Microfluidic Platform voor het meten neutrofielchemotaxis van onverwerkte volbloed

Deze microfluïdische technologie is bedoeld om de functionaliteit van humane neutrofielen direct van één druppel bloed te meten op een platform dat gemultiplext kan worden. De centrale laadkamer dient als bron van volbloed en fungeert ook als een reservoir voor de chemo-attractant gradienten die zich vormen vanuit de 16 focale chemotactische kamers. De unieke mechanische filtratie van rode bloedcellen maakt het mogelijk om de functie van neutrofielen te onderzoeken in de natuurlijke context van bloed, cellulaire en biochemische componenten.

De bifurcatie tussen een kanaal dat naar de focale chemotactische kamer leidt en een kanaal dat het apparaat verlaat, maakt kwantificering en modulatie van de directionaliteit van migrerende neutrofielen mogelijk. Daarmee kunnen de resultaten aantonen hoe actief migrerende neutrofielen gemakkelijk langs vastgezette rode bloedcellen kunnen migreren en zich na verloop van tijd in aantal ophopen. Een uniek kenmerk van onze microfluïdische apparaten is dat ze zeer eenvoudig te vervaardigen en in te stellen zijn.

Ze bestaan uit een laag PDMS die op een micro gefabriceerde wafer wordt gegoten die we op een glazen bodem, enkele of meervoudige putplaat hechten. Het grote voordeel van deze techniek is dat er slechts een druppel volbloed nodig is. De apparaten kunnen worden gebruikt met standaard pipetten, hebben geen bewegende delen, vereisen geen slangen of externe spuitpompen.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot klinische toepassingen in vergelijking met de door ons vereiste traditionele technieken. Onze aanpak duurt enkele minuten vanaf het moment van bloedafname tot aan de neutrofielen migratie assays. De nieuwe filterkammen voor rode bloedcellen voorkomen dat RBC's de actieve migratie van neutrofielen blokkeren en onderscheidt deze methode van andere microfluïdische methoden.

Dat vereist het verwijderen van het bloed voordat de chemo-assays worden uitgevoerd. De mechanische stropeling van rode bloedcellen en kanalen onderscheidt onze technologie en maakt het mogelijk om neutrofielen te testen in onze fysiologische omgeving van volbloed, inclusief serum en bloedplaatjes. De technologie is nauwkeurig en gemakkelijk te gebruiken, en kan ons begrip van de rol van neutrofielen en het aangeboren immuunsysteem bij gezondheid en ziekte aanzienlijk verbeteren.

Fabriceer de master mal wafer om de migratiekanalen te definiëren volgens de instructies van de fabrikant. Eerst patroon. De eerste drie micron epoxy gebaseerde negatieve fotoresist laag, vervolgens patroon de tweede 50 micron laag om de cel lading en chemokine kamers te definiëren. Nu om de gegoten Polymethyl soane apparaten krachtig 20 gram PDMS met twee gram initiator gedurende vijf minuten te mengen.

Giet voorzichtig het PDMS op de gepatroneerde wafer en degasseer in een vacuümdroger gedurende één uur. Bak en cureer vervolgens de PDMS microfluïdische apparaten in een oven van 65 graden Celsius gedurende minimaal drie uur. Om ervoor te zorgen dat het PDMS op de juiste temperatuur wordt gebakken, zorg ervoor dat u de interne oventemperatuur controleert met een thermometer.

Puns de centrale laadkamers voor volbloed van 1,5 millimeter diameter uit. Puns ook donutvormige apparaten van 5,0 millimeter diameter uit. Verwijder de deeltjes van de donut apparaten met plakband.

Spoel vervolgens een multiputplaat af met gedeïoniseerd water en droog met stikstof nadat de plaat gedurende vijf minuten in een oven van 60 graden Celsius is geplaatst. Behandel met zuurstofplasma gedurende 35 seconden. Voeg vervolgens de donut apparaten en zuurstofplasma toe.

Behandel opnieuw gedurende nog eens 35 seconden. Breng de apparaten voorzichtig over in de putjes van de plaat en bak met gebonden apparaten op een hotplate van 80 graden Celsius gedurende 10 minuten. Na behandeling met zuurstofplasma is het apparaat hydrofiel en kunnen capillaire effecten het primen van de kleine kanalen in het apparaat bevorderen.

Voor de chemo-attractant oplossing, meng vijf microliter 10 micromolar FMLP met vijf microliter één milligram per milliliter fibronectine en 490 microliter HBSS. Pipet de chemo-attractant oplossing langzaam in de volbloed laadkamer pipet en extra 20 microliter van de chemo-attractant rond de buitenkant van het apparaat. Plaats de plaat in een drogen gedurende 15 minuten.

Breng een vacuüm aan op het apparaat om het apparaat te primen met chemo-attractant oplossing. Verwijder de plaat uit de droog en bevestig het bevochtigen van het apparaatkanaal door geleidelijke afname in grootte van de luchtbel. Was vervolgens de volbloed laadkamer en de buitenkant van het apparaat grondig om overtollige chemo-attractant oplossing te verwijderen.

Genereer vervolgens een gradiënt van chemo-attractant van elk van de focale chemotactische kamers naar het centrum van het apparaat. Injecteer voorzichtig 100 microliter PBS in het gat zodat een druppel PBS zich bovenop het apparaat vormt. Kantel de plaat en pipet één milliliter PBS rond het apparaat om zich op de bodem van het putje te verzamelen aspibeer het vocht en herhaal de PBS-wassing drie keer.

Vul vervolgens elke put met media om de apparaten te laten weken en laat 15 minuten voor de gradiënt om te stabiliseren. Pipet vervolgens langzaam twee microliter volbloed in elke volbloed laadkamer. Voor bloedafname met een vingerprik, was handen met zeep en water.

Laat de huid drogen als een anticoagulans vlek oplossing. Voeg één milliliter 0,2% HSA en 10 microliter 32,4 micromolar haken toe. Vlek een heparine bloedafnamebuisje, prik de gezonde donor vinger en veeg de eerste druppel bloed weg.

Verzamel 50 microliter bloed in de anticoagulans vlek oplossing en meng voorzichtig. Stel de bio kamer in op 37 graden Celsius, 80%vochtigheid en 5%CO2. Start onmiddellijk met tijdsverloop beeldvorming bij 10 x of hoger vergroting voor zinvolle statistische analyse en volg handmatig minimaal 50 neutrofielen in elk monster.

Tel de cellen die de focale chemotaxiskamers binnenkomen in de loop van de tijd. Bereken vervolgens de neutrofielen snelheden in het kanaal tussen de WBLC en FCC met behulp van image J. Tel vervolgens om de directionaliteit van de neutrofielen te kwantificeren, het aantal cellen dat de bifurcatie passeert en