Name: Visualisatie van G3BP Stress Korrels Dynamics Live primaire cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Leer de dynamiek van stresskorrels visualiseren in primaire cellen zoals muizenembryofibroblasten en hippocampale neuronen. Deze methode biedt inzicht in neuronale stressresponsen en celbiologische mechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag de Montpellier Rio Imaging (MRI)-platform waar de overnames werden uitgevoerd erkennen. Ze bedanken Isabel Cristina Lopez Mejia, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot en Virginie Georget voor hun hulp in verschillende delen van het protocol. Dit werk werd ondersteund door de Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745).

Alle dierlijke procedures in dit protocol de in strikte naleving van de richtlijnen van de richtlijn Europese Gemeenschap van de Raad van 24 november 1986 (86-609/EEC). Het huis van de muizen in de groep, waardoor voedsel en water ad libitum. Behouden ze in een gecontroleerde omgeving (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% vocht) met een 12 uur: 12 uur licht: donker cyclus (licht aan om 7.00 uur). 1 Cultuur van Muriene primaire cellen:. Muis embryonale fibroblasten (MEF) <ol><li> Autoclaaf dunne tang, evenals gebogen tang en dissectieschaar. Bewaren in een steriele container. Gebruik steriele D-PBS (Dulbecco&#39;s fosfaat-gebufferde zoutoplossing). Bereid volledige MEF medium: Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle medium (DMEM) / F12 gesupplementeerd met 10% foetaal kalfsserum (FBS), 1 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 1% niet-essentiële aminozuren, en 0,5 mM 2-mercaptoethanol en warm bij 37 ° C. </li><li> Euthanaseren een zwangere muis (13,5 dagen na de coïtus (dpc)) Door cervicale dislocatie. Verwijder de baarmoederhoorns van de muis ontsmet met 90% EtOH. Onder een steriele en schone kap, plaats de hoorns met de embryo&#39;s in 37 ° C voorverwarmde D-PBS. Open de horens, plaats de embryo&#39;s in een 100 mm steriele plastic petrischaal, schoon ze uit de navelstreng materiaal en was ze in warm D-PBS om bloed overtollige te verwijderen. Onder een verrekijker, verwijder de embryo&#39;s ledematen, de inwendige organen en het bovenste deel van het hoofd met de hersenen. </li><li> In een nieuwe petrischaal, gehakt de embryo&#39;s in kleine stukjes met een steriele chirurgische mes of schaar (tenminste gedurende 1 min). In het geval van embryo&#39;s van verschillende genotypen, wees voorzichtig om elk embryo in individuele petrischaaltjes zetten en houden de staart of de bovenste kop voor genotypering. </li><li> Bedek het embryo met 1 x trypsine-EDTA (0,25% trypsine, 1 mM EDTA). Incubeer gedurende 30 min tot 1 uur in een 37 ° C incubator. Voeg 10 ml compleetMEF medium tot trypsine reactie te stoppen. Pipet op en neer om alle aggregaten te verwijderen. Laat zitten de celsuspensie in een 50 ml buisje (gevuld met compleet medium) gedurende 10 min, en het supernatant gecentrifugeerd gedurende 5 minuten bij 300 g bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet in compleet medium (6 ml voor 1 embryo). Levensvatbare cellen met kernen te tellen met behulp van trypan blauw (Ongeveer 5 x 10 6 cellen kunnen worden verwacht van een embryo). Plaat 3 ml per 60 mm petrischaal. </li><li> Verander het medium de volgende dag en laat de cellen groeien totdat de gerechten worden confluent. Veel celtypen te zien, maar alleen fibroblasten zal subcultuur overleven. </li><li> Splits de cellen en hen in staat stellen om te groeien in 35 mm schalen met glazen bodem (belangrijk voor time-lapse experiment), tot 50-70% confluentie voor de transfectie. Test voor Mycoplasma en muis ziekteverwekkers. </li></ol> 2. Cultuurdaptations in de zaak van Neuronen <ol><li> De dag voor de cultuur, vacht 35 mm glazen bodem petrischaaltjes met poly-L-lysine (200 pl van 0,1 mg / ml) onder een steriele en schone kap, en laat het een nacht. </li><li> De volgende morgen, spoelen met steriel zuiver water, tweemaal gedurende 5 min en eenmaal gedurende 45 minuten tot 1 uur. Vervang 2 ml DMEM plus 10% FBS medium en in een 37 ° C incubator houden. </li><li> Ontleden embryo&#39;s in 18.5 dpc. Onder een steriele en schone kap, plaats de hoorns met de embryo&#39;s in koude steriele HBSS (Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing) in 100 mm petrischaal. Neonatale pups kan ook in plaats van embryo&#39;s worden gebruikt om de levensduur van de dam behouden en in staat om meer nageslacht, vooral in het geval van transgene dieren die moeilijk te verkrijgen zijn. In individuele petrischaaltjes, nemen elk embryo of pasgeboren en snijd het hoofd met een schaar. Houd het hoofd door het invoegen van gebogen pincet in de ogen, snijd de huid en open voorzichtig de zachte schedel van de achterkantvan de kop tot de ogen, aan elke kant van de weg. Snijd de oogzenuwen en de hersenstam, verwijder de hersenen, en zet het in een nieuwe petrischaal met HBSS. Onder een stereoscoop, verwijder alle hersenvliezen met twee dunne tang. Scheid de hippocampus, de cortex of een ander deel van de hersenen afhankelijk van de structuur te bestuderen. </li><li> Dompel de ontleed hersenstructuur in 4,5 ml koud HBSS eerder bereid in 15 ml buizen en blijf op ijs tot digestie met trypsine. Voeg 0,5 ml 2,5% trypsine