Name: Hele Mount immunolabeling van olfactorische receptor neuronen in de Drosophila Antenne (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Leer whole mount immunolabeling van olfactorische receptor neuronen in Drosophila antennes. Deze techniek maakt visualisatie van neuronale structuren mogelijk met confocale microscopie voor onderzoek naar zintuiglijke biologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studie werd ondersteund door MEXT gesteund programma voor de Strategic Research Foundation bij Private universiteiten en JSPS Young Scientist B subsidie ​​voor HT Wij willen Ohtake Norihito bedanken om de videoclips te bewerken.

1. Bereid appel plaat <ol><li> Meng 12,5 g agar, 125 ml 100% in de handel verkrijgbaar appelsap, 12,5 g glucose, en 375 ml H 2 O. Magnetron het mengsel gedurende 1 tot 2 minuten en giet de 3 cm celkweekschaal. Bewaren bij 4 ° C. </li></ol> 2. Genetische kruis <ol><li> Gebruik de volgende representatieve genetische kruis: </li></ol> Or49a-mCD8 :: GFP / cyo x w 1118 3. Dissection en kleuringsprotocol <ol><li> Verdoven van de vlieg en snijd de vlieg hoofd verticaal door vast te houden met behulp van een pincet. </li><li> Plaats de antennes bevattende gedeelte voorzichtig op een appel plaat. </li><li> Snijd het derde segment van de antenne met behulp van fijne dissectie schaar. </li><li> Breng 90 pl van het fixatie-oplossing (4% paraformaldehyde in 0,1% PBST (PBS met 0,1% Triton X-100)) naar het midden van een glazen bodem kweekschaal. </li><li> Voorzichtig overdracht van de ontleed antennae met een scherpe naald rechtstreeks naar de fixatie-oplossing. Indien nodig, fysiek onderdompelen de antennes in de oplossing met behulp van naald. </li><li> Incubeer gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur (RT). Was de antennes in 0,4% PBST (PBS met 0,4% Triton X-100), 3x 10 minuten elk, waardoor ze in dezelfde schaal. Gebruik geel tips om te verwijderen en PBST oplossing toe te voegen. Gebruik 90 ul van de wasoplossing elke keer. OPMERKING: Plaats de schotel in een shaker tijdens immunohistochemie. Voor het verwijderen of toevoegen van de oplossing in de schaal, brengt de antennes in het midden van de schaal met de naald en voorzichtig toevoegen of verwijderen oplossing van de rand van de schaal. </li><li> Blokkeer de antennes met 90 ul van 5% normaal paardenserum in 0,1% PBST gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Na verwijdering van de blokkerende oplossing, incubeer de antennes met 90μl van primaire antilichamen in 0,1% PBST dat 5% paardenserum gedurende 48 uur bij 4 ° C in een vochtige houder zoals eerder beschreven <sinschrijven&gt; 8. </li><li> Was de antennes 6x 10 minuten in 0,4% PBST. </li><li> Incubeer de antennes met 90 gl secundaire antilichamen in 0,1% PBST dat 5% paardenserum gedurende 48 uur bij 4 ° C. Was 6x 10 minuten met behulp van 0,4% PBST. </li><li> De antennes monteren, verwijderen PBST uit de kweekschaal zoveel mogelijk en geleidelijk twee verschillende concentraties glycerol aan de antennes. Voeg eerst 40% glycerol om de schotel 1 tot 2 minuten; deze verwijder en voeg 80% glycerol. </li><li> Extract voorzichtig de antennes (inclusief 80% glycerol) van de cultuur schotel met behulp van gele punt en leg ze op een dia. Plaats voorzichtig een dekglaasje op de bovenkant en sluit de dekglaasje randen met nagellak. De antennes zijn nu klaar om te worden afgebeeld door fluorescentie microscopie. </li></ol>

