veranderen7.
AFP's zijn gevonden in sommige vissen, insecten, planten, algen, bacteriën, diatomeeën en schimmels. Ze hebben opmerkelijk uiteenlopende sequenties en structuren die consistent zijn met hun evolutie van verschillende voorlopers bij verschillende gelegenheden; en toch binden ze zich allemaal aan ijs en remmen ze de groei ervan door het adsorptieremmingsmechanisme8. De ASP's hebben elk een specifiek oppervlak dat fungeert als zijn ijsbindende site (IBS). Deze zijn doorgaans geïdentificeerd aan de deen plaatsgerichte mutagenese van oppervlakteresiduen9-11. De PDS wordt verondersteld om watermoleculen te rangschikken in een ijsachtig patroon dat overeenkomt met specifieke ijsvlakken. Aldus vormt AFP zijn ligand alvorens aan het te binden5, 12. IJsvlakken kunnen worden gedefinieerd door hun Miller-indexen en verschillende ASP's kunnen zich binden aan verschillende vlakken. Zo bindt type I AFP van winters bot aan de 20-21 piramidalevlakken 13, type III AFP bindt zowel primaire prisma als piramidale vlakken met behulp van een samengesteld ijsbindend oppervlak11,14, terwijl de sparrenknopworm AFP, een hyperactieve AFP, zich tegelijkertijd bindt aan zowel de primaire als basalevlakken 15,16. Andere hyperactieve AFP's, zoals MpAFP, binden zich aan meerdere ijsvlakken, zoals blijkt uit hun volledige dekking van enkele ijskristalhersenenhelften5,17. Er wordt verondersteld dat het vermogen van hyperactieve ACP's om het basale vlak te binden, evenals andere vlakken, hun 10-voudige hogere activiteit kan verklaren ten opzichte van matig actieve ASP's18. Hoewel de efficiëntie van hyperactieve ACP's goed gedocumenteerd is, wordt hun vermogen om zich te binden aan meerdere ijsvlakken nog steeds niet begrepen.
De oorspronkelijke methode voor het bepalen van de AFP-gebonden ijsvlakken werd ontwikkeld door Charles Knight13,19. Bij deze methode wordt een macroscopisch enkel ijskristal op een holle metalen staaf (koude vinger) gemonteerd en gevormd tot een halfrond door het onder te dompelen in een hemisferische beker gevuld met ontgast water. Vervolgens wordt de hemisfeer ondergedompeld in een verdunde oplossing van AFP's en wordt een laag ijs uit de AFP-oplossing gedurende enkele uren op de ijskristalhelft gekweekt, gecontroleerd door de temperatuur van de ethyleenglycol die door de koude vinger circuleert. Het ijskristal wordt uit de oplossing verwijderd, losgemaakt van de koude vinger en in een vriesruimte van -10 tot -15 °C geplaatst. Het oppervlak wordt geschraapt met een scherp mes om de bevroren oppervlaktefilm van antivries-eiwitoplossing te verwijderen en het ijskristal mag minstens 3 uur sublimeren. Na sublimatie kunnen de ijsvlakken die door APS's worden gebonden, worden gezien als wit geëtste patronen afgeleid van resteiwit. De ijshelft kan worden georiënteerd op zijn c-as en een-assen, om de basale en prismavlakken van ijs te lokaliseren en de Miller-indexen van de geëteerde plekken te bepalen.
Hier beschrijven we een wijziging van de oorspronkelijke methode voor het bepalen van AFP-gebonden ijsvlakken, een methode die we fluorescentiegebaseerde ijsvlakaffiniteit (FIPA)11noemen. De AFP 's zijn fluorescerend gelabeld met ofwel een chimerische tag, zoals groen fluorescerend eiwit (GFP)11,16,17,20, of met een fluorescerende kleurstof die covalent gebonden is aan de AFP5,21. De fluorescerend gelabelde ARP's worden geadsorbeerd tot een enkel ijskristal en overwoekerd volgens dezelfde experimentele procedure als de oorspronkelijke ijsetsexperimenten. De mate van AFP-binding aan de groeiende ijshelft kan tijdens het experiment worden gecontroleerd met behulp van een ultraviolette (UV) lamp. Nadat het experiment is voltooid, kan de hemisfeer direct van de koude vinger worden verwijderd en worden afgebeeld, zonder sublimatie. Indien gewenst kan de hemisfeer echter worden overgelaten aan sublimate om een traditionele ijst ets te visualiseren. Wijzigingen in de FIPA-methodologie verkorten het traditionele ijsetsprotocol met enkele uren. Bovendien is er het potentieel om tegelijkertijd verschillende AFP's, elk met een ander fluorescerend label, in beeld te brengen om de overlappende patronen van AFP-gebonden ijsvlakken te visualiseren.