en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 min tot 20 min. Spoel de trypsine 3x met HBSS, uiterst voorzichtig om de verteerde hersendelen niet weg. </li><li> Resuspendeer in 500 pl (hippocampus) 1 ml (cortex) DMEM met 10% FBS en pipet op en neer meerdere malen met een 1 ml micropipet met een 1 ml tip, vervolgens met 1 ml plus 200 ul tips, totdat er geen zichtbare aggregaat. </li><li> Verdeel 100-200 ul van celsuspensie aan elk 35 mm glas bottom schaaltje met DMEM met 10% FBS en laat de neuronen hechten bij 37 ° C gedurende ten minste 3 uur. Vervangen door voorverwarmd neuron compleet medium (Neurobasal medium aangevuld met 250 uM L-glutamine en NS21, bereid zoals beschreven in Chen et al.. 19) en verlaat deze bij 37 ° C neuronale groei mogelijk. Transfecteren de neuronen bij 5 tot 14 dagen in vitro (div) (de efficiëntie van transfectie hoger na een paar div maar synaptische verbindingen beter vastgesteld van 7-10 div). </li></ol> 3. Transfectie van EGFP-G3BP1 Construct Transfecteren van de cellen met een vector die het cDNA van het eiwit van interesse (een onderdeel van SG) gefuseerd aan een fluorescente merker (GFP, YFP, enz.), met 3 ug van gezuiverd plasmide per 35 mm schaal. <ol><li> Transfecteren de MEF met een commerciële methode, volgens het protocol van de fabrikant (zie tabel van materialen / Reagentia). </li><li> Transfecteren de neuronen met calciumfosfaat methode aangepast van Xia et al. 20 kort.: <ol><li> Bereid de oplossingen: DMEM-wash: DMEM met 25 mM KCl; transfectieoplossing: DMEM-wash bestaande uit 1x DMKY (HEPES 5 mM, MgCl2 10 mM, fenol rood); en shock oplossing: HeBS 1x, DMKY 1x, en DMSO 2% (v / v); en houd ze bij 37 ° C. </li><li> Verwijder het papier uit de neuronen, filtraat, en houd het bij 37 ° C. Wassen met DMEM-wash vervolgens te vervangen door transfectiemedium en houden bij 37 ° C tijdens de voorbereiding van de calciumfosfaat-plasmide-DNA neerslagen. </li><li> In een 1,5 ml microcentrifugebuis, voegen (in deze volgorde) Braun water (eindvolume 50 pl), 5 ul 2,5 M CaCl2, en 3 ug plasmide DNA. Laat dit mengsel op 50 pi 2x HeBS reeds een ronde bodem polypropyleen buis geïntroduceerd. Meng de buis door de rotatie samen met de dropping. Laat het neerslag vorm bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Voeg de precipitate druppelsgewijs op de neuronen en verlaat deze bij 37 ° C gedurende 30 tot 50 minuten. </li><li> Vervang shock oplossing gedurende 1 minuut en spoel na met DMEM-wash en tenslotte opnieuw het geconditioneerd medium. Laat de cellen bij 37 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Visualisatie van G3BP bevattende SG&#39;s Vergadering en Dynamics <ol><li> Vervang het medium van de cellen die fenolrood bevat met fenolrood-vrij medium. </li><li> Gebruik een confocale microscoop uitgerust met fluorescentie voor de acquisities. Zet de microscoop systemen: kwiklamp, computer, en lasers. Warmen de kamer tot 37 ° C ten minste 20 minuten vóór het begin van de acquisities. </li><li> De overexpressie van G3BP induceert de spontane vorming van een type SGS. De cellen kunnen dus worden waargenomen voor de montage van SG 24 uur direct na de transfectie zonder stressinductie. Als alternatief, kan stress worden veroorzaakt aan de montage van SG&#39;s verder te induceren. Voeg 0,5 mM natriumarseniet en stert de acquisitie direct na de toevoeging van de verbinding (granules goed gevormd binnen 1 uur). </li><li> Olie toe te voegen aan de immersie-objectief (gebruik 40X of 63X doelstellingen) en installeer de petrischaal op het streven in de aangepaste 35 mm microscoop houder, gestabiliseerd op het podium houder. Controleer of het gerecht is plat anders de acquisities zal worden gewijzigd. Zet de fluorescentie licht overeenkomstig de desbetreffende fluorophore en visualiseren getransfecteerde cellen. Schakel fluorescentie eens een cel van belang is in het veld in om te bleken en cytotoxiciteit te minimaliseren. </li><li> In het &quot;verwerven tabblad&quot;, selecteer de lasers, afhankelijk van de golflengte van de tag fluorofoor (488 nm in ons protocol waarin EGFP-tagged G3BP gebruikt) en selecteer de aangepaste emissie lengte voor de PMT (fotomultiplicatorbuis). Stel het laservermogen (gewoonlijk niet meer dan 10%) om ruis en oververzadiging en toxiciteit te minimaliseren en stel de versterking en offset signaal wijzigen ruisverhouding.Scan snel (1000 Hz) om de duur van de laser expositie (lijn gemiddeld 2, kader gemiddeld 1) te minimaliseren. Indien gewenst, de parameters voor de Z-stack kunnen de afbeelding in 3D (een Z stap 1 urn is gewoonlijk goed met cellen) te reconstrueren. Bepaal het interval tussen elke verwerving: kleiner tussenpozen, tot een coherente film te vinden, maar kan fotobleken en toxiciteit (een interval van 20 seconden werd gebruikt in de experimenten beschreven) induceren. Duur van de totale aankoopprijs kan variëren afhankelijk van het type stress. Veel-G3BP bevattende SGs zeer snel gevormd onder arseniet behandeling en goed zichtbaar zijn na 1 uur van de behandeling: in dat geval kiest u snel de cellen om te filmen en start de acquisities direct na de stress, met een totale duur van acquisities van 15 - 20 min ruim voldoende om de assemblage van verschillende SG&#39;s te observeren. </li><li> Sla de foto&#39;s en reconstrueren de stacks en film met ImageJ software. </li></ol>