<ol><li>Christensen, T. A., White, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChristensen%2C+TA+%22Representation+of+olfactory+information+in+the+brain+In+The+Neurobiology+of+Taste+and+Smell%22">Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell</a>. , New York. 201-232 (2000).</li>
<li>Ache, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+common+strategy+for+transducing+olfactory+information%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards a common strategy for transducing olfactory information.</a> Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1994).</li>
<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction.</a> C. elegans. Cell. 13, 515-527 (1993).</li>
<li>Barth, A. L., Justice, N. J., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asynchronous+onset+of+odorant+receptor+expression+in+the+developing+zebrafish+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Asynchronous onset of odorant receptor expression in the developing zebrafish olfactory system.</a> Neuron. 16, 23-34 (1996).</li>
<li>Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+olfactory+system+makes+sense+of+scents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">How the olfactory system makes sense of scents.</a> Nature. 413, 211-218 (2001).</li>
<li>Stockinger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuitry+that+governs+Drosophila+male+courtship+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior.</a> Cell. 121, 795-807 (2005).</li>
<li>Endo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+of+Notch+targets+in+olfactory+receptor+neuron+diversification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification of Notch targets in olfactory receptor neuron diversification.</a> Nat Neurosci. 15, 224-233 (2011).</li>
<li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+analysis+of+Drosophila+larval+peripheral+sensory+neuron+dendrites+and+axons+using+genetic+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Suh, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+population+of+olfactory+sensory+neurons+mediates+an+innate+avoidance+behaviour+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila.</a> Nature. 431, 854-859 (2004).</li>
<li>Sachse, S., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+inhibition+for+temporal+and+spatial+odor+representation+in+olfactory+output+neurons%3A+A+calcium+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Role of inhibition for temporal and spatial odor representation in olfactory output neurons: A calcium imaging study.</a> J Neurophysiol. 87, 1106-1117 (2002).</li>
<li>Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna.</a> Cell. 117, 965-979 (2004).</li>
<li>Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+sensory+map+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An olfactory sensory map in the fly brain.</a> Cell. 102, 147-159 (2000).</li>
<li>Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular%2C+anatomical+and+functional+organization+of+the+Drosophila+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular, anatomical and functional organization of the Drosophila olfactory system.</a> Curr Biol. 15, 1535-1547 (2005).</li>
<li>Clyne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+response+of+individual+sensilla+on+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Invert+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna.</a> Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).</li>
<li>Vosshall, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+map+of+olfactory+receptor+expression+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna.</a> Cell. 96, 725-736 (1999).</li>
<li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112, 271-282 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De ontleding van de Drosophila antenne beschrijven we is eenvoudig en in een laboratorium omgeving. Om een ​​succesvolle dissectie te garanderen, is het essentieel om fijne kanten schaar gebruiken. Terwijl de immunokleuring ontleed antenne, is het belangrijk te incuberen in een vocht gevulde container verdamping van de antilichaamoplossing voorkomen. De ontleed antenne heeft de neiging te zweven in de oplossing. Met 0,1% Triton in PBS gedurende de fixatie verhinderde stappen zullen verzinken van de antenne verg...

Het olfactorische systeem wordt onderscheid gemaakt tussen een enorme verscheidenheid van geurmoleculen en vervolgens de verkregen informatie naar de hogere hersencentra. Deze ingang wordt gebruikt om fundamentele dierlijke gedrag, zoals voeding en paring 1-6 nauwkeurig te regelen. Zoals elk olfactorische soort neuron is gekoppeld aan een specifieke set van geuren, de diversificatie van de olfactorische receptor neuronen (ORN) s is essentieel voor een goede olfactorische systeem functioneren 7. Drosophila genetica stelt ons in staat om enkele cel niveau onderzoek bij moleculaire mechanismen geassocieerd met ORN ontwikkeling en fysiologische functie 8-16 uit te voeren. Ganse berg immunostaining van Drosophila antennes heeft ons in staat om te begrijpen in meer detail de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de diversificatie van olfactorische receptor neuronen (ORN) s 7. Hierin bieden wij een uitgebreide beschrijving van een eenvoudige methode om achieve dit.