<table><tbody><tr><td>NESLAB RTE Koelbad/circulators</td><td>Thermo Scientific</td><td>RTE7</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleenglycol, voorgemengde antivries/koelvloeistof</td><td>Gecertificeerd</td><td>29-3037-0</td><td>Gangbare auto-antivries</td></tr><tr><td>Koude vinger</td><td>niet beschikbaar</td><td>niet beschikbaar</td><td>Op maat gemaakt met messing (9 cm lang, 1,5 cm buitendiameter)</td></tr><tr><td>Hemisferische beker</td><td>niet beschikbaar</td><td>niet beschikbaar</td><td>Op maat gemaakt met hars (8 cm buitendiameter, 6 cm binnendiameter)</td></tr><tr><td>High Dual Output Lighting System</td><td>Lightools Research</td><td>LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX</td><td>Aanvullende en aangepaste excitatiefilters kunnen worden gekocht bij Lightools Research</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Canon</td><td>EOS 50D</td><td></td></tr><tr><td>Emissiefilters</td><td>Lightools Research</td><td>LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG</td><td>Adapter voor filterring mogelijk vereist om filter op cameralens te passen</td></tr></tbody></table>

het bepalen van de ijsbindende vlakken van antivries eiwitten door fluorescentie-gebaseerde ice plane affiniteit

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antivrieseiwitten (ACP's) worden uitgedrukt in een verscheidenheid aan koudharde organismen om interne ijsgroei te voorkomen of te vertragen. ASP's binden zich aan specifieke ijsvlakken door hun ijsbindende oppervlakken. Fipa-analyse (Fluorescence-based ice plane affinity) is een aangepaste techniek die wordt gebruikt om de ijsvlakken te bepalen waaraan de ABP's binden. FIPA is gebaseerd op de originele ijsetsmethode voor het bepalen van AFP-gebonden ijsvlakken. Het produceert duidelijkere beelden in een verkorte experimentele tijd. In FIPA-analyse worden ARP's fluorescerend gelabeld met een chimerische tag of een covalente kleurstof en vervolgens langzaam opgenomen in een macroscopisch enkel ijskristal, dat is voorgevormd tot een hemisfeer en is gericht op het bepalen van de a- en c-assen. De AFP-gebonden ijshelft wordt afgebeeld onder UV-licht om AFP-gebonden vlakken te visualiseren met behulp van filters om aspecifieke licht te blokkeren. Fluorescerende etikettering van de AFP's maakt real-time monitoring van AFP adsorptie in ijs mogelijk. De labels bleken geen invloed te hebben op de vliegtuigen waaraan ASP's zich binden. FIPA-analyse introduceert ook de optie om meer dan één verschillend getagde AFP op hetzelfde enkele ijskristal te binden om hun bindingsvlakken te helpen differentiëren. Deze toepassingen van FIPA helpen ons begrip te bevorderen van hoe AFP's zich binden aan ijs om de groei ervan te stoppen en waarom veel AFP-producerende organismen meerdere AFP-isovormen uitdrukken.

De voorbereiding en montage van het enkele ijskristal zijn de twee stappen van de FIPA-procedure waarbij meestal fouten worden gemaakt. Bepalen of het voorbereide ijskristal enkelvoudig is, wordt gedaan door het te onderzoeken door gekruiste polaroids (figuur 1D),zoals beschreven in stap 2.1 van de protocolsectie. Als voor de FIPA-analyse een multikristallijn ijskristal wordt gebruikt, zal het resultaat discontinue binding van de ACP's op de hemisfeer zijn zonder een coherent bindingspatroon (fig...

Antivrieseiwitten (ACP's) binden zich aan specifieke ijsvlakken om ijsgroei te voorkomen of te vertragen. Fluorescentie-gebaseerde ijsvlakaffiniteitsanalyse (FIPA) is een wijziging van de oorspronkelijke ijsetsmethode voor de bepaling van AFP-gebonden ijsvlakken. AFP's zijn fluorescerend gelabeld, verwerkt in macroscopische enkelvoudige ijskristallen en gevisualiseerd onder UV-licht.

Het bepalen van de IJsbindende Vlakken van Antivries eiwitten door Fluorescentie-gebaseerde Ice Plane Affiniteit

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de vlakken van ijs te visualiseren die zijn gebonden door fluorescentie-gelabelde antifreeze-eiwitten. Dit wordt bereikt door enkelvoudige ijskristallen te laten groeien waaraan de antifreeze-eiwitten in een tweede stap kunnen binden. Elk kristal wordt bekeken door gekruiste polarisatoren om de singulariteit en oriëntatie ervan vast te stellen.Vervolgens wordt een ijskristal gemonteerd op een temperatuurgecontroleerde cold finger en gevormd tot een hemisfeer. Deze wordt vervolgens ondergedompeld in een oplossing van fluorescentielabel antifreeze-eiwitten om het antifreeze-eiwit te laten adsorberen op specifieke bindingsvlakken van de groeiende hemisfeer. De resultaten voor het ijs worden verkregen door ijs dat is gebonden aan fluorescentielabel antifreeze-eiwit te visualiseren en in beeld te brengen, gebruikmakend van golflengtespecifiek licht en filters in een donkere koude kamer.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals ijs-etsen, is dat de antivrieseiwitten fluorescent gelabeld zijn om directe visualisatie van de eiwitgebonden ijsvlakken mogelijk te maken. Start de kristalgroei door

determining-ice-binding-planes-antifreeze-proteins-fluorescence-based

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Kwantitatieve, high-throughput, real-time, en label-free biomoleculaire detectie (DNA, eiwitten, enz.) op...

