Name: Isolatie van mRNAs geassocieerd met Gist Mitochondriën Mechanismen van Gelokaliseerde Vertaling Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-14T17:50:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Leer de isolatie van mitochondriën met vertalende mRNA's in gist door differentiële centrifugatie. Deze methode maakt vergelijkende analyse van gelokaliseerde transcriptie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Drs. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pines en Doron Rapaport voor hulp en commentaar tijdens de oprichting van dit protocol. Dit werk wordt gefinancierd door de ISF (licentienummer 1193-1109).

1. Mitochondriën Zuivering Weeg de pellet van de cellen. Ongeveer 0,6 g worden verkregen van 100 ml cellen. <ol><li> Groei 100-150 ml gistcellen OD 600 = 1-1,5 bij 30 ° C op een fermenteerbare groeimedium, zoals galactose gebaseerde groeimedium, teneinde verrijken mitochondriën. </li><li> Centrifugeer cellen bij 3000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en de bovenstaande vloeistof. </li><li> Was de pellet met dubbel gedestilleerd water en centrifuge opnieuw. Verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer de pellet in 1 ml DTT buffer per 0,5 g cellen. Het is belangrijk om de cellen te behandelen met een reductiemiddel om de disulfidebindingen in de celwand te breken, waardoor hydrolyse verbeteren. </li><li> Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 30 ° C onder zacht schudden. Ondertussen weeg 6 mg zymolyase per 1 g van cellen en hang deze in zymolyase Buffer. </li><li> Centrifugeer cellen bij 3000 g gedurende 5 min eent kamertemperatuur en gooi het supernatant. </li><li> Resuspendeer de pellet in 1 ml buffer per zymolyase 0,15 g cellen. Niet vortex. </li><li> Meet OD 600 van 10 pi aliquot van de cellen in 990 pl water. </li><li> Voeg zymolyase (stap 1.5) om de cellen te glucosepolymeren hydrolyseren bij de β-1 ,3-glucan koppelingen en genereren sferoplasten. Uit deze stap moet sferoplasten in een isotone oplossing gehouden om lysis voorkomen. </li><li> Incubeer cellen gedurende 15 minuten bij 30 ° C (voor optimale activiteit van zymolyase) onder zacht schudden. Hydrolyse van de celwand en sferoplasten generatie verifiëren, meng 10 pl van de cellen met 990 pl water. Sferoplasten verwachting lyseren door osmotische verschillen, en de OD 600 worden ten minste 10-voudig lager dan de waarde bepaald in stap 1.9. Zo niet, verder incubatie met zymolyase nog 15 minuten. </li><li> Centrifugeer cellen bij 3000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Zorgvuldig diskaart de supernatant als de pellet kan onstabiel. </li><li> Was sferoplasten met zymolyase Buffer en gooi het supernatant. </li><li> Resuspendeer sferoplasten met 100 ml Recovery medium. Transfer sferoplasten een erlenmeyer en incubeer 1 uur bij 30 ° C met schudden. Dit herstel stap is noodzakelijk omdat tijdens de zymolyase behandeling vertaling is gearresteerd en mRNA lokalisatie is verstoord (Figuur 1B). </li><li> Voeg 0,1 mg / ml CHX en overdracht sferoplasten een voorgekoeld 50 ml conische buis. CHX toevoeging is belangrijk om ribosomen worden betrokken bij mRNA bevriezen. Aldus wordt ribosomen mRNA associatie met mitochondriën gehandhaafd. </li><li> Centrifugeer sferoplasten bij 3000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof. </li><li> Twee keer wassen met koud Mannitol Buffer. </li><li> Resuspendeer sferoplasten met 4 ml koud Mannitol Buffer en overbrengen naar een Dounce homogenisator van 15 ml voorzien van strakke montagestamper. Zachtjes breken sferoplasten met 15 slagen en breng het lysaat om een ​​13 ml buis. </li><li> Centrifugeer het lysaat bij 1500 xg gedurende 6 min bij 4 ° C om kernen en ongebroken cellen neer. </li><li> Breng de bovenste zorgvuldig naar een nieuwe buis. Zet opzij 1 ml (25%) van het monster als een niet-gefractioneerde monster (&quot;Totaal&quot; sample). Breng 50 ml van deze monster naar een nieuwe buis en voeg 15 ml 4X LSB voor western blot analyse. Neerslag RNA van de rest van de &quot;Total&quot; sample (zie Protocol nr. 3, RNA neerslag). </li><li> Centrifugeer het supernatant bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C naar de mitochondriën pellet. </li><li> Breng de bovenstaande (~ 3 ml) naar een nieuwe buis en houd het op