Een verbeterde methode voor nauwkeurige en snelle meting van Vliegprestaties in Drosophila
13 februari 2014
Hier beschrijven we een methode voor een snelle en nauwkeurige meting van vliegprestaties in Drosophila, waardoor high-throughput screening.
Het algemene doel van deze procedure is om de vliegprestaties bij Drosophila snel en nauwkeurig te meten. Dit wordt bereikt door vliegen eerst in een vliegcilinder te laten vallen. De tweede stap van de procedure is om het landingsoppervlak af te beelden met een digitale camera.
De laatste stap is om de gegevens te analyseren met behulp van beeldverwerkingssoftware door de landingshoogte van elke vlieg te meten. Uiteindelijk helpt deze procedure mutaties en omstandigheden zoals veroudering of neurodegeneratie te identificeren, die de vliegcapaciteit beïnvloeden en helpt om de vliegprestaties te kwantificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de originele vliegtester, is dat het geschikter is voor hoogdoorvoerscreens voor mutanten en andere omstandigheden die de vlucht beïnvloeden.
We kregen het idee voor deze methode toen we ons realiseerden hoeveel tijd het kostte om een groot aantal genotypen te testen met de originele vliegtester. Bevestig de vliegcilinder aan een ringstatief met behulp van kettingklemmen. Laat ongeveer drie centimeter onder het cilinder voor de wegschaal.
Laad de wegschaal met een dunne laag minerale olie en schuif deze onder de vliegcilinder. Bevestig de trechter aan een tweede ringstatief. Pas de hoogte van de trechter aan zodat de bodem van de trechter gelijk is aan de bovenkant van de vliegcilinder.
Het smalste deel van de trechter moet smaller zijn dan een vliegbuisje. De diameter van de valbuis moet iets breder zijn dan een vliegbuisje, zodat het buisje vrij kan vallen. Plaats de valbuis in de bovenkant van de trechter en bevestig deze met behulp van een klauwklemp.
Snij vervolgens van een polyacrylamideplaat een rechthoekig stuk met de lengte van de vliegcilinder en een breedte iets kleiner dan de binnenomtrek van de vliegcilinder. Breng een dunne laag tangle trap-kleefstof aan op de plaat, waarbij er voldoende ruimte boven en onder onbedekt blijft om de plaat vast te houden. Nadat de kleefstof op de plaat een uur is gedroogd, schuif de plaat met de kleefstof naar binnen in de vliegcilinder.
Monteer vervolgens de camerabaan met behulp van dennensteunbeugels. Zorg ervoor dat de onderkant van de baan de camera kan ondersteunen zonder het objectief te blokkeren. Schroef vervolgens de stoppen op plaatsen waar ze het zicht van de camera op de kunststofplaat niet onderbreken.
Verzamel buisjes met vliegen die getest moeten worden met maximaal 20 vliegen per buisje. Tik zachtjes op de vliegen naar de bodem van het buisje. Haal het buisje los en plaats het in de valbuis.
Laat het buisje los. Wanneer het buisje de wanden van de versmallende trechter raakt, worden de vliegen uitgeworpen in de vliegcilinder. Til de valbuis op om het lege buisje te verwijderen en laad eventueel meer vliegen in.
Tot 200 vliegen die van 10 buisjes zijn geladen, kunnen gemakkelijk worden getest en gefotografeerd op een enkele polyacrylamideplaat. Verwijder nu de kunststofplaat en plaats deze op een vlakke witte ondergrond. Een wit posterbord kan worden gebruikt als de werkbladen donker gekleurd zijn. Monteer de camerabaan boven de kunststofplaat.
De camera moet voldoende hoog boven de plaat staan om zowel de boven- als onderkant van de plaat in het gezichtsveld te hebben. Schuif de camera langs de baan terwijl u de opnameknop ingedrukt houdt om een panoramische afbeelding te maken. Het aantal vliegen dat in de olie in de schaal onder de vliekkamer landt, kan handmatig worden geteld.
Voor elke proef tussen proeven kunnen vliegen van de plaat worden verwijderd en kan de plaat opnieuw worden gebruikt. Open de afbeeldingsbestanden in Image J-software, crop de afbeeldingen indien nodig om alleen het landingsoppervlak te omvatten. Het gebied bedekt met een verwikkelingsval.
Converteer de afbeeldingen naar acht bits grijswaarden en maak een drempel. Om de witte achtergrond te filteren. Stel de parameters in om elke vlieg te identificeren.
Gebruik het menu analyse deeltjes om de parameters te definiëren. Gebruikt om een deeltje te identificeren met behulp van het demonstratietoestel. Een gebied van vijf tot 90 pixels vierkant en een cirkelvormigheid van 0,4 tot 1,0 identificeert nauwkeurig alle monsters.
Meet nu de locatie van elke vlieg met behulp van de gegenereerde lijst met coördinaten voor elk deeltje. De X-coördinaat in pixels kan worden omgezet in centimeters. Om de landingshoogte te berekenen, importeert u de tabel in een spreadsheet en gaat u verder met de analyse.
