Name: Drug-geïnduceerde Overgevoeligheid van adenylylcyclase: Assay stroomlijning en miniaturisatie voor Small Molecule en siRNA screening Toepassingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Leer een celgebaseerde cAMP-sensitisatieassay voor high-throughput screening met cryopreserveerde cellen en HTRF-technologie. Deze methode versnelt de identificatie van moleculaire routes voor farmacologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag aan de heer Richard Zink en Todd Wiernicki erkennen voor methodologische training en test begeleiding. We danken ook John Paul Spence voor zorgvuldige lezing en redactionele suggesties. Dit werk werd ondersteund door de National Institute of Health MH 060.397, Brain and Behavior Research Foundation, en Eli Lilly and Company door de Lilly Research Award Program (LRAP).

1. Uitbreiding en cryopreservatie van Assay Ready Cells <ol><li> Cultuur CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L) cellen op een 15 cm 2 celkweek schotel in Ham&#39;s F12 medium aangevuld met 1,0 uM L-glutamine, 800 ug / ul G418, 300 ug / ul hygromycine, 100 U / gl penicilline, 100 ug / ul streptomycine en 10% foetaal runderserum (FBS). </li><li> Incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 totdat de cellen 90-95% confluent. Was de cellen met 10 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), en oogst de cellen door toevoeging van 3 pi cel dissociatie buffer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Resuspendeer de cellen met 12 ul van het kweekmedium en tel cellen met trypan blauw exclusie. </li><li> Centrifugeer de celsuspensie bij 500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 5 pl ijskoud medium (10% dimethylsulfoxide, 90% FBS). Verdun de celsuspensie om de gewenste celconcentratie (bijv. 1-20 x 10 6 cellen / ul) bereiken. </li><li> Aliquot 1,0 pi celoplossing elke cryovial. Incubeer de cryovials in een cel container bevriezen bij -80 ° C overnacht. Breng de cryovials een vloeibare N 2 tank voor lange termijn opslag. </li></ol> 2. Plating Assay Ready Cells (en Reverse transfectie Option) <ol><li> Snel ontdooien van een bevroren cryovial cellen in een 37 ° C waterbad. Wanneer cellen worden ontdooid, dragen de cellen om een ​​15 pl conische buis met 9 pl Opti-MEM en meng door de buis 3-5x. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 500 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 pl Opti-MEM. </li><li> Tel de cellen met behulp van trypanblauwexclusie levensvatbaarheid van de cellen te bepalen en verdun de levensvatbare cellen als nodig (bv. 3 x 10 5 cellen / ul concentratie) inOpti-MEM. Plaat 10 ul / putje van cellen in een weefselkweek behandeld 384-wells plaat met behulp van een multichannel pipet. </li><li> Maak seriële verdunningen van cAMP in Opti-MEM om een ​​standaardcurve te schatten cAMP-productie door de cellen te genereren (volgens de aanbevelingen van de fabrikant - zie hoofdstuk 7). Voeg 10 ul / putje van de cAMP standaarden aan de plaat. Opmerking: een standaard curve kan worden bereid op een afzonderlijke plaat of blanco putjes op een van de testplaten. </li><li> Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur en incubeer bij 37 ° C bij een bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 1 uur. </li></ol> 3. Reverse siRNA transfectie Option * Deze sectie is optioneel en relevant figuur 3. <ol><li> Bereid een oplossing van siRNA in RNase-vrij DDH 2 O (bijv. 0,4 pmol / pl). Voeg 5 ul aan individuele putjes van 384-well plaat, en centrifuge de plaat bij 100 xg gedurende 15 sec bij kamertemperatuur. </li><li> Verdun Lipofectamine 2000 in Opti-MEM met een factor 0.006 (bijv. commentaar 6 pl Lipofectamine 2000 tot 1000 pl Opti-MEM), en meng door en neer te pipetteren. </li><li> Incubeer de Lipofectamine 2000/Opti-MEM oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Voeg 5 ul van de verdunde Lipofectamine 2000/Opti-MEM oplossing voor individuele putjes van 384-wells plaat die al bevat siRNA. Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur. </li><li> Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Plaatassay klaar cellen zoals hierboven (hoofdstuk 2) beschreven. Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur. </li><li> Terug assayplaat naar bevochtigde incubator bij 37 ° C (5% CO 2) voor 48-96 uur zoals bepaald voor gerichte gen knock down (zie bespreking). </li></ol> 4. Small Molecule Screening <ol><li> Verdun het middel van belang (bijvoorbeeld. Klein molecuul-remmers) in Opti-MEM om de gewenste eindconcentraties 6x. Seriële verdunningen kan worden ingevuld met behulp van hand-held pipetten of een liquid handling station. </li><li> Voeg 2,5 ul / putje van de testverbinding of buffer bevattende voertuig (bijv. DMSO) aan de zijkant van de wells met een multichannel pipet. </li><li> Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur (incubatie is optioneel). </li></ol> 5. Persistent Agonist Behandeling <ol><li> Bereid een 600 nM (dwz. 6 keer de gewenste uiteindelijke concentratie van 100 nM) oplossing van quinpirole in Opti-MEM. </li><li> Voeg 2,5 ul / putje van de 600 nM quinpirole oplossing aan de zijkant van de wells met een multichannel pipet. </li><li> Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur en incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 2 uur. </li></ol> 6. Stimulatie van cAMP accumulatie <ol><li> Tijdens de 2 uur incubatie, bereiden de stimulation oplossing in Opti-MEM. De stimulatie oplossing bestaat uit 40 uM forskoline, 2 uM 3-isobutyl-1-methyxanthine (IBMX), en 4 uM spiperon (alle concentraties in stap 6 worden 4x de gewenste eindconcentratie). </li><li> Voeg 5 ul / putje van de stimulatie oplossing aan de zijkant van de wells met een multichannel pipet. </li><li> Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li></ol> 7. Afschrikken en Schatting van cAMP accumulatie <ol><li> De productie van cAMP door de cellen wordt gemeten met de cAMP dynamische 2 kit volgens instructies van de fabrikant. In het kort, reconstrueren anti-cAMP-cryptaat en cAMP-d2 in gedestilleerd water. Freeze fracties bij -20 ° C gedurende korte termijn opslag. </li><li> Verdun een aliquot van anti-cAMP-cryptaat en een aliquot van cAMP-D2 afzonderlijk in de lysis buffer volgens de instructies van de fabrikant be-oplossingen. </li><li> Eendd 10 ul / putje van anti-cAMP-cryptaat werkende oplossing en 10 gl / putje van de cAMP-d2 werkoplossing de 384-wells plaat met een multichannel pipet. </li><li> Centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Lees de plaat in een fluorescentieplaatlezer (automatische schaal instelling voor gevoeligheid) met behulp van een excitatie van 337 nm en bij 620 nm en 665 nm per maatregel de uitstoot produceert instructies. </li><li> Solliciteer ratiometrisch analyse om te beoordelen cAMP standaard curve per instructies van de fabrikant. De resulterende waarden extrapoleren de geschatte cAMP in de test wells met gegevensanalyse software. </li></ol>

