Karakterisering van complexe systemen met behulp van de Design of Experiments Aanpak: Transient Eiwitexpressie in tabak als een case study

Het algemene doel van het volgende experiment is het genereren van voorspellende modellen voor transiënte expressie van eiwitten in plantenbladeren. Dit wordt bereikt door een experimenteel ontwerp op te zetten om de belangrijkste parameters voor transiënte expressie te identificeren en hun invloed op eiwitaccumulatie te kwantificeren. Als tweede stap worden genen gekloond en overgebracht naar agrobacteriën, die vervolgens in bladeren worden geïnjecteerd, wat resulteert in transiënte eiwitexpressie.

Vervolgens worden bladmonsters geanalyseerd om de eiwitexpressieniveaus te bepalen. Resultaten worden verkregen die het patroon van transiënte eiwitexpressieniveaus in bladeren van verschillende leeftijden en voor verschillende incubatieomstandigheden tonen op basis van een evaluatie van het experimentele modelontwerp. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals één factor tegelijk, is dat interacties tussen verschillende parameters zoals leeftijd van bladeren of positionele bladeren kunnen worden gedetecteerd en gekwantificeerd.

De één factor tegelijk benadering die vaak wordt gebruikt om het effect van bepaalde factoren op het resultaat van een experiment te karakteriseren, is suboptimaal omdat de individuele runs tijdens een experiment op één lijn zullen worden geplaatst, waardoor een lage dekking van de ontwerpruimte wordt bereikt. In tegenstelling tot het ontwerp van experimenten van de DOE-strategie, verbetert de variatie van meer dan één factor tegelijk de dekking en dus de precisie van de resulterende modellen. Bovendien de vooringenomen dekking van de ontwerpruimte in één factor tegelijk.

Experimenten kunnen ook falen bij het identificeren van optimale bedrijfsgebieden en suboptimale oplossingen voorspellen, terwijl DOE-strategieën waarschijnlijker de voorkeur geven aan voorwaardelijke omstandigheden. Deze stroomdiagram illustreert het proces voor het plannen van een DOE-strategie. De eerste stap is het identificeren van relevante factoren en antwoorden voor opname in het ontwerp.

In deze demonstratie worden de expressieniveaus van een model anti-HIV monoklonaal antilichaam twee G 12 en een fluorescerende marker, eiwit DS-rood gemeten op basis van eerdere experimenten. Het minimaal detecteerbare verschil dat als relevant wordt beschouwd, zal 10 microgram per milliliter zijn voor twee G 12 en 20 microgram per milliliter voor DS-rood. Bovendien zullen de geschatte waarden voor de geschatte standaarddeviatie van het systeem voor twee G 12 en DS-rood respectievelijk vier en acht microgram per milliliter zijn.

De resterende stappen voor het plannen van deze DOE-strategie zullen hier niet worden besproken, maar details zijn te vinden in het bijbehorende manuscript. Twee G 12 en DS-rood zullen transiënt worden geëxpresseerd in tabaksplanten. Om te beginnen met de procedure voor plantencultuur, bereid 10 bij 10 bij acht centimeter rotswandblokken voor door ze uitgebreid met gedeïoniseerd water te spoelen om restchemicaliën te verwijderen.

Daarna brengt u de blokken in evenwicht met een vers bereide oplossing van kunstmest voor tabakszaden door er een tot twee tabakszaden op te plaatsen, gevolgd door een korte spoeling met kunstmest. Zorg ervoor dat de zaden niet worden weggespoeld, laat de tabaksplanten ontkiemen en cultiveer ze gedurende 42 dagen in een kas onder geschikte omstandigheden. Bereid de AUM FASS voor door een cultuur te laten groeien tot een OD 600 nanometer van 5,0.

Verdun de cultuur met water en tweemaal met infiltratiemedium om de vereiste OD 600 nanometer voor injectie te matchen vóór injectie. Bevestig de OD 600 nanometer van de atum van de fasion-suspensie om de bladeren voor injectie voor te bereiden. Kras voorzichtig de epidermis op de injectieplaats met een pipettepunt om de instroom van AUM Fasion-oplossing te vergemakkelijken.

Vermijd het scheuren van de bladplaat tijdens het doen. Houd de spuit met de AUM fasion-suspensie loodrecht op de bladplaat, raak de vat tegen het te behandelen intercostale veld aan, duw voorzichtig de uitlaat op de onderkant van het blad. Tegelijkertijd drukt u voorzichtig op de bovenkant van het blad om te voorkomen dat de bladplaat verschuift of scheurt.

Duw voorzichtig de zuiger van de spuit naar beneden. De AUM fasion-oplossing zal de intercellulaire ruimten binnen de bladplaat binnendringen, zoals aangegeven door de donkerder, groenere en vochtigere behandelde gebieden. Zorg ervoor dat de spuit tijdens de injectie loodrecht op het blad blijft.

Anders kan de bacteriesuspensie onder hoge druk worden uitgestoten. Herhaal deze procedure op verschillende plaatsen totdat het hele intercostale veld is geïnfiltreerd met aum, aum, fass. Ga vervolgens door met het volgende intercostale veld na injectie, incubeer de planten onder voorwaarden bepaald door de DOE wanneer de incubatieperiode is voltooid.

Begin met bemonstering. Stabiliseer het blad met een handdoek en gebruik een kurkborrel om vier tot vijf bladschijven uit de behandelde intercostale velden te verwijderen op de posities en tijden die door de DOE zijn aangegeven. Verwijder tijdens het bemonsteren niet het hele blad van de plant.

Bepaal de massa van elk monster en plaats het in een 1,5 milliliter kunststof reactiebuisje met het monsternaam en de massa erop. Bewaar de monsters op min 20 graden Celsius of min 80 graden Celsius voor eiwitkwantificering. Het proces kan op dit punt voor enkele maanden worden onderbroken, afhankelijk van de monsterstabiliteit en de opslagtemperatuur om eiwitten uit de bladschijven te extraheren.

Voeg drie milliliter extractiebuffer per milligram monstermassa toe en maal de bladschijven in de reactiebuis met een elektrische stamper totdat er geen grote fragmenten meer over zijn. Om oververhitting van het monster te voorkomen, plaats de buis op ijs wanneer de buis na centrifugatie warm aanvoelt. Om verspreide vaste stoffen te verwijderen, brengt u het supernatant over in een schone 1,5 millimeter reactiebuis.

Meet de DS-rood fluorescentie twee keer achter elkaar. In een 96-well platereader voorzien van 530 25 nanometer excitatie- en 590 35 nanometer emissiefilters voor elk monster. Gemiddel de fluorescentie over de twee metingen en de drie technische replica's en trek de waarde af die is geregistreerd voor de blanco controle met nul microgram per milliliter DS-rood.

Trek ook