Het beoordelen Fagocytische Ontruiming van celdood in Experimental Stroke door ligeerbare fluorescerende probes
27 mei 2014
We presenteren een nieuw fluorescentie techniek voor het selectief in situ labeling van actieve fagocyterende cellen, die duidelijk uit cel lijken in een beroerte. De aanpak is van belang voor de beoordeling hersenen reactie op ischemie omdat slechts een klein deel van fagocyten aanwezig in ischemische hersenen deelnemen klaring van celdood.
Het algemene doel van deze procedure is om selectief actieve fagocytische cellen te labelen, die celresten na een beroerte opruimen. Dit wordt bereikt door eerst de componenten voor de Tite-gebaseerde signaalversterkingsreactie voor te bereiden. De tweede stap is het voorbereiden van de coupes.
Vervolgens wordt de labelingsreactie uitgevoerd met behulp van het enzym vaccinia-topoisomerase en labiele fluorescerende probes. De laatste stap is fluorescentiesignaalversterking op basis van IDE. Ten slotte wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om de fagocytische klaring van dode cellen in weefselsneden van focale hersenischemie te beoordelen.
De klaring van dode cellen door fagocyten speelt een belangrijke rol bij het herstel van de hersenen na ischemie. De gepresenteerde methode bepaalt de efficiëntie van dit proces door uitsluitend die fagocyten te labelen die actief dode cellen verwijderen. Hoewel deze methode inzicht biedt in de ischemische hersenen, kan zij ook worden gebruikt om ischemische schade in andere organen en weefsels te bestuderen.
Wanneer de zure FA-klaring van dode cellen belangrijk is. Hoewel de IDE-signaalversterking of TSA-stap in de laatste fase van de labeling plaatsvindt, kan de voorbereiding voor deze reactie meer dan een uur duren. Het is daarom handiger om de TSA-reagentia eerst te bereiden.
De eerste stap is het maken van de fluoro four TYROM-stamoplossing door 300 µL DMSO toe te voegen aan de tyrom-reagensbestanden die in de TSA-labelingskit zijn inbegrepen. Bereid vervolgens de TNT-wasbuffer om het blokkeringsreagens volledig op te lossen. Voeg bij het maken van de TNB-blokkeringsbuffer het reagens langzaam in kleine hoeveelheden toe onder roering en verhit de oplossing geleidelijk tot 55 °C.
Bij continu roeren zal de oplossing melkachtig worden; deze moet tot kamertemperatuur worden gebracht voordat er aliquots worden afgenomen en voor langdurig gebruik bij -20 °C worden bewaard. Voor deze procedure worden de preparaten vooraf klaargemaakt door coupes van 5 µm dikte te monteren, gesneden uit formaline-gefixeerd weefsel. Behandel de coupes eerst 15 minuten met xyleen, rehydrateer de coupes vervolgens via een reeks ethanolwasstappen, gevolgd door twee wasbeurten met water.
Maak vervolgens de werkopleossing van proteinase K door een voorraadoplossing te verdunnen tot 50 µg/ml in PBS. Het meest uitdagende deel van dit experiment is het bepalen van de ideale duur van de digestie met proteinase K; afhankelijk van de grootte en het type weefsel kunnen controles met zowel kortere als langere digestietijden nodig zijn om succes te garanderen. Voeg het juiste volume proteinase K-werkopleossing toe aan de coupes en incubeer gedurende 15 minuten bij 23 °C.
Was na de incubatie de coupes twee keer gedurende vijf minuten in gedestilleerd water. Terwijl de coupes weken, bereidt u het labelingsmengsel met de actieve probe. Om de actieve probeolutie te bereiden, combineert u de oligonucleotiden met water, één molaire Tris-HCl en de in de kit meegeleverde vaccinia-topoisomerase; meng dit voorzichtig door te pipetteren en laat het 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen om de activering van de probe mogelijk te maken.