<ol><li>Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+regulation+of+adenylate+cyclase+accounts+for+narcotic+dependence+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).</li>
<li>Watts, V. J., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+adenylate+cyclase+by+Galpha%28i%2Fo%29-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors.</a> Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).</li>
<li>Christie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+neuroadaptations+to+chronic+opioids%3A+tolerance%2C+withdrawal+and+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction.</a> Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).</li>
<li>Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+AGS3+during+morphine+withdrawal+promotes+cAMP+superactivation+via+adenylyl+cyclase+5+and+7+in+rat+nucleus+accumbens%2Fstriatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons.</a> Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).</li>
<li>Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m-Opioid+receptor+desensitization+by+%CE%B2-arrestin-2+determines+morphine+tolerance+but+not+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence.</a> Nature. 408, 720-723 (2000).</li>
<li>Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+long-term+plasticity+underlying+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction.</a> Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).</li>
<li>Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opiate-induced+adenylyl+cyclase+superactivation+is+isozyme-specific%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific.</a> J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).</li>
<li>Sadana, R., Dessauer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+for+G+protein-regulated+adenylyl+cyclase+isoforms%3A+insights+from+knockout+and+overexpression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies.</a> Neurosignals. 17, 5-22 (2009).</li>
<li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenylyl+cyclase+type+5+%28AC5%29+is+an+essential+mediator+of+morphine+action%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).</li>
<li>Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenylyl+cyclase+isoforms+as+novel+therapeutic+targets%3A+an+exciting+example+of+excitotoxicity+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Interv%22%5BJournal%5D)">Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection.</a> Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).</li>
<li>Beazely, M. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+properties+of+adenylate+cyclases+type+5+and+6%3A+A+progress+report%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report.</a> Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).</li>
<li>Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+10%5BTitle%5D)+AND+%22Adenylyl+cyclase+isoform-specific+signaling+of+GPCRs.+G+Protein-Coupled+Receptors%3A+Structure%2C+Signaling%2C+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chapter 10.</a> Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. Siehler, S., Milligan, G. 10, Cambridge University Chapter. 189-217 (2010).</li>
<li>Lin, Y., Smrcka, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+molecular+recognition+by+G+protein+betagamma+subunits+on+the+path+to+pharmacological+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting.</a> Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).</li>
<li>Cumbay, M. G., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+sensitization+of+recombinant+adenylate+cyclases+by+activation+of+D2+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).</li>
<li>Watts, V. J., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+endogenous+and+recombinant+adenylate+cyclase+by+activation+of+D2+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors.</a> Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).</li>
<li>Nevo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+adenylyl+cyclase+isozymes+on+acute+and+chronic+activation+of+inhibitory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors.</a> Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).</li>
<li>Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+activation+of+the+m-opioid+receptor+with+the+endogenous+ligand+endomorphin+differentially+regulates+adenylyl+cyclase+isozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes.</a> Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).</li>
<li>Beazely, M. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+a+novel+PKC+isoform+synergistically+enhances+D2L+dopamine+receptor-mediated+sensitization+of+adenylate+cyclase+type+6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Signal%22%5BJournal%5D)">Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6.</a> Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).</li>
<li>Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+tools+to+dissect+the+role+of+Gs+in+sensitization+of+AC1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1.</a> Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).</li>
<li>Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D2+receptor-induced+heterologous+sensitization+of+adenylyl+cyclase+requires+Gas%3A+Characterization+of+Gas-insensitive+mutants+of+adenylyl+cyclase+V%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V.</a> Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).</li>
<li>Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D%282%29+Receptor-Mediated+Heterologous+Sensitization+of+AC5+Requires+Signalosome+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Signal+Transduct%22%5BJournal%5D)">Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly.</a> J. Signal Transduct. 2012, 210324(2012).</li>
<li>Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+sensitization+of+adenylate+cyclase+is+protein+kinase+A-dependent+in+Cath.a+differentiated+%28CAD%29-D2L+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells.</a> J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+adenylyl+cyclase+inhibitor+for+treating+neuropathic+and+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain.</a> Sci. Transl. Med. 3, 65ra3(2011).</li>
<li>Nordstedt, C., Fredholm, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modification+of+a+protein-binding+method+for+rapid+quantification+of+cAMP+in+cell-culture+supernatants+and+body+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid.</a> Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).</li>
<li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+morphine-induced+cAMP+overshoot%3A+a+cell-based+assay+model+in+a+high-throughput+format%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).</li>
<li>Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+cells+facilitate+cell-based+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).</li>
<li>Varga, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+adenylyl+cyclase+isoenzymes+in+CHO+and+B82+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells.</a> Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).</li>
<li>Masri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+of+dopamine+D2+receptor%2Fbeta-arrestin+2+interaction+is+a+common+property+of+clinically+effective+antipsychotics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).</li>
<li>Thaker, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+glioblastoma+multiforme+through+short+interfering+RNA+screening%3A+a+paradigm+for+therapeutic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurg.+Focus%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development.</a> Neurosurg. Focus. 28, E4(2010).</li>
<li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells%3A+a+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Geneti%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Ejendal, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+antagonists+of+tick+dopamine+receptors+via+chemical+library+screening+and+comparative+pharmacological+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).</li>
<li>Meyer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22genome-to-lead%22+approach+for+insecticide+discovery%3A+pharmacological+characterization+and+screening+of+Aedes+aegypti+D%281%29-like+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors.</a> PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478(2012).</li>
<li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).</li>
<li>Fan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+genetically+encoded+biosensors+using+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase.</a> ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).</li>
<li>Jiang, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+cAMP+BRET+sensor+to+characterize+a+novel+regulation+of+cAMP+by+the+sphingosine+1-phosphate%2FG13+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway.</a> J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In een poging om studies van heterologe sensibilisatie te vergemakkelijken, hebben we behoorlijk gemodificeerd onze vorige methode het bereiken van een gestroomlijnd &quot;mix en lees&quot; formaat dat amendeerbaar naar high-throughput screening en werkingsmechanisme onderzoek. De belangrijkste wijzigingen in ons protocol kan als volgt worden samengevat: 1) het gebruik van cryogeconserveerde cellen als &quot;test klaar&quot; reagentia, 2) de miniaturisatie van de assay in 384 putjes, en 3) het gebruik van de meting van ...