ijs. Dit is de fractie &quot;cytosolische&quot;. Breng 50 ml van deze monster naar een nieuwe buis en voeg 15 ml 4x LSB voor western blot analyse. Precipitaat RNA van de rest van de &quot;Cytosolic&quot; sample (zie ProtOCOL 3, RNA neerslag). </li><li> Was de pellet met 3 ml Mannitol buffer en centrifugeer opnieuw bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de pellet met 3 ml Mannitol Buffer. Dit monster bevat de mitochondriën, en aangeduid als fractie &quot;Mitochondriën&quot;. Breng 50 ml van deze monster naar een nieuwe buis en voeg 15 ml 4x LSB voor western blot analyse. </li></ol> 2. RNA-extractie <ol><li> In elk monster een volume 8 M guanidinium-HCI en twee volumes 100% ethanol. Vortex en incubeer gedurende tenminste 2 uur bij -20 ° C. </li><li> Centrifugeer de monsters bij 10.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Gooi supernatant. Wees voorzichtig als de pellet instabiel zou kunnen zijn. </li><li> Was de pellet met 70% EtOH. </li><li> Resuspendeer de pellet met 400 ml RNase-vrij water en breng het monster naar een nieuwe Eppendorf buis. </li><li> Neerslag het RNA opnieuw door 0,1 volume 3 M natrium acetaate pH 5,2 en twee volumes 100% EtOH. Vortex en incubeer gedurende tenminste 2 uur bij -20 ° C. </li><li> Centrifugeer de monsters bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en was met 70% EtOH. </li><li> Air droog de pellet en resuspendeer met RNase-vrij water. Store RNA monsters bij -80 ° C. Monsters kunnen worden gebruikt voor Northern analyse 19 of microarray-analyse 18 (zie Protocol 3). </li></ol> 3. Voorbereiden van de RNA voor microarray analyse <ol><li> Resuspendeer het mRNA uit stap 2.2 met 650 ml RNase-vrij water. </li><li> Om eventuele resten van DNA of eiwitten te verwijderen, toe te voegen gelijk volume (650 ml) van zure fenol: chloroform (05:01, pH 4,7) en vortex krachtig. Centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 2 minuten. </li><li> Breng 500 ml van de bovenste fase (de waterfase) naar een nieuwe buis. Vermijd de interfase, zoals DNA bevat. Wees ook voorzichtig met het nemen van fenol, die de reverse transcriptie reactie kan remmen. &lt;/ Li&gt; <li> Het RNA monster bevat een aanzienlijke hoeveelheid heparine, dat een krachtige remmer van reverse transcriptase. Zo RT-PCR of microarray etiket moet worden verwijderd. Verwijder heparine door LiCl neerslag: voeg LiCl tot een eindconcentratie van 2 M en incubeer de monsters gedurende de nacht bij -20 ° C. </li><li> Ontdooi de monsters bij 4 ° C en centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. </li><li> Gooi voorzichtig het supernatant en was het pellet met 80% ethanol. Centrifugeer opnieuw zoals beschreven in stap 3.5. </li><li> Verwijder het supernatant, de lucht drogen en resuspendeer de pellet in 150 ml RNase-vrij water. </li><li> Om eventuele LiCI te verwijderen, precipitaat opnieuw met 0,1 volume 3 M natriumacetaat pH 5,3 en 3 volumes 100% ethanol. Incubeer bij -20 ° C gedurende ten minste 2 uur. </li><li> Centrifugeer op topsnelheid gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Was zorgvuldig de transparante pellet met 80% ethanol en drogen aan de lucht. </li><li> Resuspendeer depellet met 25 ml RNase-vrij water en houd de monsters bij -80 ° C. </li><li> Volg de stappen voor RNA etikettering en hybridisatie in 18,20 beschreven. </li></ol>

<ol><li>Holt, C. E., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+mRNA+localization+in+animal+cells+and+why+it+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters.</a> Science. 326, 1212-1216 (2009).</li>
<li>Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+communication+through+RNA+transport+and+localized+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis.</a> Traffic. 11, 1498-1505 (2010).</li>
<li>Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+type+80+S+ribosomes+associated+with+yeast+mitochondria.+II.+Evidence+for+the+association+of+cytoplasmic+ribosomes+with+the+outer+mitochondrial+membrane+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ.</a> J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).</li>
<li>Kellems, R. E., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+type+80+S+ribosomes+associated+with+yeast+mitochondria.+3.+Changes+in+the+amount+of+bound+ribosomes+in+response+to+changes+in+metabolic+state%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state.</a> J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).</li>
