Name: Microfluidic Platform voor het meten neutrofielchemotaxis van onverwerkte volbloed (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Leer een microfluidisch platform voor het meten van neutrofielchemotaxis uit onverwerkte volbloed. Deze methode maakt snelle, kwantitatieve analyse van neutrofielmigratie mogelijk zonder celisolatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Steun van de National Institutes of Health (verleent GM092804, DE019938) en Shriners Burns Hospital.

1. Microfluidic Device Fabrication <ol><li> Met behulp van standaard fotolithografische technieken, fabriceren de meester mal wafer in een klas 1000 schone kamer. Patroon de eerste 3-urn dunne epoxy gebaseerde negatieve fotolaklaag de migratie kanalen definiëren volgens de instructies van de fabrikant. Patroon van de tweede 50-urn dikke laag om de cel-laad-en chemokine kamers definiëren. </li><li> Gebruik de patroon wafer te polydimethylsiloxaan (PDMS) apparaten uitgebracht. Krachtig mengen PDMS (20 g) met initiator (2 g) gedurende 5 min met behulp van plastic vork in grote plastic weegvlak. </li><li> Giet PDMS op schimmel. </li><li> Ontgas de PDMS door het plaatsen mal met PDMS gegoten in een vacuüm exsiccator gedurende 1 uur. </li><li> Bak en genezen PDMS microfluïdische inrichtingen ten minste 3 uur in een oven ingesteld op 65 ° C. </li><li> Pons de centrale WBLCs behulp van een perforator met een tip diameter van 1,5 mm. </li><li> Pons hele donut-vormige apparaten met een punctuelehaar met een tip diameter van 5,0 mm. </li><li> Stofdeeltjes verwijderen uit donut apparaten met behulp van plakband. </li><li> Spoel een 12-wells plaat met gedemineraliseerd water en daarna droog met stikstof. Plaats plaat in 60 ° C oven gedurende 5 minuten. </li><li> Zuurstof plasma behandeling van de 12-well plaat twee keer; een keer alleen voor 35 sec en dan weer met de donut apparaten voor nog eens 35 sec. </li><li> Plaats apparaten zorgvuldig in de putjes van de plaat met een pincet. </li><li> Bak plaat met gekoppelde apparaten op een hete plaat is ingesteld op 80 ° C gedurende 10 minuten. </li></ol> 2. Microfluidic Assay Voorbereiding <ol><li> Prime microfluïdische apparaten direct na zuurstofplasma behandeling, wanneer het apparaat is hydrofiel en capillaire effecten priming van de kleine kanalen in de inrichting bevorderen. </li><li> Maak chemoaantrekkende oplossing door het mengen van 5 pl fMLP [stockoplossing 10 uM] met 5 pi fibronectine [voorraad oplossing 1 mg / ml] en 490 pi HBSS. </li><li> Langzaam pipet &amp; #160; chemoaantrekkende oplossing in WBLC, met behulp van een gel laad-tip (Figuur 1A). Pipet extra 20 ul van de chemoattractant rond de buitenkant van het apparaat. </li><li> Plaats plaat in een exsiccator gedurende 15 minuten. Door een vacuüm op de inrichting wordt de oplossing ingedruppeld in de zij-kanalen van de inrichting en de verplaatste lucht verspreid via de PDMS. </li><li> Verwijder de plaat uit exsiccator en bevestigen bevochtiging van het apparaat kanaal onder de microscoop. Kijk als bubble wordt kleiner naarmate chemoattractant oplossing komt in de kamer. Geen bel moet aanwezig zijn in de inrichting na vacuüm behandeling. </li><li> Was de WBLC en buitenkant van het apparaat grondig te chemoaantrekkende overtollige oplossing te verwijderen. Deze stap genereert een gradiënt van chemoattractant van elk van de focale chemotactische kamers (FCC) naar binnen apparaat. <ol><li> Vul een spuit van 1 ml met PBS, voeg een 30 G stompe naald aan de spuit. Voorzichtig, steek de naald van de spuit innaar het midden van de donut hole. Duw 100 ul PBS in het gat, zodat een druppel PBS vormen bovenop het apparaat. </li><li> Tilt plaat en pipet 1 ml PBS ongeveer inrichting zodat de vloeistof