Biomoleculaire Detectie gebruik de interferometrische reflectie Imaging Sensor (IRIS)

Ice bindingseiwitten (IBP), ook bekend als antivrieseiwitten, remmen ijsgroei en een veelbelovende toevoegingsmiddelen in de cryopreservatie van weefsels. Het belangrijkste instrument dat wordt gebruikt om IBP te onderzoeken is de nanoliter osmometer. We ontwikkelden een huis ontworpen koeling stadium gemonteerd op een optische microscoop en gecontroleerd met behulp van een custom-built LabVIEW routine. De nanoliter osmometer hier beschreven gemanipuleerd het monster temperatuur in een...

LabVIEW bediende Novel nanoliter Osmometer voor Ice Bindend Eiwit Onderzoeken

In this video, we describe the fluorescence anisotropy technique to study the interactions between the fluorophore-tagged Shwachman-diamond syndrome (SBDS) protein and the elongation factor-like 1 GTPase (EFL1). On incubating SBDS proteins with gradually increasing concentrations of EFL1, a steady increase in anisotropy is observed, indicating a successful interaction between the two proteins.

Fluorescence Anisotropy-Based Detection of Protein-Protein Interactions

This video describes high-performance fluorescence anisotropy that helps to monitor the interaction between transcription factors and DNA. The assay monitors the interactions of a fluorophore-labeled DNA molecule with its specific transcription factor by measuring the degree of polarization due to molecular rotation or anisotropy of the fluorophore-labeled DNA.

Fluorescence Anisotropy to Determine Transcription Factor-DNA Binding Affinity

Differentiële scannen fluorimetrie is een veelgebruikt methode voor het screenen van bibliotheken van kleine moleculen op interacties met eiwitten. Hier presenteren we een eenvoudige methode om deze analyses uit te breiden om een schatting te geven van de dissociatieconstante tussen een klein molecuul en zijn eiwitpartner.

Bepaling van proteïne-ligand interacties gebruiken Differential Scanning Fluorimetrie

Eiwit interacties vormen de kern van de functie van een cel. Calorimetrische en spectroscopische technieken worden gewoonlijk gebruikt om ze te karakteriseren. Hier beschrijven we fluorescentie anisotropie als middel om de interactie tussen het eiwit gemuteerd in de Shwachman-Diamond Syndroom (SBDS) en elongatiefactor-1 achtige GTPase (EFL1) te bestuderen.

Fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen

MicroScale Thermoforese (MST) is een gevoelige technologie voor het karakteriseren van aptameer-doelinteracties. Dit manuscript beschrijft een MST-protocol voor het karakteriseren van aptameer-kleine molecuulinteracties.

In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis

Dit document beschrijft de identificatie van ijs bindende eiwitten uit freeze-tolerante planten door de beoordeling van ijs herkristallisatie inhibitie activiteit en daaropvolgende isolatie van natieve IBP gebruik ice-affiniteitzuivering.

Identificatie van Plant Ice-bindende eiwitten Through Beoordeling van Ice-herkristallisatie inhibitie en isolatie met behulp van Ice-affiniteitszuivering

Biopanning bacteriële display bibliotheken is een bewezen techniek voor ontdekking van peptide affiniteit reagentia, een robuust alternatief voor antilichamen. De semi-automatische sorteermethode hierin heeft gestroomlijnd biopanning als u wilt verkleinen van het optreden van valse positieven. We illustreren hier het denkproces en de technieken toegepast in de beoordeling van kandidaten en het minimaliseren van de downstream-analyse.

Semi-automatische Biopanning van bacteriële Display bibliotheken voor Peptide affiniteit reagens detectie en analyse van de resulterende isolaten

Een gestroomlijnde protocol voor het uitvoeren van een uitgebreide biochemische en structurele karakterisering van een koolhydraat-substraat bindend-proteïne van Streptococcus pneumoniae is gepresenteerd.

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Het huidige protocol beschrijft de kristallisatie van microscopische ijskristallen en clathraathydraten in microfluïdische apparaten, waardoor vloeistofuitwisseling rond de gevormde kristallen mogelijk wordt. Dit biedt ongeëvenaarde mogelijkheden om het kristallisatieproces en de bindingsmechanismen van de remmers te onderzoeken.

Een microfluïdische benadering voor de studie van ijs- en clathraathydraatkristallisatie

Leer hoe je fluorescerend gelabelde antivrieseiwitten visualiseert op ijskristallen met behulp van fluorescentie-gebaseerde ijsvlakaffiniteitsanalyse. Deze methode onthult bindingsmechanismen en structurele kenmerken.

Het bepalen van de IJsbindende Vlakken van Antivries eiwitten door Fluorescentie-gebaseerde Ice Plane Affiniteit

Meer video's verkennen