<li>Suissa, M., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+proteins+into+mitochondria.+Translatable+mRNAs+for+imported+mitochondrial+proteins+are+present+in+free+as+well+as+mitochondria-bound+cytoplasmic+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes.</a> J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).</li>
<li>Fujiki, M., Verner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+cytosolic+protein+synthesis+and+mitochondrial+protein+import+in+yeast.+Evidence+for+cotranslational+import+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo.</a> J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).</li>
<li>Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation-coupled+translocation+of+yeast+fumarase+into+mitochondria+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo.</a> J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).</li>
<li>Eliyahu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tom20+mediates+localization+of+mRNAs+to+mitochondria+in+a+translation-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner.</a> Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).</li>
<li>Garcia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-associated+yeast+mRNAs+and+the+biogenesis+of+molecular+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes.</a> Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).</li>
<li>Marc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNAs+targeted+to+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria.</a> EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).</li>
<li>Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+mRNAs+coding+for+mitochondrial+proteins+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 17, 1551-1565 (2011).</li>
<li>Margeot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Saccharomyces+cerevisiae%2C+ATP2+mRNA+sorting+to+the+vicinity+of+mitochondria+is+essential+for+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+EMBO%22%5BJournal%5D)">In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function.</a> J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).</li>
<li>Saint-Georges, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+biogenesis%3A+a+role+for+the+PUF+RNA-binding+protein+Puf3p+in+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization.</a> PloS one. 3, (2008).</li>
<li>Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PUF+proteins%3A+repression%2C+activation+and+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PUF proteins: repression, activation and mRNA localization.</a> Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).</li>
<li>Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+presequence+and+open+reading+frame+mediate+asymmetric+localization+of+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA.</a> EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).</li>
<li>Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+chaperone+Ssa1+affects+mRNA+localization+to+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria.</a> FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).</li>
<li>Ahmed, A. U., Fisher, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+nuclear-encoded+mitochondrial+proteins%3A+a+cotranslational+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective.</a> Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).</li>
<li>Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+RNA+extracted+from+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria.</a> Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).</li>
<li>Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+extensive+intra-molecular+associations+between+3%27-UTRs+and+their+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+RES%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs.</a> Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).</li>
<li>Melamed, D., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+polysomal+profiles+with+spotted+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays.</a> Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).</li>