De gemiddelde landingshoogte voor cantons bij 73 centimeter was significant groter dan die van slow poke-mutanten bij 44 centimeter. Volgens deze procedure kunnen aanvullende methoden zoals histologie worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden over de structurele integriteit van vliegspieren, motorneuronen of neuromusculaire knooppunten. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u snel de vliegprestaties bij oph kunt beoordelen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor de snelle en nauwkeurige meting van de vliegprestaties bij Drosophila, wat high-throughput screening faciliteert. De procedure omvat het laten vallen van vliegen in een vliegcilinder, het vastleggen van beelden van het landingsoppervlak en het analyseren van de gegevens om de landingshoogte te meten.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsanalyse
- Genetica
Achtergrond
- Vliegprestaties zijn een kritieke maatstaf bij het bestuderen van Drosophila.
- Bestaande methoden voor het meten van het vliegvermogen hebben vaak een lage doorvoersnelheid.
- Het identificeren van mutaties die het vliegen beïnvloeden, kan inzicht verschaffen in neurodegeneratie.
- Deze methode verbetert de mogelijkheid om te screenen op diverse aandoeningen die het vliegen beïnvloeden.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een high-throughput methode voor het beoordelen van de vliegprestaties bij Drosophila.
- Het identificeren van genetische mutaties en condities die het vliegvermogen belemmeren.
- Het nauwkeurig kwantificeren van de vliegprestaties.
Gebruikte methoden
- Drosophila worden in een vliegcilinder gelaten.
- Een digitale camera legt beelden van het landingsvlak vast.
- Beeldverwerkingssoftware analyseert de gegevens om de landingshoogte te meten.
- De methode maakt een snelle screening van meerdere monsters mogelijk.
Belangrijkste resultaten
- De methode biedt nauwkeurige metingen van de vliegprestaties.
- Deze is geschikt voor high-throughput screening van mutanten.
- Condities zoals veroudering en neurodegeneratie kunnen worden beoordeeld.
- De resultaten kunnen helpen bij het begrijpen van de genetische basis van vliegstoornissen.
Conclusies
- Deze techniek vormt een verbetering van bestaande methoden voor het meten van vliegprestaties.
- Het stelt onderzoekers in staat om effectief analyses met een hoge doorvoer uit te voeren.
- De bevindingen kunnen bijdragen aan het begrip van genetische invloeden op het gedrag.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Kwantitatieve meting van de vliegprestaties van Drosophila maakt high-throughput genetische en fenotypische screening mogelijk, wat bijdraagt aan targetvalidatie in een vroeg stadium en het verminderen van mechanistische risico's in het onderzoek naar neurobiologie en veroudering. De verbeterde workflow standaardiseert gedragstests, waardoor het voorspellend vertrouwen voor downstream functionele studies en portfoliotriage toeneemt. Deze capaciteit versnelt de identificatie van genetische modifiers en ziekterelevante fenotypen in preklinische modelsystemen.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt snelle analyse mogelijk van genetische en omgevingsfactoren die de neuromusculaire functie beïnvloeden.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door het kwantificeren van gedragsfenotypes die gekoppeld zijn aan genetische perturbaties.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door onderscheid te maken tussen normale en verminderde vliegprestaties.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen bij het prioriteren van genetische targets in pipelines voor neurodegeneratie en veroudering.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde Drosophila-modellen voor op schaalbare, reproduceerbare workflows voor gedragsscreening.
- Standaardiseert assay-condities door de instroomsnelheid te controleren en gegevensvastlegging te automatiseren.
- Maakt kwantitatieve high-throughput read-outs mogelijk die geschikt zijn voor grootschalige genetische screens of screenings van verbindingen.
- Ondersteunt de betrouwbare evaluatie van kandidaatgenen of interventies die de motorische functie beïnvloeden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt fenotypische resultaten uit met ziekterelateerde eindpunten in onderzoek naar neurodegeneratie en veroudering.
- Zorgt voor continuïteit van genetische ontdekking tot preklinische validatie van functionele uitkomsten.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van robuuste, kwantitatieve gedragsgegevens.
- Ondersteunt de ontwikkeling van translationele biomarkers door genotype te koppelen aan het functionele fenotype.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege genetische screening tot validatie in preklinische modellen, en biedt een gestandaardiseerde gedragstest voor functioneel genomisch en neurobiologisch onderzoek.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en de verduidelijking van pathways door de vliegbeperking over verschillende genotypen en condities te kwantificeren.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor high-throughput screening van mutanten of interventies.
- Analytiek: Biedt digitale beeldvorming en softwarematige meting van de landingshoogte voor een objectieve gegevensvergelijking.
- Translationeel onderzoek: Koppelt gedragsfenotypen van Drosophila aan functionele uitkomsten die relevant zijn voor ziekten.
- Bedrijfsmatig hergebruik: Biedt een schaalbaar, herbruikbaar platform voor diverse genetische en fenotypische screeningscampagnes.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en doorvoersnelheid voor gedragsassays.
- Strategische waarde: Maakt beter geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënt portfoliobeheer mogelijk.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van genetische targets en interventies.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van Drosophila en het opzetten van gedragsassays.
- Digitale beeldvormingsapparatuur en software voor beeldanalyse zijn nodig voor kwantitatieve resultaten.
- Standaardisatie van assayparameters en data-analyseworkflows tussen teams is vereist.
- Aanpasbaar aan verschillende genetische achtergronden en experimentele condities in Drosophila.
- Beperkt tot modelsystemen waarbij vliegprestaties een relevant functioneel eindpunt vormen.