Een adaptief adenylylcyclase (AC) signalering reactie bekend als heterologe-of super-overgevoeligheid werd voor het eerst ontdekt in het laboratorium van Nobelprijswinnaar dr. Marshall Nirenberg. Dr Nirenberg voorgesteld dat de waargenomen toename AC respons na chronische δ opioïde receptor activering was een mechanisme betrokken bij opiaten tolerantie en afhankelijkheid 1. Naast chronische δ opioïde receptor activatie dit neuroadaptive reactie van AC signaal komt voor na aanhoudende activatie van verscheidene andere Gai / o-gekoppelde receptoren 2. Met name veel van deze receptoren worden geassocieerd met pijn, neuropsychiatrische en neurologische aandoeningen, en omvatten μ / κ opioïde, D 2/4 dopamine, 5HT 1A en M 2/4 muscarinereceptoren 2. Naast Dr Nirenberg bevindingen, een grote hoeveelheid bewijs bestaat koppelen sensibilisering van AC signalering naar chronische opioïde receptor activering zowel <em&gt; in vitro en in vivo 3-7. Sensibilisatie van AC is ook geassocieerd met een verscheidenheid van ziekten waarbij D 2-achtige dopamine receptoren waaronder schizofrenie en de ziekte van Parkinson (voor overzicht zie referentie 2). Ondanks het potentiële belang van sensibilisatie, de precieze mechanisme (s) van persistente Gai / o-gekoppelde receptoractivering die leidt tot verhoogde AC respons grotendeels onbekend. Deze studies vormen de reden voor het onderzoek van de mechanismen voor de sensibilisering van adenylylcyclase als een belangrijke neurobiologische doelwit. Ook moet de fysiologische relevantie van AC signalering 8 en het belang dat de individuele AC isovormen houden in deze adaptieve respons ook worden erkend 2,9,10. In het kader van het onderzoek, de algemene kenmerken geassocieerd met heterologe sensibilisering van de recombinante isovormen van AC parallel die kenmerken described voor het bestuderen van endogene isovormen van AC. Specifiek, heeft eerder onderzoek gevonden dat de activering van Gai / o eiwitten en daaropvolgende afgifte / omlegging βγ subeenheden belangrijkste voorwaarden voor receptor geïnduceerde sensibilisatie van AC-isovormen. Bovendien zijn een aantal studies suggereren dat het signaleren van proteïne kinasen en Gβγ subeenheden zijn betrokken bij overgevoeligheid 2,11-13. Individuele AC ook weer unieke en aparte sensibilisatie patronen 12. Zo is aanhoudende blootstelling D 2 receptoren agonisten geassocieerd met overgevoeligheid van AC1 en AC8 Ca 2 + / calmoduline stimulatie 14,15, terwijl de nauw verwante AC3 niet gesensibiliseerd 2. AC2, AC4, en AC7 zijn nauw verwant, echter alleen PKC-gestimuleerde AC2 groei robuust lichtgevoelig na langdurige blootstelling van D2 receptoren agonisten 7,14,16,17. Daarnaast AC5 en AC6 tonen een aanzienlijke mate van heterologous sensibilisatie voor Gas-en-forskoline gestimuleerde cAMP accumulatie na activatie van D 2 receptoren 14,18-20, maar lijken te verschillen in hun behoefte aan Gβγ subunit-AC interacties 21. Hoewel de meeste studies van AC sensibilisatie model cellijnen (bijv. HEK293 cellen die individuele AC-isovormen) gebruikt, blijkt dat deze bevindingen vertalen naar natieve neuronale celmodellen 4,22. Meer recent, kunnen de effecten van AC isovorm selectieve remmers van kleine moleculen die in HEK293 cellen die AC-isovormen worden vertaald in vivo gedragsonderzoek 23. Het ontbreken van een geïdentificeerde moleculaire mechanisme voor heterologe sensibilisatie waarschijnlijk weerspiegelt de complexiteit van de adaptieve respons en de unieke regulerende eigenschappen van de individuele AC-isovormen 12. Het ontrafelen van een dergelijke complexiteit wordt verder gecompliceerd door het gebruik van de methode omslachtig thoed heeft beperkte academische onderzoekers van dienst onpartijdige benaderingen. Bijvoorbeeld, onze vorige mechanistische studies betrof het gebruik van continu gekweekte cellulaire modellen met 24 - en 48-well weefselkweek formaat 15. Gekweekte cellen werden meestal gekweekt gedurende 48 uur en vervolgens onderworpen aan agonist behandeling (2-18 uur), gevolgd door een reeks van cel wassingen en incubaties (figuur 1). AC-isovorm specifieke cAMP protocols werden vervolgens toegepast gevolgd door meting van cAMP via een omslachtige en tijdrovende [3H] cAMP bindende methodologie 15,24. De duur van begin tot eind voor elke assay algemeen vereist een totaal van vier tot vijf dagen van cel plateren gegevensanalyse (figuur 1). De toepassing van nieuwe technologieën en automatisering heeft geleid tot duidelijke verbeteringen voor sensibilisatie studies in de industriële en HTS centrum setting. Bijvoorbeeld, een groep die werkt met het National Center for Chemical Genomics meldde een tweedaagse HTS testprocedure voor het identificeren van kleine molecule inhibitoren van μ opioïd receptor geïnduceerde sensibilisatie in 1536-well formaat 25. Het huidige artikel beschrijft onze inspanningen om een ​​HTS-test voor studies van heterologe sensibilisatie met behulp van technologieën die beschikbaar zijn op de meeste academische onderzoeksinstellingen ontwikkelen. Deze strategie werd bereikt door de integratie van het gebruik van cryogeconserveerde cellen uit cel modellen heteroloog tot de uiting van de D2 dopamine receptor in combinatie met endogene of individuele recombinante adenylylcyclase isovormen (CHO-D 2L of HEK-AC6 / D 2 L). Om onze doorvoer te verbeteren, hebben we onze vernieuwde 48 en sensibilisatie assay (ca.&gt; 20 treden meer dan 4-5 dagen) een vijf-stap, dag assay in 384-well formaat, dat was in wezen &quot;mixen en te lezen&quot;. De nieuwe indeling maakt gebruik van een commercieel verkrijgbare homogene tijdopgeloste fluorescentie (HTRF) test om cAMP acc metenumulation in intacte cellen met een multi mode plaat lezer. De test is robuust en vatbaar voor kleine molecuul screening, en kunnen effectief worden toegepast voor het screenen op remmers van heterologe sensibilisatie. Daarnaast bieden wij de gegevens die het gebruik van deze test met reverse transfectie van siRNA voor gerichte of genome wide siRNA bibliotheek screening met slechts een geringe wijziging in de algemene aanpak maakt.