verzameld op de bodem van de put. Zuig de vloeistof en herhaal proces voor in totaal 3x met verse bufferoplossing (gebruik de media in plaats van buffer indien de gescheiden neutrofielen in de media wordt geladen) 9. </li></ol></li><li> Vul elk putje met media tot de bovenkanten van de apparaten zijn ondergedompeld onder vloeistof. Laat de apparaten zitten gedurende 15 minuten te laten gradiënt te stabiliseren. Experimentele resultaten en theoretische gegevens van eindige elementen simulaties blijkt dat de gradiënten in deze apparaten zijn stabiel tot 24 uur voor kleine moleculen (bijvoorbeeld fMLP) en tot enkele dagen voor groter molecuulgewicht (bijvoorbeeld IL8). </li><li> Met behulp van gel plaatsen Tips, langzaam pipet 2 pi van bloed (of geïsoleerde neutrofielen) in elke volbloed loading kamer (WBLC) (Figuur 1A). </li></ol> 3. Monstervoorbereiding Menselijke neutrofielen uit capillair bloed <ol><li> Verzamelen capillair bloed uit de vinger prikken van gezonde vrijwilligers, die op geen immunosuppressiva. Alle patiënten monsters werden verkregen met informed consent, en procedures die door de MGH en Shriners Institutional Review Boards goedgekeurd. <ol><li> Voor vingerprik bloedafname, de handen wassen met water en zeep en droog de huid. Bereid anti-coagulant/stain voorraad oplossing door het toevoegen van 1 ml HBSS + 0,2% HSA en 10 pl Hoechst vlek (32,4 uM) om bloedafname (1.65 USP/50 ul bloed) heparine. Prik de vinger met behulp van een SurgiLance prikapparaatje (2.2-mm diepte, 22 G), veeg eerste druppel bloed en het verzamelen van 50 ul van bloed in Eppendorf buisje met de voorraad anti-stollingsmiddel en Hoechst fluorescerende vlek oplossing (10 pl) en voorzichtig mengen. </li></ol></li&gt; <li> Incubeer het bloed en Hoechst kleuring gedurende 10 min om voor kern fluorescente kleuring. Run monster binnen 1 uur van bloedafname. </li></ol> Menselijke neutrofielen uit veneuze bloed <ol start="3"><li> Trek 10 ml perifeer veneuze bloed in buisjes die 33 USP heparine. </li><li> Voeg 50 ul van veneus bloed media en Hoechst vlek zoals eerder beschreven. Incubeer het bloed en Hoechst kleuring gedurende 10 min om voor kern fluorescente kleuring. Run monster binnen 1 uur van bloedafname. </li></ol> Neutrofielen Afscheiding uit volbloed - Positive Control <ol start="5"><li> Neutrofielen gescheiden, steriel technieken om neutrofielen te isoleren van de 10 ml veneus bloedmonster gebruikt Hetastarch (6% w / v) dichtheidsgradiënt gevolgd door een negatieve selectie magnetisch bolletje isolatiekit volgende protocol van de fabrikant. </li><li> Geresuspendeerd de uiteindelijke hoeveelheid van neutrofielen op een concentrtie van 4.000 cellen / ul in 1X HBSS + 0,2% humaan serumalbumine. Laat cellen bij 37 ° C tot klaar om het experiment uit te voeren. </li></ol> 4. Microscopie en beeldanalyse voor neutrofielchemotaxis Metingen <ol><li> Stel biochamber temperatuur tot 37 ° C, 80% vochtigheid en CO 2 bij 5%. </li><li> Start beeldvorming onmiddellijk met behulp van time-lapse imaging op een microscoop (10X of hogere vergroting). </li></ol> 5. Statistische analyse <ol><li> Handmatig bijhouden minstens 50 neutrofielen in elk monster. </li><li> Tel de cellen die in de FCC in de tijd (Figuur 2). </li><li> Bereken neutrofielen snelheden in het kanaal tussen WBLC en FCC met ImageJ (NIH) (Figuur 2). </li><li> Kwantificeren gerichtheid van neutrofielen door telling van het aantal cellen dat de bifurcatie passeren en het berekenen van de verhouding tussen het aantal cellen dat keren naar de FCC en cellen die uitgang ee apparaat. Cellen die niet directionele zijn niet aan de chemotactische gradiënt en daarom migreren in gelijke aantallen in de richting van de FCC en de afrit kanaal (figuur 2). </li></ol>