Haal na de tweede wasperiode de coupes uit de pot en zuig het resterende water af. Wanneer u klaar bent, brengt u de eerder bereide actieve probesoalutie aan als dekking. Laat de coupes glijden en incubeer ze gedurende 15 minuten bij 23 °C.
Dip de objectglaasjes na de incubatie in water om de dekglasjes voorzichtig te verwijderen. Was de objectglaasjes drie keer gedurende vijf minuten in water. Bedek na de laatste wasbeurt de weefselcoupes met TNB-blokkeringsbuffer en incubeer de objectglaasjes gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een bevochtigingskamer.
Bereid tijdens deze tijd een verdunning van 1:100 van gestripte en mierikswortelperoxidase-conjugaten (S-A-H-R-P) in TNB-blokkeringsbuffer. Haal de coupes uit de buffer en zuig de TNB-blokkeringsbuffer weg. Gebruik bij het aanbrengen van de S-A-H-R-P-oplossing voldoende reagens om de gehele weefselcoupe te bedekken.
Nadat de slides zijn afgedekt, worden deze 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Was de slides na de incubatie drie keer gedurende vijf minuten per keer. Bereid vlak voor gebruik in TNT-wasbuffer een 1:50 verdunning van de fluoro four TY IDE-stock voor in 1x amplificatieverdunner. Pipetteer de oplossing op de slides zodat de weefselsectie volledig wordt bedekt.
Aangezien de oplossing niet kan worden hergebruikt, dient het ongebruikte resterende deel te worden weggegooid. Incubeer de slides gedurende drie tot 10 minuten bij kamertemperatuur. Controleer de fluorescentie.
Verhoog de vergroting onder de microscoop totdat de eerste aanwijzingen van structuren zichtbaar zijn. Ga direct over naar de wasstap. Was de objectglaasjes drie keer gedurende vijf minuten per keer.
In TNT-wasbuffer bij kamertemperatuur onder agitatie. Voeg na het wassen de anti-fade oplossing met DPI toe en plaats het dekglas. Observeer de resultaten onder een fluorescentiemicroscoop.
Deze afbeeldingen tonen twee voorbeelden van PHA-acidische klaring. De kernkleuring dappy is weergegeven in blauwe fluorescentie en de labile vac topo-probe is weergegeven in groene fluorescentie. Diagrammen van de gebeurtenissen in deze afbeeldingen tonen kernen van fagocyten en ingesloten extra kernen in verschillende stadia van digestie. Zodra men er vaardig in is, kan deze techniek in ongeveer drie uur worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd.
Na het bekijken van deze video weet u hoe u stabiele fluorescente probes kunt gebruiken in weefselcoupes. U zult ook in staat zijn om selectief actieve ideeën te labelen door dode cellen in het ischemische brein te verwijderen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe fluorescentietechniek voor het selectief labelen van actieve fagocytische cellen die betrokken zijn bij het opruimen van celresten bij een beroerte. De methode is cruciaal voor het begrijpen van de reactie van de hersenen op ischemie, aangezien slechts een klein fractie van de fagocyten deelneemt aan dit opruimingsproces.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- Fagocytische klaring van dode cellen is essentieel voor het herstel van de hersenen na ischemie.
- Slechts een subset van de fagocyten neemt actief deel aan dit proces.
- Inzicht in dit mechanisme kan bijdragen aan therapeutische strategieën.
- De gepresenteerde methode kan ook worden toegepast op andere organen en weefsels.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een techniek voor het selectief labelen van actieve fagocyten.
- Het beoordelen van de efficiëntie van fagocytische klaring in ischemisch hersenweefsel.
- Het verschaffen van inzicht in de dynamiek van de klaring van celsterfte.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van de componenten voor de op Tite gebaseerde signaalversterkingsreactie.
- Labelingsreactie met gebruik van vaccinia, topoisomerase en fluorescerende probes.
- Fluorescentiemicroscopie voor de visualisatie van gelabelde cellen.