<table><tbody><tr><td>CHO-K1-DRD2L cellen</td><td>DiscoveRx</td><td>930579C2</td><td></td></tr><tr><td>Ham&rsquo;s F12 media</td><td>VWR</td><td>SH30026fs</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>VWR</td><td>SH3007003</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Sigma</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Fisher</td><td>50-230-5556</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>15 cm schalen</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Cell dissociatie buffer</td><td>Life Technologies</td><td>13150016</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat Buffered Saline</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Fisher</td><td>976171</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TC behandelde 384-well platen</td><td>Perkin-Elmer</td><td>6007688</td><td></td></tr><tr><td>HTRF cAMP Dynamic 2 kit</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62AM4PEB</td><td>http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay</td></tr><tr><td>Synergy 4</td><td>Biotek</td><td>H4MLFPTAD</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)Quinpirole</td><td>Sigma</td><td>Q111</td><td></td></tr><tr><td>Spiperon</td><td>Sigma</td><td>S7395</td><td></td></tr><tr><td>Clozapine</td><td>Sigma</td><td>C6305</td><td></td></tr><tr><td>Haloperidol</td><td>Sigma</td><td>H1512</td><td></td></tr><tr><td>S-(-)Sulpiride</td><td>Sigma</td><td>S112</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 transfectie reagens</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blauw</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Water, DNase- en RNase-vrij</td><td>MP Biomedicals</td><td>821739</td><td></td></tr><tr><td>Gas siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>custom siRNA</td><td></td></tr><tr><td>Nontargeting siRNA controle</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-20</td><td></td></tr><tr><td>siGlo Red</td><td>Dharmacon</td><td>D-001630-02</td><td></td></tr></tbody></table>

