Het beoordelen Fagocytische Ontruiming van celdood in Experimental Stroke door ligeerbare fluorescerende probes
27 mei 2014
We presenteren een nieuw fluorescentie techniek voor het selectief in situ labeling van actieve fagocyterende cellen, die duidelijk uit cel lijken in een beroerte. De aanpak is van belang voor de beoordeling hersenen reactie op ischemie omdat slechts een klein deel van fagocyten aanwezig in ischemische hersenen deelnemen klaring van celdood.
Het algemene doel van deze procedure is om selectief actieve fagocytische cellen te labelen, die cellichamen verwijderen na een beroerte. Dit wordt bereikt door eerst de componenten voor de Tite-gebaseerde signaalversterkingsreactie voor te bereiden. De tweede stap is het voorbereiden van de secties.
Vervolgens wordt de labelreactie uitgevoerd met behulp van het enzym vaccinia, topoisomerase en geschikte fluorescente sondes. De laatste stap is IDE-gebaseerde fluorescente signaalversterking. Uiteindelijk wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om fagocytische klaring van dode cellen in weefselsecties van focale hersenischemie te beoordelen.
De klaring van dode cellen door fagocyten speelt een belangrijke rol in de herstel van de hersenen na ischemie. De gepresenteerde methode bepaalt de efficiëntie van dit proces door alleen die pego-groottes te labelen die actief dode cellen verwijderen. Hoewel deze methode inzicht geeft in de ischemische hersenen, kan deze ook worden gebruikt om ischemische schade in andere organen en weefsels te bestuderen.
Waar FA-acidische klaring van dode cellen belangrijk is. Hoewel de IDE-signaalversterking of TSA-stap plaatsvindt in de laatste fase van het labelen, kan het voorbereiden voor deze reactie meer dan een uur duren. Het is daarom handiger om eerst de TSA-reagentia te maken.
De eerste stap is om de fluoro vier TYROM-stockoplossing te maken met 300 microliter DMSO naar de tyrom-reagensbestanden die in de TSA-labelingkit zijn opgenomen. Bereid vervolgens de TNT-wasbuffer om het blokkeerreagens volledig op te lossen. Bij het maken van de TNB-blokkeerbuffer, voeg deze langzaam toe in kleine incrementen terwijl je roert en verwarm de oplossing geleidelijk tot 55 graden Celsius.
Met continu roeren zal de oplossing melkachtig lijken en moet deze voor gebruik worden gebracht tot kamertemperatuur. Verdeel in aliquoten en bewaar op min 20 graden Celsius voor langdurig gebruik. Voor deze procedure worden dia's van tevoren voorbereid door vijf micrometer dikke secties te monteren. Snijd uit formaldehyde-gefixeerd weefsel. Behandel eerst de secties gedurende 15 minuten met xyleen, rehydrateer de secties door een reeks ethanolwasbeurten, gevolgd door twee wasbeurten in water.
Maak vervolgens de proteinase K-werkoplossing door een stockoplossing te verdunnen tot 50 microgram per milliliter in PBS. Het moeilijkste deel van dit experiment is het bepalen van de ideale tijdsduur voor de proteinase K-digestie. Controles met zowel kortere als langere digestietijden kunnen nodig zijn om succes te garanderen, afhankelijk van de grootte en het type weefsel. Voeg het juiste volume protein ACE K-werkoplossing toe aan de secties en incubeer gedurende 15 minuten bij 23 graden Celsius.
Na de incubatie, was de secties tweemaal gedurende vijf minuten in gedestilleerd water. Terwijl de secties weken, bereid de labelmix met de actieve sonde voor. Om de actieve sonde-oplossing te bereiden, combineer de oligonucleotiden met water een molaire triss, HCL en de vaccinia topoisomerase geleverd in de kit, meng voorzichtig door te pipetten en incubeer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur om de sonde te activeren.