<ol><li>Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and atherosclerosis.</a> Annual review of pathology. 1, 297-329 (2006).</li>
<li>Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neutrophil+in+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">The neutrophil in vascular inflammation.</a> Nature medicine. 17, 1381-1390 (2011).</li>
<li>Butler, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burn+injury+reduces+neutrophil+directional+migration+speed+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices.</a> PloS one. 5, (2010).</li>
<li>Lavrentieva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+markers+in+patients+with+severe+burn+injury.+What+is+the+best+indicator+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Burns+%3A+journal+of+the+International+Society+for+Burn+Injuries%22%5BJournal%5D)">Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis.</a> Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).</li>
<li>De Filippo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+and+macrophage+chemokines+CXCL1%2FCXCL2+control+the+early+stage+of+neutrophil+recruitment+during+tissue+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation.</a> Blood. 121, 4930-4937 (2013).</li>
<li>Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+serum+heat+treatment+on+chemotaxis+and+phagocytosis+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Palabrica, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+accumulation+promoting+fibrin+deposition+is+mediated+in+vivo+by+P-selectin+on+adherent+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets.</a> Nature. 359, 848-851 (1992).</li>
<li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+kit-on-a-lid%3A+a+versatile+platform+for+neutrophil+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays.</a> Blood. 120, (2012).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chambers+for+monitoring+leukocyte+trafficking+and+humanized+nano-proresolving+medicines+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).</li>
<li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods Mol Biol. 412, 15-20 (2007).</li>
<li>Lyons, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+human+leucocyte+subsets%3A+the+advantages+of+positive+selection+and+rapid+purification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification.</a> BMC genomics. 8, (2007).</li>
<li>Hasenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immunomagnetic+negative+enrichment+of+neutrophil+granulocytes+from+murine+bone+marrow+for+functional+studies+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo.</a> PloS one. 6, (2011).</li>
<li>Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+assay+from+a+drop+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration assay from a drop of blood.</a> Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).</li>
<li>Hoang, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+neutrophil+speed+and+directionality+during+chemotaxis%2C+directly+from+a+droplet+of+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood.</a> Technology. 0, 1-9 (2013).</li>
<li>Kurihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvin+D2+restores+neutrophil+directionality+and+improves+survival+after+burns%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal+%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).</li>
<li>Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+function+in+surgical+patients.+Relationship+to+adequate+bacterial+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses.</a> Arch Surg. 119, 39-43 (1984).</li>
<li>Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+inhibition+of+chemotaxis+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).</li>
</ol>

Er zijn geen belangenconflicten bekend te maken.

In dit werk hebben we een microfluïdische platform om neutrofielchemotaxis meet van een druppel bloed (2 pi). De on-chip mechanische filtratie van RBC van actief neutrofielen migreren omzeilt de noodzaak voor omslachtige cellen scheidingsmethoden zoals dichtheidsgradiënten 10, 11 positieve selectie, negatieve selectie of 12, die gevoelig zijn voor artefacten introduceren door het activeren neutrofielen. De mechanische filtratie van RBC onderscheidt onze technologie van andere microfluïdische chips ...