drug-geïnduceerde overgevoeligheid van adenylylcyclase: assay stroomlijning en miniaturisatie voor small molecule en sirna screening toepassingen

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensibilisatie van adenylylcyclase (AC) signalering is betrokken bij diverse neuropsychiatrische en neurologische aandoeningen waaronder verslaving en ziekte van Parkinson. Acute activering van Gai / O-gekoppelde receptoren remt AC activiteit, terwijl aanhoudende activering van deze receptoren leidt tot heterologe sensibilisatie van AC en verhoogde niveaus van intracellulair cAMP. Eerdere studies hebben aangetoond dat deze verbetering van AC respons na chronische activatie van verschillende soorten Gai / o-gekoppelde receptoren zoals dopamine D2 en μ opioïde receptoren waargenomen zowel in vitro als in vivo. Hoewel heterologe sensibilisatie van AC eerst werd gemeld vier decennia geleden, het mechanisme (s) dat dit verschijnsel ten grondslag liggen blijven grotendeels onbekend. Het ontbreken van mechanistische gegevens vermoedelijk weerspiegelt de complexiteit die betrokken zijn bij deze adaptieve respons, wat suggereert dat nonbiased aanpak zou kunnen helpen bij het identificerening de moleculaire pathways die betrokken zijn bij heterologe sensibilisering van AC. Eerdere studies hebben kinase en Gbγ signalering geïmpliceerd als overlappende componenten die het heterologe sensibilisatie van AC regelen. Om unieke en extra overlappende doelstellingen in verband met sensibilisatie van AC identificeren, is de ontwikkeling en validatie van een schaalbare cAMP sensibilisatie kwantitatieve analyse vereist voor een grotere verwerkingscapaciteit. Vorige benaderingen van sensibilisatie studeren zijn over het algemeen omslachtig waarbij continue celkweek onderhoud, alsmede een complexe methode voor het meten van cAMP dat meerdere wasstappen inhoudt. Aldus zou de ontwikkeling van een krachtige cel-gebaseerde test die kan worden gebruikt voor high throughput screening (HTS) in 384 putjes toekomstige studies te vergemakkelijken. Met twee D2 dopamine receptor cellulaire modellen (dwz. CHO-D 2L en HEK-AC6 / D 2L), hebben we 48-well assay gevoeligheid (&gt; 20 stappen 4-5 dagen) omgezet in een vijf-step, enkele dag assay in 384-well formaat. Dit nieuwe format vatbaar is klein molecuul screening, en we tonen aan dat deze assay ontwerp ook gemakkelijk kan worden gebruikt voor omgekeerde transfectie van siRNA in afwachting gerichte siRNA bibliotheekscreening.

Deel I. Het ontwikkelen van een 384 goed heterologe overgevoeligheid test voor het identificeren van kleine molecule inhibitoren met een algemeen verkrijgbare cel model. Om heterologe sensibilisatie studeren in een cel model, hebben we een aantal verbeteringen die ons in staat om de test te stroomlijnen in een &quot;mix en lees&quot; formaat. Enkele belangrijke aanpassingen zijn hieronder aangegeven en worden in meer detail in de discussie. De eerste belangrijke stap wijzigd...