<ol><li>Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+granules%3A+The+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">RNA granules: The good, the bad and the ugly.</a> Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).</li>
<li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%3A+sites+of+mRNA+triage+that+regulate+mRNA+stability+and+translatability%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability.</a> Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).</li>
<li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%3A+the+Tao+of+RNA+triage%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stress granules: the Tao of RNA triage.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).</li>
<li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li>
<li>Tourrière, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP+assembles+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).</li>
<li>Parker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ras-GTPase-activating+protein+SH3-domain-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 2561-2569 (1996).</li>
<li>Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+G3BP1+as+a+RasGAP+binding+protein%3A+sensitization+of+tumor+cells+to+chemotherapy+by+the+RasGAP+317-326+sequence+does+not+involve+G3BP1%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1.</a> PLOS ONE. 6 (12), (2011).</li>
<li>Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+G3BPs%3A+tissue+specific+expression%2C+chromosomal+localisation+and+rasGAP%28120%29+binding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).</li>
<li>Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC%CE%B1+Binds+G3BP2+and+Regulates+Stress+Granule+Formation+Following+Cellular+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">PKCα Binds G3BP2 and Regulates Stress Granule Formation Following Cellular Stress.</a> PLOS ONE. 7 (4), (2012).</li>
<li>Tourrière, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RasGAP-associated+endoribonuclease+G3Bp%3A+selective+RNA+degradation+and+phosphorylation-dependent+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">RasGAP-associated endoribonuclease G3Bp: selective RNA degradation and phosphorylation-dependent localization.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7747-7760 (2001).</li>
<li>Costa, M., Ochem, A., Staub, A., Falaschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+helicase+VIII%3A+a+DNA+and+RNA+helicase+corresponding+to+the+G3BP+protein%2C+an+element+of+the+ras+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Human DNA helicase VIII: a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway.</a> Nucleic acids research. 27 (3), 817-821 (1999).</li>
<li>Solomon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+structural+features+of+caprin-1+mediate+its+interaction+with+G3BP-1+and+its+induction+of+phosphorylation+of+eukaryotic+translation+initiation+factor+2alpha%2C+entry+to+cytoplasmic+stress+granules%2C+and+selective+interaction+with+a+subset+of+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (6), 2324-2342 (2007).</li>
<li>Soncini, C., Berdo, I., Draetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras-GAP+SH3+domain+binding+protein+%28G3BP%29+is+a+modulator+of+USP10%2C+a+novel+human+ubiquitin+specific+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ras-GAP SH3 domain binding protein (G3BP) is a modulator of USP10, a novel human ubiquitin specific protease.</a> Oncogene. 20 (29), 3869-3879 (2001).</li>
<li>Zekri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+fetal+growth+and+neonatal+survival+by+the+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (19), 8703-8716 (2005).</li>
<li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+G3BP1%2C+the+stress+granules+assembly+factor%2C+results+in+abnormal+synaptic+plasticity+and+calcium+homeostasis+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Deficiency of G3BP1, the stress granules assembly factor, results in abnormal synaptic plasticity and calcium homeostasis in neurons.</a> Journal of neurochemistry. , (2013).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li>
<li>Colombrita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+is+recruited+to+stress+granules+in+conditions+of+oxidative+insult%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult.</a> Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).</li>
<li>Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Staufen+1+is+recruited+to+stress+granules+and+impairs+their+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly.</a> Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).</li>
<li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NS21%3A+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).</li>
<li>Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Influx+via+the+NMDA+Receptor+Induces+Immediate+Early+Gene+Transcription+by+a+MAP+Kinase%2FERK-Dependent+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).</li>
<li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Current protocols in neuroscience. 3, (2001).</li>
<li>Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+G3BP-induced+granules+trigger+eIF2%CE%B1+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Large G3BP-induced granules trigger eIF2α phosphorylation.</a> Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).</li>
<li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De meest kritische stappen in het protocol betreffen de transfectie en meer in het bijzonder de time lapse overnames, die moeten zorgvuldig worden gevolgd om lager op de cytotoxiciteit. Kweek van primaire cellen is niet een moeilijke deel, mits steriele omstandigheden worden gehandhaafd en voorzichtigheid is genomen om schade tijdens de dissectie en celdissociatie stappen voorkomen. MEF kan op vroege passages bevroren bewaard. Neuron transfectie met calciumfosfaat is aangetoond goed te werke...