<html> Neutrofielen handel speelt een cruciale rol bij het ​​bepalen van de voortgang en oplossen van vele inflammatoire aandoeningen, zoals atherosclerose 1, bacteriële infectie of sepsis 2 en brandwonden 3. Voor hun belangrijke bijdrage aan de gezondheid en ziekte voorwaarden, aantal neutrofielen is onderdeel van de standaard bloedanalyse vaak beschouwd in klinische en onderzoekslaboratoria. Ondanks dat een van de meest alomtegenwoordige proeven en de waarde van neutrofielen in de diagnose van infectie en sepsis is herhaaldelijk ondervraagd 4. Bijvoorbeeld, een studie van neutrofielen bij patiënten met brandwonden is gebleken dat het aantal neutrofielen en de migratie van neutrofielen functie komen niet overeen; betekent dat neutrofielen alleen is niet een nauwkeurige indicator van immune status 3. Hoewel moeilijker te meten, heeft neutrofielen functionele bevoegdheid voorgesteld als meer waardevol in een breed scala van omstandigheden. t &quot;&gt; Belangrijk veel neutrofielen gebreken voorbijgaande en worden niet veroorzaakt door permanente genetische defecten, een onderscheid dat grotendeels over het hoofd gezien in de kliniek tot voor kort. In het kader van brandwonden kunnen neutrofiel migratie tijdens gecontroleerd behandeling van een patiënt als een indicator van ontstekingsstatus of infectie 3. Traditionele migratie assays momenteel in het laboratorium (Boyden-kamer, Dunn kamer, micropipet assay) kan worden vertaald naar een klinische omgeving omdat ze grote hoeveelheden bloed nodig en omslachtig tijdrovend neutrofielen isolatietechnieken (tabel 1). Deze testen kunnen ook niet worden gebruikt om tijdelijke neutrofiel chemotaxis in kleine proefdieren, zoals muizen volgen, aangezien het volume van bloed nodig voor neutrofielen isolatie maakt slechts een monster en vereist vaak zelfs bundelen bloed van meerdere dieren een enkele assay. Bijvoorbeeld, een studie waarbij multiple voorwaarden en behandelingen over meerdere tijdstippen kan mogelijk duizenden muizen vereisen het gebruik van de huidige chemotaxis assays. Dit beperkt het fundamenteel biologisch onderzoek dat kan worden gedaan om de complexe dynamiek van de immuunfunctie te begrijpen in de context van verwonding, infectie of verbranden vaak bestudeerd in muizenmodellen 5. Om de noodzaak van een neutrofiel functionele test die is snel, robuust, terwijl die minimaal volume bloed pakken hebben we een microfluïdische apparaat dat neutrofielchemotaxis meet direct van een kleine druppel bloed ontwikkeld. Het is bekend dat veel factoren in volbloed, zoals serum 6 en 7 bloedplaatjes invloed neutrofielfunctie. Het is derhalve gunstig dat het volbloed microfluïdische assay minimaliseert monster verwerking de in vivo micro-omgeving van de neutrofielen handhaven wanneer het meten van variaties in chemotaxis met een in vitro assay 8. Deze aanpakvermindert de tijd van bloedafname tot neutrofielen migratie assays van uren met behulp van traditionele technieken, om slechts enkele minuten (Tabel 1). De volbloed microfluïdische platform produceert een lineaire gradiënt chemoattractant voor de duur van het experiment, heeft geen bewegende delen en geen externe drukbron (dwz spuitpomp) vereisen. Het belangrijkste kenmerk van het ontwerp van het volbloed microfluïdische apparaat is de opname van een rode bloedcel (RBC) filtratie kam die mechanisch filtert RBC betreden de migratie kanaal van de inrichting. De rechter bochten van deze filtratie kam voorkomen dat de noodzaak voor de grootte uitsluiting filtratie, die waarschijnlijk zouden worden verstopt door rode bloedcellen en dus blokkeren de chemoattractant gradiënt van het bereiken van het actief migreren neutrofielen in de WB. De opname van het volbloed microfluïdische inrichting een 12 of 24-well plaat vergemakkelijkt het screenen van meerdere mediatoren van menselijke of murine neutrofielchemotaxis sigelijkertijd.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Apparaatfabricage</td></tr><tr><td>SU-8</td><td>Microchem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxaan (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>Sylgard 184 1.1 lb. Kit</td><td></td></tr><tr><td>Standaard glazen slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>125495</td><td>1 X 3 inches</td></tr><tr><td>Glazen bodemplaat</td><td>MatTek</td><td>P12G-1.5-14-F</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15081</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15072</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microfluidische Assay Voorbereiding en Analyse</td></tr><tr><td>Gel-loading pipet tip</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-139</td><td></td></tr><tr><td>Spuit</td><td>Fisher Scientfic</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Blunt tip naald, 30 G &frac12; in.</td><td>Brico Medical Supply</td><td>BN3005</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer, Heparine</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humaan serum albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5843-5G</td><td>0.2% eindconcentratie in HBSS</td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895-1MG</td><td></td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506-10MG</td><td></td></tr><tr><td>SurgiLance veiligheidslancet, 2.2-mm diepte, 22 G</td><td></td><td>SLN240</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst kleurstof</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Positieve Controle</td></tr><tr><td>HetaSep</td><td>STEMCELL Technologies Inc.</td><td>7906</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human Neutrophil Verrijkingskit</td><td>STEMCELL Technologies Inc.</td><td>19257</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Asher</td><td>March Instruments</td><td>P-250</td><td></td></tr><tr><td>Lindberg/Blue M Oven</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-258-30C</td><td></td></tr><tr><td>RVS Precisie Pincet</td><td>Techni Tool</td><td>758TW458</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art Scienceware Chemisch Resistente Vacuum Desiccator</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>Dataplate Digital Hot Plate</td><td>Alpha Multiservices</td><td>PMC 720</td><td></td></tr><tr><td>Nikon TiE omgekeerd microscoop</td><td>Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objectief</td><td>Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td><td>MRH20101</td><td></td></tr><tr><td>Lumen 200 met 2 Meter Licht Gids voor Nikon</td><td>Nikon - Micro Video Instruments Inc.</td><td>500-L200NI2</td><td></td></tr><tr><td>DAPI/Hoechst/AMCA Nauw Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters</td><td>Chroma - Micro Video Instruments Inc.</td><td>31013v2</td><td></td></tr><tr><td>Retiga R 2000 gekoelde CCD Camera 1.600 x 1.200 pixels</td><td>Qimaging - Micro Video Instruments Inc.</td><td>RET-2000R-F-M-12-C</td><td></td></tr></tbody></table>