Aanhoudende activering van remmende G-eiwit gekoppelde receptoren leidt tot een sensibilisering van adenylylcyclase signalering. Om de essentiële moleculaire pathways identificeren nonbiased stappen noodzakelijk zijn, maar deze strategie vereist de ontwikkeling van een schaalbare celgebaseerde cAMP overgevoeligheid assay. Hierin beschrijven we een overgevoeligheid test voor kleine moleculen en siRNA screening.

Drug-geïnduceerde Overgevoeligheid van adenylylcyclase: Assay stroomlijning en miniaturisatie voor Small Molecule en siRNA screening Toepassingen

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van een celgebaseerde assay voor cAMP-sensibilisering op één dag voor high-throughput screening-applicaties, waaronder het screenen van chemische bibliotheken. Dit wordt bereikt door eerst vooraf bereide, assay-klare cryogebewarede cellen te ontdooien en uit te platen. De tweede stap bestaat uit het toevoegen van testverbindingen of antagonisten aan de cellen, gevolgd door de toevoeging van het adenylaatcyclase-sensibiliserende geneesmiddel.Vervolgens wordt een adenylylcyclase-activator toegevoegd in aanwezigheid van een fosfodiësterase-remmer om de accumulatie van cyclisch AMP te stimuleren. De laatste stap is het stopzetten van de reactie met reagentia voor homogenere tijdopgeloste fluorescentie of HTRF cyclisch AMP-detectie in lysisbuffer, waarna de fluorescentie wordt gemeten. Uiteindelijk maakt het gebruik van cryopreserveerde cellen en HTRF cyclisch AMP-technologie de uitvoering van een sensitiviteitsassay in één dag mogelijk voor screening van kleine moleculen.We kregen voor het eerst het idee voor deze benadering toen we geïnteresseerd raakten in het gebruik van high-throughput screening om de receptor-gemedieerde heterologe sensitisatie van een dentale cyclase te bestuderen. Twee belangrijke technieken die hier worden gebruikt, zijn het gebruik van cryopreserveerde cellen als 'off-the-shelf' reagentia en homogene tijd-opgeloste fluorescentie-assaykits voor het meten van cyclisch AMP. De basismethodieken die hier worden toegepast, kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen in cel-signalering en geneesmiddelenontwikkeling met behulp van celgebaseerde assays. Begin met het kweken van CHO D2 L-cellen op een 15 cm celkweekschaal zoals beschreven in het tekstprotocol; incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 totdat de cellen 90 tot 95% confluent zijn. Was de cellen vervolgens met 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS, oogst de cellen in 3 mL celdissociatiebuffer na een incubatie van vijf minuten bij 37 °C.Na het resuspenderen van de cellen met 12 milliliters kweekmedium, telt u de cellen met behulp van trypaanblauw-uitsluiting en centrifugeert u de cel-suspensie bij 500 Gs gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Aspireer vervolgens het supernatant en resuspendeer het celpellet in vijf milliliters vriesmedium. Nadat de cel-suspensie is verdund om de gewenste celconcentratie te bereiken, verdeelt u telkens één milliliter celoplossing over de cryovials. Incubeer de cryovials gedurende één nacht in een celvriescontainer bij -80 °C.Verplaats de cryovials de volgende dag naar een tank met vloeibare stikstof voor langdurige bewaring. Om assay-klare cellen uit te platen, wordt een bevroren cryovial met cellen eerst snel ontdooid in een waterbad van 37 °C. Zodra de cellen zijn ontdooid, worden ze overgebracht naar een conische buis van 15 ml met negen ml optimum en gemengd door de buis drie tot vijf keer om te keren, gevolgd door centrifugatie van de cellen bij 500 Gs gedurende vijf minuten. Aspireer bij kamertemperatuur het supernatant en resuspendeer de cellen in één ml optimum.Tel de cellen met behulp van trypaanblauw-uitsluiting om de celviabiliteit te bepalen voordat de levensvatbare cellen naar behoefte worden verdund. Plaats vervolgens 10 µL cellen per putje in een weefselkweek-behandelde 384-wells plaat met behulp van een multichannelpipet.Maak seriële verdunningen van cyclisch AMP en optimum om een standaardcurve te genereren voor het schatten van de productie van cyclisch AMP door de cellen. Voeg 10 µL per putje van de cyclisch AMP-standaarden toe aan de plaat. Centrifugeer de plaat bij 100 ×g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur en incubeer gedurende één uur bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.Verdun voor een screening van kleine moleculen het betreffende geneesmiddel in optimum tot zes keer de gewenste eindconcentraties. Seriële verdunning kan worden uitgevoerd met handpipetten of een vloeistofverwerkingsstation. Voeg per put 2,5 µL van de teststof, verbinding of buffer met vehicle toe.Breng de oplossing aan aan de zijkant van de wells met een meerkanaals pipet en centrifugeer de plaat bij 100 g gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur. Bereid voor behandeling met een persistente agonist een 600 nanomolaire oplossing van Quinpirole voor en voeg vervolgens 2,5 µL van de 600 nanomolaire Quinpirole-oplossing