Het bepalen van de IJsbindende Vlakken van Antivries eiwitten door Fluorescentie-gebaseerde Ice Plane Affiniteit

Het algemene doel van het volgende experiment is om de vlakken van ijs te visualiseren die zijn gebonden door fluorescentie-gelabelde antifreeze-eiwitten. Dit wordt bereikt door enkelvoudige ijskristallen te laten groeien waaraan de antifreeze-eiwitten in een tweede stap kunnen binden. Elk kristal wordt bekeken door gekruiste polarisatoren om de singulariteit en oriëntatie ervan vast te stellen.

Vervolgens wordt een ijskristal gemonteerd op een temperatuurgecontroleerde cold finger en gevormd tot een hemisfeer. Deze wordt vervolgens ondergedompeld in een oplossing van fluorescentielabel antifreeze-eiwitten om het antifreeze-eiwit te laten adsorberen op specifieke bindingsvlakken van de groeiende hemisfeer. De resultaten voor het ijs worden verkregen door ijs dat is gebonden aan fluorescentielabel antifreeze-eiwit te visualiseren en in beeld te brengen, gebruikmakend van golflengtespecifiek licht en filters in een donkere koude kamer.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals ijs-etsen, is dat de antivrieseiwitten fluorescent gelabeld zijn om directe visualisatie van de eiwitgebonden ijsvlakken mogelijk te maken. Start de kristalgroei door een temperatuurgecontroleerd ethyleenglycolbad bij -0,5 °C voor te bereiden en een schone metalen pan te vinden die in het bad past en erop kan drijven. De kristallen worden in mallen gevormd. Gebruik cilindrische mallen van drie tot vier centimeter hoog, gesneden uit een polyvinylchloridebuis.

Elke mal moet aan één zijde een inkeping hebben van één millimeter breed en twee millimeter hoog. Breng een dunne laag vacuümvet aan op de zijde van de ring waar de inkeping is uitgesneden. Sluit dit ingevette, inkepingsoppervlak af op de metalen pan, waarbij de inkeping van het midden van de pan af is gericht.

Zorg ervoor dat de inkepingen niet met vet worden gevuld of geblokkeerd. Bereid zoveel mogelijk mallen voor als in de pan passen. Voeg vervolgens gefilterd ontgast en gedeïoniseerd water toe aan het midden van de pan, buiten de mallen.

Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Terwijl de waterlaag tot vijf millimeter wordt verhoogd, moet het water langzaam via de inkepingen de mallen binnendringen. Plaats de pan vervolgens volkomen waterpas in het ethyleenglycolbad.

Nadat de pan en het water een temperatuur van -0,5 °C hebben bereikt, wordt er een klein stukje ijs in het midden van de pan buiten de mallen geplaatst. Laat dit een nacht incuberen om gedurende de volgende drie dagen een ijslaag te vormen. Plaats de pan terug in het bad om water aan de mallen toe te voegen.

Voeg 13 milliliter gedegasseerd en gedeïoniseerd water van vier graden Celsius toe aan elke mal. Verlaag één keer per dag na het toevoegen van het water de temperatuur van het ethyleenglycolbad. Tegen de vierde dag moeten de mallen volledig met ijs gevuld zijn.

Haal de mallen uit de vriezer en bereid een schoon oppervlak voor het ijs voor. Verwijder elke mal van de pan en druk het ijskristal eruit. Plaats het schone oppervlak met de mallen gedurende één uur in een vriezer op -20 °C.

Voor het haperen. Wanneer het ijs klaar is, brengt u het naar een vrieskamer of koelruimte om vast te stellen of het om een enkelkristal gaat. Plaats het ijs tussen twee gekruiste polarisatoren.

Als het ijs een enkelkristal is, mogen er geen barsten of discontinuïteiten zichtbaar zijn en mag de lichtrichting binnen het kristal niet veranderen. Bepaal, terwijl de polarisator nog op zijn plaats zit, de oriëntatie van de C-as door de doorgelaten lichtstraal te observeren terwijl het ijs wordt gedraaid. Om de oriëntatie van de A-assen te bepalen, dient het ijs strak in aluminiumfolie te worden gewikkeld.

Plaats een naald loodrecht op de as van het zee-oppervlak en prik een klein gaatje door het folie en in het ijs. Plaats het ijs vervolgens gedurende 20 minuten in een vacuüm van 0,5 millibar. Zodra het kristal is teruggehaald, wordt het in de koude kamer blootgesteld.