<table><tbody><tr><td>Stemi DV4 dissectiemicroscoop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Kweekschotel met glazen bodem&nbsp;</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-ELAV</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>7E8A10</td><td>Verdunning 1:200</td></tr><tr><td>Muis anti-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>Verdunning 1:400</td></tr><tr><td>Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-225-152</td><td>Verdunning 1:200</td></tr><tr><td>Donkey Anti-Rat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>712-165-150</td><td>Verdunning 1:200</td></tr></tbody></table>

hele mount immunolabeling van olfactorische receptor neuronen in de<em&gt; drosophila</em&gt; antenne

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant moleculen binden aan hun doel receptoren in een precieze en gecoördineerde manier. Elke receptor herkent een specifiek signaal en stuurt deze informatie naar de hersenen. Als zodanig bepaalt hoe olfactorische informatie wordt naar de hersenen, modificeren zowel perceptie en gedrag verdient onderzoek. Interessant ook wordt steeds duidelijker dat cellulaire transductie en transcriptiefactoren betrokken bij de diversificatie van reukreceptor neuron. Hier bieden wij een robuust geheel monteren immunologische etikettering methode om in vivo reukreceptor neuron organisatie assay. Met deze methode identificeerden we allemaal reukreceptor neuronen met anti-Elav antilichaam, een bekende pan-neurale marker en Or49a-mCD8 :: GFP een reukreceptor neuron specifiek uitgedrukt in NBA neuron met anti-GFP antilichaam.

Ervoor zorgen dat zowel de dissectie en fixatie snel worden uitgevoerd is een belangrijke factor in het bereiken van succes met dit protocol. Met behulp van fijne schaar en pincet is ook van cruciaal belang. Na immunokleuring werden fluorescent gelabeld antennes onderzocht onder een confocale microscoop. We normaal gesproken 1 uM secties met behulp van een 20x lens. We gelabeld NBA 7 ORNs behulp Or49a-mCD8 :: GFP en telde het aantal NBA ORNs in wild-type antenne. De mCD8-GFP reporter wordt celmembraan gelokal...

Hier beschrijven we het proces van gehele immunologische kleuring van Drosophila-antennes, waardoor we de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de diversificatie van olfactorische receptorneuronen (ORN's) beter kunnen begrijpen.

Hele Mount immunolabeling van olfactorische receptor neuronen in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de olfactorische receptorneuronen te visualiseren met behulp van whole-mount kleuring van de antennes. Anestheseer eerst de vlieg om de kop verticaal door te snijden. Plaats vervolgens de gedisseceerde vliegenkop op een apple plate.Snijd vervolgens het derde segment van de antenne af en plaats dit in een glazen kweekschaal met bodem om immunohistochemie uit te voeren. Na het monteren van de antennes op een objectglas kunnen we de diverse typen reukreceptorneuronen visualiseren via confocale microscopie. We werken aan het reukstelsel.Het reukstelsel wordt gebruikt om onderscheid te maken tussen een enorme verscheidenheid aan verschillende moleculen. De brede reeks verschillende reukneuronen die binnen dit systeem aanwezig zijn, maakt een precieze en gecoördineerde overdracht van informatie van doelreceptoren naar neuronen in de hersenen mogelijk. Vandaag beschrijven we de kleuring van de gehele antenne (whole mount) om de diversificatie van deze reukreceptorneuronen aan te tonen.Om een succesvolle whole mount en antennakleuring te garanderen, is het cruciaal om direct voor aanvang van het protocol een verse batch fixeerder te berei

whole-mount-immunolabeling-olfactory-receptor-neurons-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven een gevestigde techniek om te meten en geur-opgeroepen calcium antwoorden te analyseren in de antennaal kwab van het...