toe aan de zijkant van de wells. Centrifugeer de plaat opnieuw met een meerkanaals pipet voordat deze gedurende twee uur wordt geïncubeerd bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.Bereid tijdens de incubatie van twee uur de stimulatie-oplossing in optimum voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg na het centrifugeren van de plaat, zoals eerder beschreven, vijf µL stimulatie-oplossing per put toe aan de zijkant van de putten met behulp van een multichannelpipet en laat dit gedurende één uur incuberen bij kamertemperatuur. De productie van cyclic AMP door de cellen wordt gemeten met de cyclic AMP dynamic two kit volgens de instructies van de fabrikant; kort samengevat: reconstitueer anti-cyclic AMPK crypt en cyclic AMPD two in gedestilleerd water en verdun één aliquot anti-cyclic AMPK crypt en één aliquot cyclic AMPD two afzonderlijk in de lysisbuffer, conform de instructies van de fabrikant om werkopleidingen te maken. Om de accumulatie van cyclic AMP in de 384-putsplaat te stoppen, voegt u 10 µL anti-cyclic AMP crypt eight werkopleiding per put en 10 µL cyclic AMPD two werkopleiding per put toe.Centrifugeer de plaat opnieuw met een meerkanaalpipet bij 100 GS gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur voordat u de plaat één uur bij kamertemperatuur incubeert; lees de platen af in een fluorescentieplaatlezer met een excitatie van 337 nanometer en meet de emissies bij 620 nanometer en 665 nanometer volgens de instructies van de fabrikant. Pas ratiometrische analyse toe om de standaardcurve van cyclisch AMP te beoordelen volgens de instructies van de fabrikant. Extrapoleer met de resulterende waarden de geschatte accumulatie van cyclisch AMP in de testputjes met behulp van data-analysesoftware.Cryogeperserveerde CHO D two L-cellen werden direct geplaatst in assayplaten met 384 putjes om aan te tonen dat sensitisatie-assays kunnen worden uitgevoerd in een 384-puts formaat, waardoor het aantal stappen werd teruggebracht van meer dan 20 naar vijf. De studies onthulden dat een voorbehandeling van twee uur met Quin Perol de daaropvolgende gestimuleerde cyclic A MP-accumulatie versterkte op een dosisafhankelijke manier die consistent was met heterologe sensitisatie. De tweede reeks experimenten onderzocht of deze nieuwe gestroomlijnde assay kon worden gebruikt om inhibitoren van sensitisatie te beoordelen.De eerste resultaten onthulden dat voorbehandeling met haloperidol of piperidon, prototypische D2-antagonisten, de door quinpirol geïnduceerde sensitisatie van fosforstimulated cyclisch AMP-accumulatie volledig voorkwam. Deze methode werd vervolgens gebruikt om de potentie van een reeks D2-antagonisten te beoordelen om te testen of deze verbindingen sensitisatie remmen, vergelijkbaar met de eerdere resultaten. Deze studies toonden aan dat de D2-antagonisten de agonist-geïnduceerde sensitisatie op een dosisafhankelijke wijze remden.Het volgende doel was het ontwikkelen van een sensitiviteitsassay in 384 putjes die gebruikt kan worden voor schaalbare reverse transfectie-screening van siRNA-bibliotheken, zoals beschreven in het tekstprotocol; de resultaten toonden aan dat blootstelling van cellen aan de agonist Quinparole gedurende twee uur leidde tot een aanzienlijke verhoging van forskoline en de accumulatie van cyclisch AMP stimuleerde. De verhoogde accumulatie van cyclisch AMP bij zowel 100 nanomolar als 300 nanomolar forskoline was meer dan 15 voudig in vergelijking met met vehicle behandelde cellen. Reverse transfectie van GSS siRNA in D2-receptor-expresserende cellen blokkeert de agonist-geïnduceerde sensitivisering van adenylaatcyclase.Wanneer de D2-receptoragonist Quinperol werd toegevoegd, werd de accumulatie van cyclisch AMP gestimuleerd en gemeten met behulp van HTRF. Een 15-voudige sensibiliseringsrespons werd met 94% verminderd. Zodra deze methode onder de knie is, kan deze volledige assay in minder dan acht uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd volgens deze procedure. Andere signaalmoleculen, zoals IP1 en fosfo-ERK, kunnen eveneens worden gemeten om aanvullende receptor-signaalroutes te onderzoeken.

drug-induced-sensitization-adenylyl-cyclase-assay-streamlining

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In this video, we demonstrate the amplified luminescent proximity homogeneous assay—a bead-based proximity assay. It utilizes homogeneously-sized acceptor and donor beads, immobilized with two proteins that tend to interact to screen potential small molecules inhibiting protein interactions.

Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay: A Bead-Based Proximity Assay to Screen Small Molecules Inhibiting Protein-Protein Interactions

Het bereiken van een systeemniveau begrip van cellulaire processen is een doel van de hedendaagse celbiologie. We beschrijven hier strategieën voor multiplexing luciferase reporters van verschillende cellulaire functie eindpunten naar gen-functie met behulp van genoom-schaal RNAi bibliotheken ondervragen.

