Microfluidic Platform voor het meten neutrofielchemotaxis van onverwerkte volbloed

Deze microfluïdische technologie is bedoeld om de functionaliteit van menselijke neutrofielen direct te meten vanuit één druppel bloed op een platform dat gemultiplext kan worden. De centrale laadkamer dient als bron van volbloed en fungeert tevens als afvoer voor de chemoattractant-gradiënten die ontstaan vanuit de 16 focale chemotactische kamers. De unieke mechanische filtratie van rode bloedcellen maakt het mogelijk om de functie van neutrofielen te onderzoeken in de natuurlijke context van bloed, cellulaire en biochemische componenten.

De vertakking tussen een kanaal dat naar de focale chemotactische kamer leidt en een kanaal dat het apparaat verlaat, maakt kwantificering en modulatie van de directionaliteit van migrerende neutrofielen mogelijk. Hierdoor kunnen resultaten aantonen hoe actief migrerende neutrofielen gemakkelijk langs gevangen rode bloedcellen migreren en in aantal toenemen over de tijd. Een uniek kenmerk van onze microfluïdische apparaten is dat ze zeer eenvoudig te vervaardigen en op te stellen zijn.

Deze bestaan uit een laag PDMS die gegoten is op een micro-gefabriceerde wafer, welke we hechten aan een glasbodem plaat met één of meerdere putjes. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er slechts een druppel volbloed nodig is. De apparaten kunnen worden gebruikt met standaard pipetten, hebben geen bewegende delen en vereisen geen slangetjes of externe spuitpompen.

De implicaties van deze techniek reiken verder dan die van traditionele technieken in klinische toepassingen. Onze aanpak kost slechts enkele minuten van het moment van bloedafname tot de neutrofielenmigratie-assays. De innovatieve filterkammen voor rode bloedcellen voorkomen dat RBC's de actieve migratie van neutrofielen blokkeren, wat deze methode onderscheidt van andere microfluïdische methoden.

Dat vereist het verwijderen van het bloed voordat de chemo-assays worden uitgevoerd. De mechanische blokkade van rode bloedcellen en kanalen onderscheidt onze technologie en maakt het mogelijk om neutrofielen te testen in de fysiologische omgeving van volbloed, inclusief serum en bloedplaatjes. Deze technologie is dus nauwkeurig en eenvoudig in gebruik, en het kan ons begrip van de rol van neutrofielen en het aangeboren immuunsysteem bij gezondheid en ziekte aanzienlijk verbeteren.

Stel de master mold-wafer op om de migratiekanalen te definiëren volgens de instructies van de fabrikant First pattern. Breng vervolgens de eerste laag negatieve epoxy-gebaseerde fotoresist van 3 micron aan en patroon daarna de tweede laag van 50 micron om de celladings- en chemokinekamers te definiëren. Meng nu, om de Polymethylsiloxaan-toestellen te gieten, 20 gram PDMS gedurende vijf minuten krachtig met twee gram initiator.

Giet de PDMS voorzichtig op de gepatroneerde wafer en ontgas deze gedurende één uur in een vacuümdesiccator. Bak en harden vervolgens de PDMS-microfluïdische apparaten gedurende ten minste drie uur in een oven op 65 °C. Om er zeker van te zijn dat de PDMS bij de juiste temperatuur wordt gebakken, dient de interne oventemperatuur met een thermometer te worden gecontroleerd.

Stans de centrale laden voor volbloed uit met een diameter van 1,5 millimeter. Stans daarnaast volledige donutvormige hulpmiddelen uit met een diameter van 5,0 millimeter. Verwijder de partikels uit de donutvormige hulpmiddelen met behulp van plakband.

Spoel vervolgens een multi-wellplaat af met gedeïoniseerd water en droog deze met stikstof nadat de plaat vijf minuten in een oven van 60 °C heeft gestaan. Behandel de plaat gedurende 35 seconden met zuurstofplasma. Voeg daarna de donut-devices en zuurstofplasma toe.

Behandel opnieuw gedurende nog eens 35 seconden. Breng de apparaten voorzichtig over naar de wells van de plaat en bak de verbonden apparaten 10 minuten op een warmteplaat van 80 °C. Na de zuurstofplasmabehandeling is het apparaat hydrofiel en kunnen capillaire effecten het primen van de kleine kanalen in het apparaat bevorderen.

Meng voor de chemo-attractantoplossing vijf µL van 10 µM FMLP met vijf µL fibronectine van 1 mg/mL en 490 µL HBSS. Pipetteer de chemo-attractantoplossing langzaam in de pipetteerkamer voor het laden van volbloed en breng extra 20 µL van de chemo-attractant aan rond de buitenkant van het apparaat. Plaats de plaat gedurende 15 minuten in een exsiccator.