microfluidic platform voor het meten neutrofielchemotaxis van onverwerkte volbloed

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrofielen spelen een essentiële rol in de bescherming tegen infecties en hun aantallen in het bloed wordt vaak gemeten in de kliniek. Hoger aantal neutrofielen in het bloed zijn meestal een indicator van de lopende infecties, terwijl een lage neutrofielen zijn een waarschuwing voor hogere risico&#39;s op infecties. Om hun taken te volbrengen, neutrofielen moeten ook effectief te kunnen verplaatsen van het bloed, waar ze het grootste deel van hun leven door te brengen, in de weefsels, waar infecties optreden. Bijgevolg kunnen defecten in het vermogen van neutrofielen migreren risico verhogen op infecties, zelfs als neutrofielen aanwezig in geschikte aantallen in het bloed. Echter, het meten van de migratie van neutrofielen mogelijkheid in de kliniek is een uitdagende taak, die is tijdrovend, vereist een grote hoeveelheid bloed, en expertkennis. Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een robuust microfluïdische assays voor de migratie van neutrofielen, die een enkele druppel bloed onverwerkte vereist, omstandigopeningen de noodzaak van neutrofielen scheiding en is gemakkelijk te kwantificeren op een eenvoudige microscoop. In deze assay, neutrofielen migreren direct uit het bloed druppeltje, door kleine kanalen, naar de bron van chemoattractant. Om de granulaire stromen van rode bloedcellen voorkomen dat via dezelfde kanalen, implementeerden we mechanische filters met rechte hoek blijkt dat het voorschot van rode bloedcellen selectief blokkeren. We gevalideerde de test door de migratie van neutrofielen vergelijken van bloed druppels verzameld uit vingerprik en veneuze bloed. We vergeleken ook deze volbloed (WB) bronnen met de migratie van neutrofielen uit monsters van gezuiverd neutrofielen en vonden constante snelheid en richting tussen de drie bronnen. Dit microfluïdische platform zal de studie van neutrofielen migratie menselijke staat in de kliniek en de instelling onderzoek helpen ons begrip van neutrofielen functies in gezondheid en ziekte.