Observeer de hexagonale etsing op het basaalvlak. De A AE's lopen door de hoekpunten van de zespuntsster. Dit kristal zal in tweeën worden gesneden langs een lijn parallel aan tegenoverliggende punten op de ster.

Om een primair prisma-vlak bloot te leggen, houdt u het kristal stevig vast op een werkbank. Gebruik een handzaag om het kristal doormidden te zagen. Verzamel de stukken om deze op een cold finger te monteren.

Het ijskristal moet verder worden voorbereid voor montage op een cold finger; gebruik hiervoor twee aluminium staven met een licht verschillende diameter, maar van vergelijkbare grootte als de cold finger. Wissel het gebruik van de staven af om een holte in de bovenkant van het kristal te smelten; stop wanneer er een holte is waarin de cold finger past. Koel de cold finger tot minus 0,5 °C en plaats deze in de ijsholte.

Houd het kristal op zijn plaats totdat het aan het metaal bevriest. Vul vervolgens een hemisferische beker met een diameter van ongeveer twee keer die van het ijskristal met gefilterd gedeïoniseerd water dat is gekoeld tot vier graden Celsius. Dompel het aan de cold finger bevestigde ijskristal in de beker en verwijder het overtollige water, zodat de bovenkant van het ijskristal ongeveer gelijk ligt met het vloeistofniveau en het ijs geen contact maakt.

Bekleed de wanden van de beker met isolatiemateriaal en verlaag de temperatuur tot min vijf graden Celsius. Laat het ijs gedurende ongeveer een uur een halve bol vormen. Maak u klaar om het fluorescerende eiwit toe te voegen.

Wanneer de hemisfeer gereed is, wordt het ijskristal uit de beker verwijderd en wordt het water uit de beker verwijderd. Voeg vervolgens 25 tot 30 milliliters van een vooraf gekoelde, fluorescentie-gelabelde eiwitoplossing toe in de gewenste concentratie.

Dompel het ijskristal in de beker, terwijl het totale vloeistofvolume ongewijzigd blijft. Zorg er opnieuw voor dat de bovenkant van het kristal gelijk ligt met het vloeistofniveau en dat deze de wanden van de beker niet raakt. Verlaag de temperatuur van de koude vinger naar minus acht graden Celsius en laat de eiwitoplossing twee tot drie uur lang in het kristal bevriezen.

Stop de ijsgroei wanneer er ten minste vijf millimeter ijs uit de eiwitoplossing is gevormd. Verwijder het ijskristal uit het bekertje terwijl de cold finger nog is bevestigd. Koppel de cold finger los door het koelmiddel op te warmen tot net boven nul graden Celsius.

Wacht tot het ijskristal afsmelt. Wanneer het kristal van de cold finger afsmelt, plaats deze met de platte zijde naar beneden op een schoon oppervlak. Zorg ervoor dat u het nieuw gevormde ijs niet aanraakt.

Bewaar het kristal bij -20 °C gedurende ten minste 20 minuten. Voordat u overgaat tot het visualiseren van de fluorescentie, dient u te werken in een koelkamer die verduisterd kan worden. Bereid lampen voor met golflengtespecifieke excitatiefilters om het fluorescerende label te exciteren, evenals emissiefilters voor de camera. Om aspecifiek licht te blokkeren, plaatst u het ijs met de vlakke zijde naar beneden onder de lampen, verduistert u de ruimte en observeert u de patronen in het verlichte ijs.

Om de ijsvlakken te schatten die gebonden zijn door de antivrieseiwitten, vergelijkt u een traditionele ijs-etshuid met die van de overeenkomstige fluorescentiegebaseerde ijsvlak-affiniteitsanalyse met behulp van trixy; beide tonen type 1 antivrieseiwitten geproduceerd door de winterflounder Pseudopectus americana. De techniek kan worden gebruikt om gelijktijdig de ijsbindingspatronen van verschillende antivrieseiwitten te vergelijken. In dit geval Pacific Blue-gelabeld type 3 NFEA FP 8 en trixy-gelabeld type 1 antivrieseiwit.

Dit is het resultaat van de visualisatie van enkel type drie N-F-E-A-F-P acht; hier wordt enkel het type één antivrieseiwit gevisualiseerd in deze afbeelding. De twee zijn samen gevisualiseerd. Let op dat de C-as voor elke afbeelding gelijk is.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u enkele ijskristallen kunt kweken en oriënteren, en hoe u de op fluorescentie gebaseerde analyse van de affiniteit van het ijsvlak kunt gebruiken om de bindingspatronen op het ijsvlak van fluorescentielabelled antifreeze-eiwitten te beoordelen.