- Optimalisatie van de digestietijden met proteinase K voor weefselcoupes.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle markering van actieve fagocyten in ischemisch hersenweefsel.
- Visualisatie van fagocytische activiteit via fluorescentiemicroscopie.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode op andere weefsels.
- Inzicht in de timing en efficiëntie van fagocytische klaring.
Conclusies
- De ontwikkelde techniek verbetert het begrip van fagocytische processen bij ischemie.
- Het biedt een waardevol instrument voor het bestuderen van mechanismen voor celklaring.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar diverse orgaansystemen die door ischemie worden beïnvloed.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Selectieve kwantificering van actieve fagocytische klaring bij experimentele beroertes maakt mechanistische risicoreductie van neuroinflammatoire pathways mogelijk en informeert de targetvalidatie voor herstelstrategieën van het CZS. Deze methode met een koppelbare fluorescente probe biedt voorspellende zekerheid bij het beoordelen van de efficiëntie van afvalverwerkende fagocyten, wat de translationele continuïteit van discovery naar preklinisch onderzoek ondersteunt. Het vermogen om actieve van inactieve fagocyten te onderscheiden, verbetert de besluitvorming binnen portfolio's voor neuroprotectieve en regeneratieve therapeutische programma's.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar fagocytische klaringmechanismen in ziekterelateerd hersenweefsel mogelijk.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door actieve fagocyten te onderscheiden van omstanders.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie van neuro-inflammatoire en regeneratieve pathways.
- Levert kwantitatieve gegevens voor voorspellend vertrouwen in CNS-programma's in een vroeg stadium.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde weefselcoupes voor voor downstream kwantitatieve imaging-workflows.
- Standaardiseert de detectie van actieve fagocytische processen voor reproduceerbare assay-resultaten.
- Maakt schaalbare screening mogelijk van modulatoren die de efficiëntie van fagocytische klaring beïnvloeden.
- Ondersteunt een betrouwbare evaluatie van compound-effecten op de klaring van celdood in situ.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stemt overeen met ziekterelevante modellen van ischemische schade voor de translationele ontwikkeling van biomarkers.
- Zorgt voor continuïteit van mechanistische ontdekking naar preklinische validatie van strategieën voor herstel van het centraal zenuwstelsel.
- Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen voor de verdere ontwikkeling van neuroprotectieve en regeneratieve kandidaten.
- Biedt voorspellende risicoreductie voor biologische complicaties in een laat stadium die verband houden met het falen van celklaring.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door kwantitatieve beoordeling van fagocytische klaring in hersenischemie-modellen mogelijk te maken, wat zowel de validatie van targets als de afstemming van translationele biomarkers ondersteunt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing over fagocyt-gemedieerde klaring en pathway-verduidelijking in ischemisch weefsel.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve read-outs van actieve fagocytische gebeurtenissen voor assay-ontwikkeling.
- Analytics: Biedt fluorescentie-gebaseerde metingen om de klaringsefficiëntie tussen verschillende experimentele condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen mechanistische bevindingen en preklinische modellen die relevant zijn voor CNS-letsel en herstel.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van fagocytische klaring in diverse weefsel- en ziektecontexten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van CNS-targets.
- Operationele waarde: Standardiseert de kwantificering van fagocytische klaring voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door biologische risico's in een vroeg stadium te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van neuro-inflammatoire en regeneratieve programma's mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie en de preparatie van weefselcoupes.
- Toegang tot gespecialiseerde reagentia is noodzakelijk, waaronder ligeerbare fluorescente probes en enzymkits.
- Vereist standaardisatie van labelings- en beeldvormingsprotocollen tussen teams voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar aan diverse weefseltypen, maar optimalisatie van de digestiestappen en labeling kan noodzakelijk zijn.
- Afhankelijk van nauwkeurige controle over enzymatische reacties en beeldvormingsparameters voor kwantitatieve resultaten.