Stress korrels (SG) niet-membraneuze cytoplasmatische foci gevormd als een beschermende cellulaire reactie op omgevingsstress, zoals verhoogde temperatuur, oxidatieve stress, hypoxie, osmotische schok, UV-bestraling, glucose deprivatie of virale infectie 1. Ze kunnen chemisch worden geïnduceerd door behandeling met verbindingen zoals natriumarseniet, die oxidatieve stress veroorzaakt. SG&#39;s accumuleren vastgelopen vertaling gearresteerd boodschapper ribonucleoproteïne (mRNPs) complexen 2, sequestering mRNA&#39;s van de translationele machines, en de montage kan worden geactiveerd door de fosforylering van eIF2α (eukaryote initiatie factor 2 α). SG zijn dynamische structuren die componenten wisselen met polysomen en andere granulaten zoals de P-organen. Zij vormen een &quot;triage center&quot; waar mRNA&#39;s worden gesorteerd en verwerkt voor een van beide vertalingen, een herstart, degradatie of verpakking in stabiele niet-polysomal mRNPs 3. De assemblage van de SG&#39;s is snel but het is een geleidelijk proces met initiële talrijke kleine aggregaten die samenvloeien tot grotere korrels. Het gebruik van chemische inhibitoren die verstoren of microtubuli stabiliseren blijkt dat het microtubule netwerk vereist SG dynamiek inbegrip van assemblage, coalescentie en demontage processen. De dynamische samenstel van SG wordt ook bevorderd door aggregatie van specifieke RNA-bindende eiwitten (RNA-BP) zoals TIA-1 (T-cel intern antigeen-1) en TIAR (TIA-1 verwant eiwit), die kunnen dimeriseren zijn en het bevorderen van polysome demontage en de routering van mRNA&#39;s in SG 4. G3BP (RasGAP SH3 domein bindend eiwit) is zo&#39;n RNA-BP dat lokaliseert SGS wanneer cellen worden benadrukt met arseniet en hoge temperatuur, en overexpressie van gedefosforyleerd G3BP kan SGs assemblage 5 induceren. G3BP is een evolutionair geconserveerd RNA-BP dat in eerste instantie werd gekenmerkt door de interactie met een Ras-GTPase activerend eiwit (RasGAP p120 6); maar deze interactie is onlangs revisited 7. De familie G3BP omvat twee leden bij zoogdieren, G3BP1 (hierna G3BP) en G3BP2 8. Beide eiwitten colocalize in SG, wanneer cellen worden blootgesteld aan spanning 9. G3BPs omvatten een N-eindstandig domein NTf2 voorgesteld hun lokalisatie en oligomerisatie, gevolgd door proline rijke (PxxP) motieven beïnvloeden, dan C-eindstandige motieven geassocieerd met RNA binding: de canonieke RNA-herkenningsmotief (RRM) met behouden RNP1 en RNP2 motieven , gevolgd door een rijke box arginine-glycine (RGG). Interessant is dat de analyse van verschillende delen van het eiwit door het construeren verschillende domeinen gefuseerd met EGFP bleek dat de NTf2-achtige domein en de RNA-bindende domein zijn de meest efficiënte gerekruteerd SG, Dit suggereert dat de eigenschappen van dimerisatie en RNA binding in de assemblage van SGS. Diverse modellen hebben verschillende functies van G3BP eiwitten bleek in vitro 10-13.Verstoring van G3BP in muizen hebben het belang van dit eiwit in de ontwikkeling groei en overleving 14, evenals een belangrijke rol G3BP in het centrale zenuwstelsel (CZS), gekenmerkt door ataxie en gebreken in ruimtelijk werkgeheugen 15. G3BP deficiëntie leidt tot een gewijzigde neuronale plasticiteit en calcium homeostase, tot oprichting van een rechtstreeks verband tussen SG vorming en neurodegeneratieve ziekten 15. Het is dus belangrijk om de dynamiek van SG in primaire cellen zoals neuronen te bestuderen. Dit protocol biedt een eenvoudige manier om de assemblage van-G3BP1 bevattende SGs observeren in primaire cellen onder arseniet behandeling. Het kan worden gebruikt om SG montage bestuderen onder verschillende omstandigheden, bijvoorbeeld verschillende spanningen. Het kan ook worden aangepast aan andere korrels of andere bestanddelen van SG. Inderdaad, dit protocol gericht op G3BP1, maar er zijn andere stress granulaat merker TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (Fragiele X mentale retardatie syndroom eiwit) 16, TDP-43 (transactieve reactie DNA-bindend eiwit 43) 17 of Staufen 18. In het bijzonder eiwitten zoals TIA-1 / R zijn zoals G3BP, kiemvormende RNA-bindende eiwitten die SG samenstel kan induceren wanneer tot overexpressie gebracht, hebben de diverse gevormde SG kunnen verschillen in functie, regulering en geassocieerde transcripten. Transfectie van fluorofoor gelabeld versie van een van deze belangrijke componenten of kiemvormers van SG&#39;s kunnen worden uitgevoerd om bepaalde beeld SGs assemblage en dynamiek.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331</td><td>Voorverwarmen op 37 &deg;C</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Nonessential amino acids</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>15096</td><td></td></tr><tr><td>Glasbodem B-35</td><td>Greiner</td><td>627860/627861</td><td>Behandeld of niet (behandeld: verhoogt de hechting van adherente cellen)</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td>Voorverwarmen op 37 &deg;C</td></tr><tr><td>HeBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103</td><td>Voorverwarmen op 37 &deg;C</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Biotek</td><td>DU-110-A</td><td>Zeer dun, uiteinden 0,1 mm (handig om hersenvliezen te verwijderen)</td></tr><tr><td>Gebogen pincet</td><td>Biotek</td><td>P-110-BUF</td><td>Zeer dun, uiteinden 0,1 mm</td></tr><tr><td>Kleine schaar</td><td>Biotek</td><td>CM-85-BS</td><td>Kan handig zijn om hippocampus te verwijderen</td></tr><tr><td>Polyplus transfectie JetPEI reagens&nbsp;</td><td>Ozyme</td><td>101-10</td><td>MEFs transfectie, volg het voorwaartse protocol</td></tr><tr><td>Inverteerbare laserscanning confocale microscoop</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie van g3bp stress korrels dynamics live primaire cellen