Na de tweede wasperiode, haal de secties uit de pot en aspireer het resterende water weg. Wanneer u klaar bent, breng de eerder bereide actieve sonde-oplossing aan, dek af. Schuif de secties en incubeer ze gedurende 15 minuten bij 23 graden Celsius.
Na de incubatie, dompel de dia's in water om de dekglasjes voorzichtig te verwijderen. Was de dia's drie keer gedurende vijf minuten in water. Na de laatste was, bedek de weefselsecties met TNB-blokkeerbuffer en incubeer de dia's gedurende 30 minuten op kamertemperatuur in een bevochtigde kamer.
Gedurende deze tijd, bereid een 1 op 100 verdunning van gestreepte en mierikswortel peroxidase-conjugaten voor. S-A-H-R-P in TNB-blokkeerbuffer, haal de dia's eruit en aspireer de TNB-blokkeerbuffer weg. Gebruik genoeg reagens om het hele weefselsegment te bedekken voordat u de S-A-H-R-P-oplossing aanbrengt.
Eenmaal bedekt, incubeer de dia's gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Na de incubatie, was de dia's drie keer gedurende vijf minuten. Bereid in TNT-wasbuffer op kamertemperatuur een 1 op 50 verdunning van fluoro vier TY IDE-stock in een x-amplificatiediluent direct voor gebruik. Pipetteer de oplossing op de dia's en bedek volledig het weefselsegment.
Aangezien de oplossing niet opnieuw kan worden gebruikt, gooi eventuele ongebruikte resterende portie weg. Incubeer de dia's bij kamertemperatuur gedurende drie tot 10 minuten. Controleer de fluorescentie.
Vergroot onder de microscoop tot de eerste hints van structuren zichtbaar worden op dit moment. Ga snel door naar de wasstap. Was de dia's drie keer gedurende vijf minuten.
In TNT-wasbuffer bij kamertemperatuur met agitatie. Voeg na het wassen de anti-vervagingsoplossing met DPI toe en dek af met een dekglasje. Observeer de resultaten onder een fluorescentiemicroscoop.
Deze afbeeldingen tonen twee voorbeelden van PHA-acidische klaring. De nucleaire vlek dappy wordt getoond in blauwe fluorescentie en de vatbare vac-topo-sonde wordt getoond in groene fluorescentie. Diagrammen van de gebeurtenissen die in deze afbeeldingen worden gepresenteerd, tonen kernen van fagocyten en tic-ingetrokken extra kernen in verschillende stadia van vertering. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer drie uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd.
Na het bekijken van deze video weet u hoe u vatbare fluorescente sondes in weefselsecties kunt gebruiken. U zult ook in staat zijn om selectief actieve ides te labelen die dode cellen in ischemische hersenen verwijderen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe fluorescentietechniek voor het selectief labelen van actieve fagocytische cellen die betrokken zijn bij het opruimen van celresten bij een beroerte. De methode is cruciaal voor het begrijpen van de reactie van de hersenen op ischemie, aangezien slechts een klein fractie van de fagocyten deelneemt aan dit opruimingsproces.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
Achtergrond
- Fagocytische klaring van dode cellen is essentieel voor het herstel van de hersenen na ischemie.
- Slechts een subset van de fagocyten neemt actief deel aan dit proces.
- Inzicht in dit mechanisme kan bijdragen aan therapeutische strategieën.
- De gepresenteerde methode kan ook worden toegepast op andere organen en weefsels.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een techniek voor het selectief labelen van actieve fagocyten.
- Het beoordelen van de efficiëntie van fagocytische klaring in ischemisch hersenweefsel.
- Het verschaffen van inzicht in de dynamiek van de klaring van celsterfte.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van de componenten voor de op Tite gebaseerde signaalversterkingsreactie.
- Labelingsreactie met gebruik van vaccinia, topoisomerase en fluorescerende probes.
- Fluorescentiemicroscopie voor de visualisatie van gelabelde cellen.