De volbloed (WB) neutrofielchemotaxis test werd gevalideerd door de accumulatie van neutrofielen naar een fMLP gradiënt (Movie S1). Resultaten bevestigen dat RBC zijn gevangen door de filtratie kam terwijl neutrofielen (blauw) actief kunnen migreren van volbloed (figuur 3A en Movie S1). De stabiele lineaire chemoattractant gradiënt (groen) wordt gevormd door de volbloed microfluïdische apparaat werd bevestigd met behulp van FITC-gelabelde dextran (figuur 3A</str...

Dit protocol Gegevens een test ontwikkeld om menselijk neutrofielchemotaxis meet van een druppel bloed met robuuste reproduceerbaarheid. Deze benadering omzeilt de noodzaak van neutrofielen scheiding en vereist slechts een paar minuten assay voorbereidingstijd. De microfluïdische chip maakt het mogelijk de herhaalde meting van neutrofielchemotaxis loop van de tijd bij zuigelingen of kleine zoogdieren, waar monster volume beperkt is.

Microfluidic Platform voor het meten neutrofielchemotaxis van onverwerkte volbloed

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Deze microfluïdische technologie is bedoeld om de functionaliteit van menselijke neutrofielen direct te meten vanuit één druppel bloed op een platform dat gemultiplext kan worden. De centrale laadkamer dient als bron van volbloed en fungeert tevens als afvoer voor de chemoattractant-gradiënten die ontstaan vanuit de 16 focale chemotactische kamers. De unieke mechanische filtratie van rode bloedcellen maakt het mogelijk om de functie van neutrofielen te onderzoeken in de natuurlijke context van bloed, cellulaire en biochemische componenten.De vertakking tussen een kanaal dat naar de focale chemotactische kamer leidt en een kanaal dat het apparaat verlaat, maakt kwantificering en modulatie van de directionaliteit van migrerende neutrofielen mogelijk. Hierdoor kunnen resultaten aantonen hoe actief migrerende neutrofielen gemakkelijk langs gevangen rode bloedcellen migreren en in aantal toenemen over de tijd. Een uniek kenmerk van onze microfluïdische apparaten is dat ze zeer eenvoudig te vervaardigen en op te stellen zijn.Deze bestaan uit een laag PDMS die gegoten is op een micro-gefabriceerde wafer, welke we hechten aan een glasbodem plaat met één of meerdere putjes. Het belangrijkst

microfluidic-platform-for-measuring-neutrophil-chemotaxis-from

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van bacteriële chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten van chemoeffectors.

Een microfluïdische apparaat voor het kwantificeren van Bacteriële Chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten

This video demonstrates neutrophil chemotaxis assay using an all-on-chip method. The method allows direct isolation of neutrophils from the whole blood by immunomagnetic negative selection followed by chemotaxis assay on a microfluidic chip.

A Microfluidic Chip-Based Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Using Whole Blood

Neutrofielaanhechting aan de geactiveerde endotheel op plaatsen van infectie is een integraal onderdeel van de gastheer ontstekingsreactie. Beschreven in dit rapport is een neutrofiel binding assay die het mogelijk maakt voor...

Kwantitatief<em&gt; In vitro</em&gt; Assay om neutrofieladhesie Maatregel om Activated primaire humane microvasculaire endotheelcellen onder statische omstandigheden

Leukocyten steken de endotheelcellen monolaag met behulp van de paracellulaire of de transcellulaire route. We ontwikkelden een eenvoudige test om te volgen de verdeling van endogene junctionele VE-cadherine en PECAM-1 tijdens de migratie van leukocyten onder fysiologische stroom te maken tussen de twee transmigratie routes.