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SG kan in cellen worden gevisualiseerd door immunokleuring specifieke eiwitcomponenten of polyA + mRNA. SG zeer dynamisch en de studie van hun assemblage en lot is belangrijk om de cellulaire respons op stress te begrijpen. Het tekort in de belangrijkste factoren van de SG&#39;s zoals G3BP (RasGAP SH3 domein bindend eiwit) leidt tot defecten in de ontwikkeling bij muizen en veranderingen van het centrale zenuwstelsel. Om de dynamiek van de SG&#39;s bestuderen in cellen van een organisme, kan men cultuur primaire cellen en volg de lokalisatie van een getransfecteerde gelabeld onderdeel van SGS. We beschrijven time-lapse experiment om-G3BP1 bevattende SGs in muis embryonale fibroblasten (MEF) observeren. Deze techniek kan ook worden gebruikt om G3BP bevattende SG bestuderen levende neuronen, wat cruciaal zoals onlangs aangetoond dat deze SG gevormd bij het begin van neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer. Deze benadering kan worden aangepast aan andere cellulaire lichaam en granule eiwitcomponent en uitgevoerdtransgene dieren, waarbij de levende studie korrels dynamiek bijvoorbeeld bij gebrek aan een specifieke factor van deze korrels.

Stress granulevorming is belangrijk in de respons van cellen op stress, waardoor een cellulaire adaptatie bij geblokkeerde vertaling, totdat de spanning is verdwenen, geassocieerd met het voorkomen van apoptose. Deze test maakt het mogelijk de SG primaire cellen te bestuderen, door de lokalisatie van SG belangrijkste eiwitbestanddelen (figuur 1). G3BP, een belangrijke factor SG samenstel, aanwezig tamelijk diffuus in het cytoplasma van MEF gekweekte neuronen (Figuur 2A a en c)</...

Stress korrels (SG) zijn cytoplasmatische RNA korrels die geïnstalleerd ribonucleoproteïnepartikels (RNP), en belangrijk in cellulaire reactie op diverse spanningen. Dynamiek van SG&#39;s kunnen in levende cellen worden gevolgd door het visualiseren van de lokalisatie van een gelabeld onderdeel van SG in getransfecteerde primaire cellen na stress.