Calcium Imaging van Geur-reacties van de consument in de Drosophila Antennaal Lobe

Om te begrijpen hoe complex cel vormen, zoals neuronale dendrieten, worden bereikt tijdens de ontwikkeling, is het belangrijk om nauwkeurig te kunnen assay microtubuli organisatie. Hier beschrijven we een robuuste immunohistologische etikettering methode om microtubule organisatie van de dendritische arborization neuron zintuiglijke dendrieten, de luchtpijp, spier-onderzoeken en...

Immunohistologische Etikettering van microtubuli in Sensory Neuron Dendrieten, luchtpijp, en de spieren in de Drosophila Larve Body Muur

This video demonstrates a detailed immunostaining protocol to visualize phenotypic defects in the mushroom bodies of mutant Drosophila brains. The protocol involves using antibodies against Fas2, a protein involved in axonal guidance that facilitates the proper morphological and functional development of the mushroom body.

Visualizing Mushroom Body Neurons in Drosophila Brains via Immunostaining

We een techniek voor etikettering enkele neuronen in het centrale zenuwstelsel (CNS)...

Labeling van afzonderlijke cellen in het centrale zenuwstelsel van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Cilia van olfactorische sensorische neuronen bevatten eiwitten van de signaaltransductiecascade, maar een gedetailleerde ruimtelijke analyse van hun verdeling is moeilijk in cryosecties. We beschrijven hier een geoptimaliseerde aanpak voor hele montage-etikettering en en face visualisatie van ciliaire eiwitten.

Hele Mount Labeling van Cilia in het Main Olfactorische Systeem van Muizen

Het algemene doel van dit protocol is om aan te tonen hoe geurstoffen met lage volatiliteit voor single-sensillum-opname van Drosophila- olfactorische receptorneuronen kunnen optreden die reageren op lang-keten-cutulaire feromonen.

Elektrofysiologische opname van<em&gt; Drosophila</em&gt; Trichoid Sensilla in reactie op geurstoffen met lage volatiliteit

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Cellen weergeven van verschillende morphologies en stellen een verscheidenheid van interacties met hun buren. Dit protocol wordt beschreven hoe te onthullen van de morfologie van afzonderlijke cellen en cel-cel interactie onderzoeken met behulp van de gevestigde Gal4/UAS expressie systeem.

Toepassing van MultiColor FlpOut techniek om hoge resolutie eencellige Morphologies en cel interacties van Glia in Drosophila te studeren

Hier presenteren we een protocol om te stagen en ontleden olfactorische weefsel van Drosophila diersoorten te ontwikkelen. Het ontleed weefsel kan later worden gebruikt voor moleculaire analyses, zoals kwantitatieve RT-PCR (Reverse transcriptie-Polymerase Chain Reaction) of RNA sequencing (RNAseq), evenals in vivo analyses uitgevoerd, zoals immunohistochemistry of in situ hybridisatie.

Voorbereiding van de ontwikkeling van de perifere olfactorische weefsel voor moleculaire en analyse van Immunohistochemical in Drosophila

Dit protocol beschrijft de dissectieprocedure, kweekconditie en live beeldvorming van een antenne-hersenexplantatiesysteem voor de studie van de olfactorische circuitassemblage.

Een explantatiesysteem voor time-lapse beeldvormingsstudies van olfactorische circuitassemblage in Drosophila

Dit artikel beschrijft een efficiënt protocol voor beeldende schijfdissectie en antistofkleuring dat zuinig is met reagentia en het hanteren van imaginale schijven in kleine aantallen vergemakkelijkt.

Kleinschalige dissectie en antilichaamkleuring van oog-antenne en vleugelbeeldschijven van Drosophila melanogaster

Leer whole mount immunolabeling van olfactorische receptor neuronen in Drosophila antennes. Deze techniek maakt visualisatie van neuronale structuren mogelijk met confocale microscopie voor onderzoek naar zintuiglijke biologie.

Hele Mount immunolabeling van olfactorische receptor neuronen in de

Meer video's verkennen