<li>Margeot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+many+mRNAs+translated+to+the+vicinity+of+mitochondria%3A+a+role+in+protein+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly.</a> Gene. 354, 64-71 (2005).</li>
<li>Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+screen+in+yeast+identifies+a+novel+assembly+factor+for+the+mitochondrial+complex+III%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III.</a> Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).</li>
<li>Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+gene+expression+using+two-color+RNA+labeling+in+live+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast.</a> Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).</li>
<li>Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+mRNA+tracking+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Single mRNA tracking in live cells.</a> Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).</li>
<li>Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tracking+of+single+mRNA+particles+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+a+double-helix+point+spread+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).</li>
<li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).</li>
<li>Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial transcriptomics.</a> Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).</li>
<li>Reinders, J., Sickmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteomics of yeast mitochondria.</a> Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).</li>
<li>Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Saccharomcyes+cerevisiae+mitochondria+devoid+of+microsomal+and+cytosolic+contaminations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations.</a> Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).</li>
<li>Glick, B. S., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+highly+purified+mitochondria+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).</li>
<li>Boldogh, I. R., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).</li>
<li>Rieder, S. E., Emr, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRieder%2C+SE+%22Isolation+of+subcellular+fractions+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.+Current+protocols+in+cell+biology+%2F+editorial+board%22">Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board</a>. Bonifacino, J. S. 8, (2001).</li>
<li>Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Technologische ontwikkelingen in de beeldvorming had hoge resolutie instrumenten opgeleverd om mRNA lokalisatie studeren. Vandaag de dag kan men de beweging van zelfs een enkele mRNA-molecuul te meten op de msec tijdschaal 23-26. Toch traditionele biochemische benaderingen, als hierboven beschreven, zijn ook informatief en de voorkeur in sommige gevallen. Biochemische isolatie kan zuivering van een groot repertoire van mRNA en eiwitten, en verdient daarom de voorkeur voor genoom-breed onderzoek. In een isolat...

Eukaryote cellen zijn georganiseerd in verschillende compartimenten met specifieke functies. Om zijn functie te vervullen, elk compartiment bevat een unieke set van eiwitten die essentieel zijn voor de activiteit. Een mogelijk mechanisme waardoor deze eiwitten benaderen hun compartiment is door gelokaliseerde vertaling 1,2. In deze werkwijze wordt het eiwit gesynthetiseerd op zijn bestemming door ribosomen en mRNA dat er zich. Onder de waarschijnlijke voordelen van gelokaliseerde vertaling zijn toegenomen efficiëntie van eiwit targeting, verminderde behoefte aan eiwit begeleiders, en het mogelijk maken de site-specifieke regulatie mechanismen. Ook kunnen gelokaliseerde mRNA en ribosomen een afgelegen reservoir van de vertaling machines zijn in gevallen van cellulaire stress, wanneer de algemene vertaling wordt geremd. Mitochondriën werd in de afgelopen jaren een centraal model om gelokaliseerde vertaling studeren. De meeste mitochondriën eiwitten worden gecodeerd in de kern vertaald in het cytosol,en geïmporteerd in het organel. Verschillende lijnen van bewijs geven aan dat veel van deze eiwitten worden via een lokale vertaalproces. Aanvankelijk elektronenmicroscopie en biochemische fractionering studies gedetecteerd ribosomen verbonden mitochondriën 3-5. Deze studies werden vervolgens bevestigd in vivo door het werk op specifieke mRNA&#39;s, die werden gevonden te worden