Visualisatie van G3BP Stress Korrels Dynamics Live primaire cellen

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de dynamiek van ribonucleoproteïnegranules in primaire cellen te bestuderen, in het bijzonder de vorming van stressgranules. Dit wordt bereikt door eerst cellen te kweken, zoals embryonale fibroblasten van muizen of hippocampale neuronen van de betreffende dieren. In een tweede stap wordt een getagd component van de stressgranules getransfecteerd om de visualisatie ervan mogelijk te maken.Vervolgens worden de cellen blootgesteld aan stress en gemonitord met time-lapse confocale microscopie. De verkregen resultaten tonen, op basis van directe visualisatie, de dynamiek van G3BP1-bevattende stressgranules in muis- of rat- en hippocampale neuronen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de stressrespons in cellen zoals neuronen.Bij muizen werden bijvoorbeeld neuronale defecten gevonden na knockdown van RNA, waarbij eiwitten die essentieel zijn voor stressgranules werden geblokkeerd. Deze methode kan dus helpen bij het begrijpen van de mechanismen achter deze waarnemingen. Na het eutanasiëren van een zwangere muis in stadium E 13.5, wordt de muis gedesinfecteerd met 90% ethanol en worden de uterine horns verwijderd onder een steriele laminaire flowkast.Breng de hoorns over naar DPBS op 37 °C en verwijder de embryo's. Breng de embryo's over naar een schaal van 100 mm. Verwijder het overtollige weefsel en spoel dit af met warme DPBS.Verwijder nu onder een microscoop de ledematen, de inwendige organen en het bovenste gedeelte van de kop waarin de hersenen zich bevinden. De staart- of kopsecties kunnen worden gebruikt voor genotyping. Hak de resterende weefsels in een aparte schaal gedurende ten minste één minuut fijn.Combineer genotypen niet als deze binnen het nest moeten variëren. Bedek het fijngehakte weefsel met 1x trypsin EDTA en incubeer dit gedurende 30 minuten bij 37 °C. Voeg vervolgens 10 ml volledig mes-medium toe.Om de reactie te stoppen, wordt het weefsel met een pipet losgemaakt en wordt de resulterende suspensie overgebracht naar een buis van 50 milliliter. Vul de buis aan met medium en laat de inhoud bezinken. Decanteer vervolgens de gesuspendeerde cellen.Centrifuge de suspensie vervolgens 5 minuten bij 300 Gs. Resuspendeer het pellet bij kamertemperatuur in zes milliliter compleet medium per embryo. Het aantal levensvatbare gekernde cellen moet ongeveer 5 miljoen per embryo zijn.Vul vervolgens platen van 60 millimeter met drie milliliters celstuspensie en kweek deze. Verschaal de volgende dag het medium en laat de cellen groeien tot confluentie. Wanneer de cellen worden gesubcultured, zullen alleen fibroblasten overleven.Splits de convergente platen over in glazen schaaltjes met een bodem van 35 millimeter. Laat deze schaaltjes uitgroeien tot een confluentie tussen de 50 en 70% en ga vervolgens over tot de transfectie.Houd voor elke schaal van 35 millimeter drie microgram gezuiverd plasmide gereed voor de transfectie. Het gebruik van een commercieel verkrijgbare transfectiekit is voldoende. In dit voorbeeld een vector die de RAs gap tot expressie brengt.Het SSH three domain binding protein wordt getransfecteerd. Het is een belangrijk onderdeel van stressgranules. De procedure is uiteraard van toepassing op de studie van elke vector van belang in fibroblasten, de dag vóór het oogsten van de pup.Bereid de met polylysine gecoate schaaltjes voor door embryo's van moederdieren op 18,5 DPC te verzamelen en deze over te brengen naar HBSS in een grote schaal. Indien gewenst kunnen neonatale pups worden gebruikt om het offeren van de moeder te voorkomen. Snijd de kop af en verwijder de hersenen.Oogst vervolgens de hersenen van de pup in een schone schaal met HBSS onder een microscoop. Verwijder alle hersenvliezen met een fijne pincet. Scheid daarna de gewenste hersendelen, zoals de hippocampi, af.Breng de weefsels over naar 4,5 milliliters koude HPSS in 15 milliliter buisjes en bewaar deze op ijs. Verteer de weefsels door 0,5 milliliters 2,5%trypsine-oplossing toe te voegen. Incubeer deze gedurende 15 