Pas een vacuüm toe op het apparaat om het apparaat te primen met de chemo-attractantoplossing. Verwijder de plaat uit de desiccator en bevestig de bevochtiging van het kanaal van het apparaat door de geleidelijke afname van de grootte van de luchtbel. Was vervolgens de laadkamer voor volbloed en de buitenkant van het apparaat grondig om overtollige chemo-attractantoplossing te verwijderen.

Vervolgens wordt een gradiënt van chemo-attractant gegenereerd van elk van de focale chemotactische kamers naar het midden van het apparaat. Injecteer voorzichtig 100 µL PBS in het gat, zodat er een druppel PBS bovenop het apparaat vormt. Kantel de plaat en pipetteer 1 mL PBS rondom het apparaat om deze op de bodem van de well te verzamelen; aspireer de vloeistof en herhaal de PBS-wasstap drie keer.

Vul vervolgens elke well met medium om de apparaten onder te dompelen en laat de gradiënt 15 minuten stabiliseren. Pipetteer daarna langzaam twee µL volbloed in elke laadkamer voor volbloed. Was bij bloedafname via een vingerprik de handen met zeep en water.

Droog de huid als een anticoagulantia-kleuringsoplossing. Voeg één milliliter 0,2% HSA en 10 microliters 32,4 micromolaire hooks toe. Kleur een heparinebuis voor bloedafname, prik de vinger van de gezonde donor en veeg de eerste bloeddruppel weg.

Verzamel 50 µL bloed in de antistollingskleuringsoplossing en meng dit voorzichtig. Stel de biokamer in op 37 °C, 80% vochtigheid en 5% CO2. Start onmiddellijk de time-lapse imaging bij een vergroting van 10 x of hoger; volg voor een betekenisvolle statistische analyse handmatig ten minste 50 neutrofielen in elk monster.

Tel het aantal cellen dat gedurende een bepaalde tijd de focale chemotaxiskamers binnengaat. Bereken vervolgens met ImageJ de snelheden van de neutrofielen in het kanaal tussen de WBLC en FCC. Om de directionaliteit van de neutrofielen te kwantificeren, telt u het aantal cellen dat de bifurcatie passeert en berekent u de verhouding tussen het aantal cellen dat afbuigt naar de focale chemotaxiskamers en de cellen die het apparaat verlaten.

Cellen die niet directioneel zijn, volgen de chemotactische gradiënt niet en migreren daarom in gelijke aantallen naar de FCC en het uitlaatkanaal. In dit experiment werd de chemotaxis-assay voor neutrofielen in volbloed gevalideerd door de accumulatie van neutrofielen naar een FMLP-gradiënt te meten. De resultaten bevestigen dat de rode bloedcellen worden tegengehouden door de filtratiekam, terwijl de neutrofielen in staat zijn om actief uit het volbloed te migreren.

De stabiele lineaire chemo-attractantgradiënt die werd gevormd door het microfluïdische apparaat voor volbloed werd bevestigd met FSE-gelabeld dextran, waarbij de fluorescentieniveaus in de loop van de tijd werden gemeten. Resultaten verkregen met het nieuwe WB Chemotaxis-platform onthullen dat neutrofielen uit alle bloedbronnen migreren met een consistente snelheid en een vergelijkbaar totaal aantal migrerende cellen. Belangrijk is dat dit systeem kwantificering van de neutrofielen mogelijk maakt en chemotaxis daarom onderscheidt van chemokinese. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in minder dan 10 minuten worden uitgevoerd indien deze correct wordt toegepast.

De integratie van ons apparaat in een plaat met 12 of 24 putjes met behulp van standaard cleanroomtechnieken en -faciliteiten maakt het mogelijk om meerdere condities gelijktijdig te screenen. Met deze techniek zijn wij in staat om de snelheid en directionaliteit van neutrofielen op enkelcelniveau te meten. In tegenstelling tot traditionele methoden die de bulk-eindpuntmigratie van cellen meten, dient u eraan te denken om het microfluïdische apparaat zorgvuldig te primen en beide monsters langzaam te laden, zodat RBC's niet voorbij de com van het apparaat worden geduwd.

Het beschreven protocol is bijzonder nuttig voor het meten van transiënte chemotactische deficiënties van neutrofielen, waardoor herhaalde bemonstering over meerdere tijdspunten mogelijk is, maar kan ook worden aangepast voor het meten van de migratie van andere celtypen uit verschillende modelorganismen. Deze methode kan inzicht bieden in tijdelijke veranderingen in de functionaliteit van neutrofielen bij patiënten met diverse aandoeningen die gepaard gaan met een hogere incidentie van infecties, waaronder traumapatiënten, patiënten na een grote operatieve ingreep en kankerpatiënten die chemotherapie ondergaan.