Real-time beeldvorming van endotheelcellen-cel Junctions Tijdens Neutrophil Transmigration onder fysiologische Flow

Visual chemotaxis assays zijn essentieel voor een beter begrip van hoe eukaryotische cellen te controleren-chemoattractant gemedieerde directionele cel migratie. Hier beschrijven we gedetailleerde methoden voor: 1) real-time, hoge-resolutie controle van meerdere chemotaxis assays, en 2) tegelijkertijd het visualiseren van de chemoattractant gradiënt en de spatiotemporele dynamiek van de signalering gebeurtenissen in neutrofielen-achtige HL60 cellen.

Imaging G-eiwit-gekoppelde receptor-gemedieerde Chemotaxis en de signalering evenementen in neutrofielen-achtige HL60 Cells

Dit artikel geeft de gedetailleerde methode om een ​​snelle neutrofiele chemotaxis-analyse te verrichten door de integratie van de on-chip neutrofiele isolatie uit volledig bloed en de chemotaxis-test op een enkele microfluïdische chip.

Een all-on-chip methode voor snelle neutrofiele chemotaxis analyse direct van een druppel bloed

Protocollen voor kwantitatieve beoordeling van lymfocyt chemotaxis en migratie zijn belangrijke hulpmiddelen voor onderzoek van de immunologie. Hier, wordt een in vitro -protocol beschreven dat vergunningen real-time, multiplexed evaluatie van cel migratie, alsmede een complementaire in vivo techniek waardoor tracking van inheemse cellen met milt.

Kwantificeren van menselijke monocyt Chemotaxis In Vitro en lymfkliertest lymfocyt handel In Vivo

In dit onderzoek tonen we een label-vrije neutrofiele scheiding methode van klinische airway afscheidingen met kringloopsysteem bewerking van spiraal inertial microfluidics. De voorgestelde methode zou het uitbreiden van de klinische in vitro tests voor verschillende aandoeningen van de luchtwegen.

Label-vrije neutrofiele verrijking van patiënt-afgeleide Airway secretie met behulp van Closed-loop Inertial Microfluidics

Collectieve Celmigratie in ontwikkeling, wondgenezing en kanker metastasen wordt vaak geleid door de gradiënten van groeifactoren of signalering van moleculen. Hier beschreven is een experimenteel systeem dat tractie microscopie combineert met een microfluïdisch systeem en een demonstratie van het kwantificeren van de mechanica van collectieve migratie onder biochemische gradiënt.

Tractie microscopie geïntegreerd met microfluïdica voor Chemotactische collectieve migratie

Dit protocol genereert biodeeltjesmicroarrays die ruimtelijk gecontroleerde neutrofiele zwermen bieden. Het biedt gemakkelijke toegang tot de bemiddelaars die neutrofielen vrijgeven tijdens de migratie en maakt kwantitatieve beeldvormingsanalyse mogelijk.

Bioparticle Microarrays voor Chemotactic en Moleculaire Analyse van menselijke Neutrofiele Zwermen in vitro

In dit protocol wordt een biomimetische microfluïde assay, die een fysiologisch relevante microvasculaire omgeving kan reproduceren en de gehele leukocytenadhesie / migratiecascade kan reproduceren, gebruikt om leukocyten-endotheelcelinteracties bij ontstekingsziekten te bestuderen.

Een microfysiologisch systeem om leukocyten-endotheelcelinteractie tijdens ontsteking te bestuderen

Leer een microfluidisch platform voor het meten van neutrofielchemotaxis uit onverwerkte volbloed. Deze methode maakt snelle, kwantitatieve analyse van neutrofielmigratie mogelijk zonder celisolatie.

Microfluidic Platform voor het meten neutrofielchemotaxis van onverwerkte volbloed

Meer video's verkennen