tot 20 minuten bij 37 graden Celsius.Spoel vervolgens de trypsine uit met drie wasbeurten met HBSS, waarbij u er voorzichtig op let dat er geen weefsel verloren gaat. Resuspendeer de weefsels nu in een halve tot één milliliter DMM met 10% FBS. Homogeniseer vervolgens het weefsel door het door de pipet te laten stromen.Schakel vervolgens over naar een tip van 200 µL en pipetteer de oplossing totdat er geen zichtbare aggregaten meer aanwezig zijn. Voeg daarna 100 tot 200 µL van de celsuspensie toe aan glazen bodemschalen van 35 mm die zijn voorbereid met DMM FBS-medium en incubeer de schalen. Vervang na drie uur kweek het medium door voorverwarmd Neuron Complete-medium voor de resterende kweektijd.Na vijf tot 14 dagen in cultuur worden de neuronen overgezet met behulp van de calciumfosfaatmethode. 24 uur na een succesvolle transfectie zullen stressgranules zich beginnen te vormen als gevolg van overexpressie van G3BP. Aanvullende stress zal de assemblage van stressgranules verder induceren; verwarm de componenten van de confocale microscoop gedurende ten minste 20 minuten voor, inclusief het verwarmen van de tafel tot 37 °C.Een 35 millimeter platenhouder is vereist vlak voor het visualiseren van de cellen. Voer de volgende stappen uit. Vervang eerst elk celmedium dat fenolrood bevat door een medium zonder fenolrood.Start onmiddellijk met het beelden van de cellen. Stressgranules vormen zich in minder dan een uur, dus stress wordt geïnduceerd na visualisatie van de cellen. Het is belangrijk om de acquisities zo snel mogelijk na de inductie van stress te starten, en om twee parameters nauwkeurig aan te passen afhankelijk van uw celtype en uw type eiwit.Verlaag zowel de laserintensiteit als de duur van de acquisities om cytotoxiciteit te verminderen. Bekijk vervolgens de cellen met een 40 x en 63 x olie-immersieobjectief. Zorg ervoor dat de plaat vlak in de houder ligt en gebruik het fluorescentielicht minimaal.Zodra een interessegebied is gelokaliseerd, gebruikt u de software om beelden te verkrijgen. Begin met een laservermogen van 10% of minder, en stel de gain en de offset in om de best mogelijke signaal-ruisverhouding te verkrijgen. Scan op 1000 hertz om de blootstelling van de cellen aan de laser te minimaliseren, stel de disease stack naar wens in, en houd het scaninterval zo lang mogelijk om de gezondheid van de cultuur beter te behouden.Veramel gegevens zolang dat nodig is; in MEF's vormen granules zich binnen 10 minuten en zijn binnen een uur duidelijk zichtbaar. In neuronen verloopt dit proces iets trager. G3BP zou met de beschreven technieken gedurende ten minste 45 minuten een redelijk sterk signaal moeten geven.De vorming van stressgranules werd gemonitord in gecultiveerde cellen. De lokalisatie van het G3BP-gelabelde eiwit was diffuus in het cytoplasma van gecultiveerde myten en eveneens diffuus in het cytoplasma van neuronen. Na behandeling met arseniet lokaliseerden de eiwitten zich duidelijk in gedefinieerde en grotere foci in beide celtypen.Dit zijn de stressgranules. De gemaakte beelden kunnen worden gereconstrueerd tot een time-lapse-film. De eerste en tweede video's tonen fibroblasten die reageren op stress.De derde video laat hetzelfde zien. In een hippocampale neuron bieden Zack-reconstructies een 3D-lokalisatie van het gelabelde G three B bp en daarmee een ander perspectief op tracking. Na deze procedure kan immunocytochemie worden gebruikt om de granulaire componenten te visualiseren na verschillende soorten stress en na zelf-fixatie.Dit kan kwantitatieve vragen beantwoorden over de grootte en het aantal van de verschillende cellulaire lichamen onder verschillende omstandigheden.

visualization-of-g3bp-stress-granules-dynamics-in-live-primary-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cellulaire processen zoals celmigratie van oudsher bestudeerd op twee-dimensionale, stijve kunststof oppervlakken. Dit rapport beschrijft een techniek voor het direct visualiseren eiwit lokalisatie en het analyseren van eiwitten dynamiek in cellen migreren in een meer fysiologisch relevante, drie-dimensionale matrix.