Een Multiplexed Luciferase-gebaseerde screening Platform voor ondervragen Kanker-geassocieerde signaaltransductie in gekweekte cellen

We presenteren een methode voor een snelle, omkeerbare immobilisatie van kleine moleculen en gefunctionaliseerde nanodeeltjes assemblages voor Surface Plasmon Resonance (SPR) studies, met behulp van sequentiële on-chip bioorthogonal cycloadditiereactie chemie en antilichaam-antigen capture.

Microfluïdische On-chip Capture-cycloadditiereactie omkeerbaar Immobiliseer Small Molecules of Multi-component Structuren voor biosensortoepassingen

Hier beschrijven we een fenotypische test die van toepassing is op de high-throughput/high-content schermen van small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemische verbinding en Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. Deze methode is gebaseerd op de detectie van fluorescerend gelabelde Mycobacterium tuberculosis in fluorescerend gelabelde gastheercel met behulp van geautomatiseerde confocale microscopie.

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

Er wordt een protocol geboden om structure-switching aptameren voor kleine molecuuldoelen te selecteren op basis van een instelbare strengheid magneetparel selectiemethode. Aptameren geselecteerd met structure-switching eigenschappen zijn gunstig voor assays die een conformationele verandering vereisen om de aanwezigheid van een doel aan te geven, zoals de beschreven gouden nanodeeltjes assay.

Een methode voor het selecteren-Structure schakelen Aptameren Toegepast op een Colorimetric gouden nanodeeltjes Assay

De adsorptie van peptiden op plastic tijdens traditionele seriële verdunningen met pipetpunten kan de bepaling van de potentie aanzienlijk beïnvloeden en het begrip van structuur-activiteitsrelaties verwarren die worden gebruikt voor fasen van loodidentificatie en loodoptimalisatie in de ontdekking van geneesmiddelen. Hier worden methoden beschreven voor geautomatiseerde akoestische non-contact seriële verdunning van peptidemonsters.

Geautomatiseerde Acoustic Afgifte voor de seriële verdunning van Peptide agonisten in potentie Bepaling Testen

We presenteren in de huidige studie een nieuwe fluorescentie gebaseerde assay middels lymfocyten afkomstig van een transgene muis. Deze test is geschikt voor high-throughput screening (HTS) van kleine moleculen begiftigd met de hoedanigheid van het remmen of bevorderen van lymfocyt activering.

Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

Deze paper gebruikt een stroom cytometry-gebaseerde assay naar scherm bibliotheken van chemische inhibitoren voor de identificatie van remmers en de bijbehorende doelen die van invloed zijn T-cel receptor signalering. De hier beschreven methoden kunnen ook worden uitgebreid voor high-throughput screening.

Identificatie van bemiddelaars/Mediators van T-cel Receptor signalering via de Screening van chemische remmer bibliotheken

A Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase-assay is aangepast aan de semihoge doorvoer screening van kleine molecuul myosine-remmers. Deze kinetische test wordt uitgevoerd in een 384-well microplaat Format met een totaal reactievolume van slechts 20 μL per put. Het platform moet van toepassing zijn op vrijwel elk ADP-producerende enzym.

Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers

Dit protocol biedt een methode voor de systematische wereldwijde optimalisatie van genetisch gecodeerde biosensoren door middel van geautomatiseerde generatie en beoordeling van genetische bibliotheken. Dit gaat gepaard met ontwerp-van-experimentmethodologieën om experimenten te stroomlijnen en de selectie van genetische componenten mogelijk te maken om biosensoren af te stemmen op specifieke ontwerpresultaten.

Efficiënte bemonstering van genetisch gecodeerde biosensorontwerpruimte mogelijk gemaakt met een ontwerp- en automatiseringsworkflow

Dit protocol introduceert een fluorometrische screeningsmethodologie die geoptimaliseerd is voor het identificeren van natuurlijke product- of kleinmolecuulremmers van eiwitsynthese. De praktische bruikbaarheid maakt het geschikt voor zowel bacheloronderwijs in geneesmiddelenontdekkingstechnieken als voor implementatie in medicinale chemiecampagnes.

Een op fluorescentie gebaseerd protocol voor voorlopige screening van eiwitsyntheseremmers uit natuurlijke bronnen

Leer een celgebaseerde cAMP-sensitisatieassay voor high-throughput screening met cryopreserveerde cellen en HTRF-technologie. Deze methode versnelt de identificatie van moleculaire routes voor farmacologisch onderzoek.

Drug-geïnduceerde Overgevoeligheid van adenylylcyclase: Assay stroomlijning en miniaturisatie voor Small Molecule en siRNA screening Toepassingen (Video) | JoVE Journal

Drug-geïnduceerde Overgevoeligheid van adenylylcyclase: Assay stroomlijning en miniaturisatie voor Small Molecule en siRNA screening Toepassingen

Meer video's verkennen