- Optimalisatie van de digestietijden met proteinase K voor weefselcoupes.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle markering van actieve fagocyten in ischemisch hersenweefsel.
- Visualisatie van fagocytische activiteit via fluorescentiemicroscopie.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode op andere weefsels.
- Inzicht in de timing en efficiëntie van fagocytische klaring.
Conclusies
- De ontwikkelde techniek verbetert het begrip van fagocytische processen bij ischemie.
- Het biedt een waardevol instrument voor het bestuderen van mechanismen voor celklaring.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar diverse orgaansystemen die door ischemie worden beïnvloed.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Selectieve kwantificering van actieve fagocytische klaring bij experimentele beroertes maakt mechanistische risicoreductie van neuroinflammatoire pathways mogelijk en informeert de targetvalidatie voor herstelstrategieën van het CZS. Deze methode met een koppelbare fluorescente probe biedt voorspellende zekerheid bij het beoordelen van de efficiëntie van afvalverwerkende fagocyten, wat de translationele continuïteit van discovery naar preklinisch onderzoek ondersteunt. Het vermogen om actieve van inactieve fagocyten te onderscheiden, verbetert de besluitvorming binnen portfolio's voor neuroprotectieve en regeneratieve therapeutische programma's.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar fagocytische klaringmechanismen in ziekterelateerd hersenweefsel mogelijk.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door actieve fagocyten te onderscheiden van omstanders.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie van neuro-inflammatoire en regeneratieve pathways.
- Levert kwantitatieve gegevens voor voorspellend vertrouwen in CNS-programma's in een vroeg stadium.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde weefselcoupes voor voor downstream kwantitatieve imaging-workflows.
- Standaardiseert de detectie van actieve fagocytische processen voor reproduceerbare assay-resultaten.
- Maakt schaalbare screening mogelijk van modulatoren die de efficiëntie van fagocytische klaring beïnvloeden.
- Ondersteunt een betrouwbare evaluatie van compound-effecten op de klaring van celdood in situ.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stemt overeen met ziekterelevante modellen van ischemische schade voor de translationele ontwikkeling van biomarkers.
- Zorgt voor continuïteit van mechanistische ontdekking naar preklinische validatie van strategieën voor herstel van het centraal zenuwstelsel.
- Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen voor de verdere ontwikkeling van neuroprotectieve en regeneratieve kandidaten.
- Biedt voorspellende risicoreductie voor biologische complicaties in een laat stadium die verband houden met het falen van celklaring.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door kwantitatieve beoordeling van fagocytische klaring in hersenischemie-modellen mogelijk te maken, wat zowel de validatie van targets als de afstemming van translationele biomarkers ondersteunt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing over fagocyt-gemedieerde klaring en pathway-verduidelijking in ischemisch weefsel.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve read-outs van actieve fagocytische gebeurtenissen voor assay-ontwikkeling.
- Analytics: Biedt fluorescentie-gebaseerde metingen om de klaringsefficiëntie tussen verschillende experimentele condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen mechanistische bevindingen en preklinische modellen die relevant zijn voor CNS-letsel en herstel.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van fagocytische klaring in diverse weefsel- en ziektecontexten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van CNS-targets.
- Operationele waarde: Standardiseert de kwantificering van fagocytische klaring voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door biologische risico's in een vroeg stadium te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van neuro-inflammatoire en regeneratieve programma's mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in fluorescentiemicroscopie en de preparatie van weefselcoupes.
- Toegang tot gespecialiseerde reagentia is noodzakelijk, waaronder ligeerbare fluorescente probes en enzymkits.
- Vereist standaardisatie van labelings- en beeldvormingsprotocollen tussen teams voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar aan diverse weefseltypen, maar optimalisatie van de digestiestappen en labeling kan noodzakelijk zijn.
- Afhankelijk van nauwkeurige controle over enzymatische reacties en beeldvormingsparameters voor kwantitatieve resultaten.