Live-cell imaging van het migreren van cellen die fluorescent-gemerkte eiwitten in een drie-dimensionale Matrix

This video demonstrates an assay for characterizing and quantifying mammalian stress granules, which consist of mRNAs, RNA-binding proteins (RBPs), and various other proteins.

An Immunofluorescence Assay to Characterize and Quantify Mammalian Stress Granules

Om celdeling te onderscheiden van variaties in de celcyclus in cardiomyocyten, presenteren we protocollen met behulp van twee transgene muislijnen: Myh6-H2B-mCh transgene muizen, voor de ondubbelzinnige identificatie van cardiomyocytenkernen, en CAG-eGFP-anillin muizen, voor het onderscheid tussen celdeling en variaties in de celcyclus.

Visualisatie van celcyclus Variaties en Bepaling van Nucleatie in Postnatale Cardiomyocytes

We beschrijven een methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van stresskorrelvorming in zoogdiercellen nadat de cellen zijn uitgedaagd met bacteriën en een aantal verschillende stressen. Dit protocol kan toegepast worden om de cellulaire stress granule respons te onderzoeken in een breed scala van gastro-bacteriële interacties.

Immunofluorescentie analyse van stress granule vorming na bacteriële uitdaging van zoogdiercellen

Stress Granules (SG's) zijn niet-membraan cytoplasmatische structuren die in cellen vormen die blootstaan ​​aan een verscheidenheid aan stressen. SG's bevatten mRNA's, RNA-bindende eiwitten, kleine ribosomale subeenheden, vertaalgerelateerde factoren en diverse cel signalerende eiwitten. Dit protocol beschrijft een workflow die gebruik maakt van verschillende experimentele benaderingen om bona fide SG's te detecteren, karakteriseren en kwantificeren.

Methoden om Cytoplasmatische Foci te classificeren als Mammalian Stress Granules

Live-cel imaging biedt een schat aan informatie op afzonderlijke cellen of hele populaties die onbereikbaar is door de vaste cel imaging alleen. Hier, worden live-cel imaging protocollen te beoordelen cel lot beslissingen naar aanleiding van de behandeling met de anti-mitotische drug paclitaxel beschreven.

Op lange termijn Live-cel Imaging om te beoordelen van cel lot in reactie op Paclitaxel

Dit protocol beschrijft een gemakkelijke en handige methode om te etiketteren en visualiseren van levende chromosomen in mitotische cellen met behulp van Histone2B-GFP BacMam 2.0 label en een draaiende schijf confocale microscopie systeem.

Levende cel beeldvorming van chromosoom segregatie tijdens de mitose

Hier presenteren we een protocol om de dynamiek van spindel vorming en mitotische progressie te beoordelen. Onze toepassing van time-lapse Imaging stelt de gebruiker in staat om cellen te identificeren in verschillende stadia van mitose, sporen en identificeren mitotische defecten, en analyseren spil dynamiek en mitotische cel lot bij blootstelling aan anti-mitotische drugs.

Live Cell Imaging om de dynamiek van de metafase timing en het lot van de cel na de mitotische spindel perturbations te beoordelen

Vitale fluorescerende kleurstoffen zijn essentiële hulpmiddelen voor Live-celbeeldvormings analyses in moderne schimmel celbiologie. Dit papier Details de toepassing van gevestigde en minder bekende fluorescerende kleurstoffen voor het volgen van plasma membraan dynamiek, Endo-/exocytose en celwand morfogenese in filamenteuze schimmels.

Toepassing van selectieve fluorescerende kleurstoffen voor membraan-en celwand voor het beeldvorming van filamenteuze schimmels in levende cellen

We presenteren een vrij beschikbare workflow gebouwd voor snelle verkenning en nauwkeurige analyse van cellulaire lichamen in specifieke celcompartimenten in fluorescentiemicroscopie beelden. Deze gebruiksvriendelijke workflow is ontworpen op de open-source software Icy en maakt ook gebruik van ImageJ functionaliteiten. De pijplijn is betaalbaar zonder kennis van beeldanalyse.

Substructuur Analyzer: Een gebruiksvriendelijke workflow voor snelle verkenning en nauwkeurige analyse van cellulaire lichamen in fluorescentiemicroscopie beelden

Het volgende protocol presenteert de detectie van enkelstrengs DNA-foci in de G1-fase van de celcyclus met behulp van celcyclussynchronisatie gevolgd door RPA2-immunofluorescerende kleuring.

Visualisatie van enkelstrengs DNA-foci in de G1-fase van de celcyclus

Leer de dynamiek van stresskorrels visualiseren in primaire cellen zoals muizenembryofibroblasten en hippocampale neuronen. Deze methode biedt inzicht in neuronale stressresponsen en celbiologische mechanismen.

Visualisatie van G3BP Stress Korrels Dynamics Live primaire cellen

Meer video's verkennen