Testen

Het algemene doel van deze procedure is het bieden van een eenvoudige Y-maze-test om het reukvermogen bij Drosophila melanogaster te testen. Dit wordt bereikt door de vliegen eerst 16 tot 18 uur te laten vasten, zodat zij gemotiveerd zijn om nieuwe omgevingen met vluchtige stimuli te verkennen. De tweede stap van de procedure is het opstellen van de Y-maze-opstelling met geurbronnen op filterpapier, zoals azijnzuur in oplosmiddel versus alleen het oplosmiddel.

De derde stap is om de vliegen snel en voorzichtig in het beladingsbuisje te brengen. Na enkele uren is de laatste stap het scoren van de locatie van de vliegen in het doolhof. Uiteindelijk kunnen de resultaten een respons op het odorant aantonen op basis van de gegevens verkregen met het Y-doolhof.

We kwamen eerst op het idee voor deze methode toen we besloten dat we een eenvoudige en goedkope methode wilden om de olfactorische respons van vliegen te testen. Een voordeel van deze techniek ten opzichte van andere opties is dat het de vliegen in staat stelt een beslissing te nemen zonder dat er te veel stress optreedt. De procedure zal worden gedemonstreerd door Megan Simon, een promovendus uit mijn laboratorium. Zorg voor dit protocol dat er een isogene vliegenlijn klaarligt met stabiele, robuuste gedragsfenotypes. Elke dergelijke stam kan dienen als referentiecontrole voor de olfactorische test; kruis voor elke genetische stam die voor het experiment wordt gebruikt de stam gedurende vijf generaties terug met de referentiestam.

Koppel individuele vrouwtjes van de experimentele stam aan enkele isogene mannetjes voor elke terugkruising. Houd de drosophila voor olfactorische experimenten op standaard maïsmelmedium met een antibioticum onder een 1212 lichtcyclus en bij 25 °C.

De experimenten moeten altijd worden uitgevoerd bij 25 °C en onder licht in het ver-rode spectrum, dat niet zichtbaar is voor Drosophila. Het moet tevens mogelijk zijn om de ruimte tussen de experimenten volledig te ventileren voordat de assay de volgende ochtend wordt uitgevoerd. Aan het einde van de dag worden cohorten van 10 tot 20 experimentele lijnen overgebracht naar glazen vials waarin vochtigheid wordt geboden door middel van een natte handdoek.

De vliegen moeten binnen 16 tot 18 uur worden getest, anders kunnen ze de volgende dag sterven door uitdroging of uithongering. Zet het Y-doolhof in elkaar. Begin met het verbinden van de Y-vormige connector met twee glazen vials met behulp van schuimconnectoren met afgeknippte pipetpunten; deze vormen de kanalen, waarbij hun taps toelopende vorm zorgt voor eenrichtingspassages.

De derde tak van de Y is verbonden met een laadbuis, gemaakt van het brede gedeelte van een pipetpunt, die doorgang biedt van het laadviaal naar het keuzepunt van het doolhof. Achter elke taps toelopende tunnel bevindt zich een glazen viaal, waarvan er één moet worden voorzien van een geurstof. Deze bestaan uit bolussen van 40 µL geabsorbeerd in vierkante stukjes weefselpapier van 28 mm.

Welke van de twee de geurstof bevat, moet willekeurig worden afgewisseld om de test eerst uit te voeren. Koel de vliegen kortstondig op ijs, zodat de vliegen worden vertraagd. Dit moet gebeuren onder verrood licht van LED-lampen en bij 25 °C; laat de groep vliegen voorzichtig in het laadviaal vallen en vul de Y-doolhof met de testvliegen.

Gebruik geen gasanesthesie. Het is essentieel om de vliegen zowel snel als voorzichtig over te brengen naar het load-vial. Dit is in feite de moeilijkste stap van dit experiment, omdat de vliegen zich snel moeten herstellen voordat de andere vliegen in de Y-massa diffunderen.

De vliegen moeten 24 uur de tijd krijgen om het doolhof te verkennen, zodat een maximaal aantal vliegen naar de ene of de andere glazen vial beweegt. Het aantal vliegen dat in de verschillende buisjes aanwezig is, dient om de olfactorische index te berekenen. Standaard statistische methoden moeten worden toegepast op deze waarde, die is verzameld op basis van het gedrag van maximaal 10 vliegen.

Als 10 vliegencohorten geen consistente resultaten opleveren, kunnen de proeven worden uitgevoerd met 20 vliegencohorten. Om de componenten van het doolhof te reinigen, laat u deze gedemonteerd een nacht weken in RBS 35 MD. Spoel ze daarna af met kraanwater en volg dit met een laatste spoeling met DI-water voordat ze aan de lucht worden gedroogd.

Standaardreacties op een geurstof. Bij gebruik van het Y-doolhof omvatten deze attractie, indifferentie of vermijding. Zo vermijden Drosophila-vliegen 10% azijnzuur sterk, terwijl ze 10% fenylazijnzuur niet vermijden.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat deze wave-assay een kunstmatige omgeving voor de vliegen representeert. Deze procedure kan worden gevolgd als een methode, waarna aanvullende arena- of interne assays kunnen worden uitgevoerd om de olfactorische responsen van vliegen onder verschillende condities te bevestigen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u eenvoudig de olfactorische responsen van filano gaste kunt testen met behulp van de SW-assay.