ingevoerd in een cotranslational manier 6,7. Genoom-brede studies van mRNA associatie met mitochondria is gebleken dat een aanzienlijk deel van mRNA&#39;s zijn gelokaliseerd in de mitochondriën omgeving 8-10. Sommige van deze mRNA&#39;s werden verder gekarakteriseerd in vivo fluorescentie werkwijzen, zoals vissen of MTAG 9,11. Een straight-forward interpretatie van deze vereniging is dat deze mRNA&#39;s dienen als templates voor gelokaliseerde vertaling. De mechanismen waarmee deze mRNAs benaderen mitochondria onbekend. Noncoding domeinen (meest significantly 3 &#39;UTR&#39;s) bleken betrokken te zijn bij mRNA vereniging naar de mitochondriën 12. Deze domeinen zijn waarschijnlijk dienen als een bindingsplaats voor RNA-bindende eiwitten die het vervoer mediëren. Studies in gist bleek dat een lid van de PUM-familie van eiwitten (Puf3) ondersteunt mRNA associatie met mitochondriën 8,13. Een aannemelijke rol Puf3, die gebaseerd is op functies van andere familieleden, te remmen translatie terwijl de mRNA onderweg 14. Zo kan mRNA in een getranslateerde toestand worden vervoerd, door RNA bindende eiwitten die interageren met coderende regio. Als alternatief, een grote hoeveelheid werk suggereert dat het vervoer plaatsvindt, terwijl het eiwit wordt gesynthetiseerd. In het bijzonder werden remmers aangetoond dat ze mRNA vereniging 8,13. Bovendien vertaalde functies zoals het AUG mitochondriale targeting sequentie (MTS) of ORF&#39;s werden vermeld om lokalisatie 8,11,15. Hsp70-familie eiwit chaperone en proteïne receptor op de mitochondriën buitenmembraan bleken ook ondersteuning mRNA vereniging verder impliceert dat gecodeerde eiwitten zijn belangrijk voor mRNA lokalisatie 16. Dit is consistent met een model waarbij de ribosoom nieuwe eiwit dient als erkenning element voor het richten van mRNA-ribosoom-eiwitcomplex de mitochondriën 17. Gelokaliseerde vertaling buurt van de mitochondria werd bestudeerd door verschillende methoden, met inbegrip van elektronenmicroscopie (naar ribosomen visualiseren) 3, FISH 9, groen RNA (specifieke mRNA&#39;s detecteren) 11, en ​​biochemische fractionering (zowel RNA en ribosomen detecteren) 10,18. Terwijl de eerste werkwijzen detecteren lokalisatie in vivo en kunnen visualisatie van het dynamische mogelijk, deze maakt de ontdekking van verschillende mRNA in een enkel experiment. Verder is het voor biochemische fractionering codering of niet-coderende domeinen hoeven niet al zijntreerd, dus hun specifieke rollen kunnen worden geëvalueerd. Biochemische fractionering is met succes gebruikt voor vele jaren, voor het isoleren van verschillende cellulaire compartimenten. Haar opdrachtgevers en beperkingen zijn goed ingeburgerd, en men kan gemakkelijk bestaande protocollen voor verschillende doeleinden te wijzigen. De nodige instrumentatie is standaard in vele laboratoria, daarom is meestal de eerste methode van keuze voor het bestuderen intracellulaire lokalisatie. We beschrijven een protocol dat was geoptimaliseerd voor isolatie van mRNA terwijl ribosomen verbonden met mitochondria. Dit protocol is dus optimaal voor het bestuderen van factoren die betrokken zijn bij gelokaliseerde vertaling buurt mitochondriën.

<table><tbody><tr><td>Gist Extract</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td></td><td></td><td>Doe Galactose niet te autoclaveren</td></tr><tr><td>Groeimedium</td><td></td><td></td><td>Voor mitochondriale verrijking moet je een niet-fermenteerbare koolstofbron gebruiken, zoals een op galactose gebaseerd groeimedium gesteriliseerd 1% Gist Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose</td></tr><tr><td>0.1 M Tris-HCl, pH 9.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mM Tris-HCl, pH 7.6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM DTT Buffer</td><td></td><td></td><td>0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Elke keer vers maken</td></tr><tr><td>1.2 M Sorbitol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 mM KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 mM K2HPO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &#956;m filter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase Buffer</td><td></td><td></td><td>1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4, 16 mM K2HPO4. Filter deze buffer (0.2 &#956;m) en bewaar op kamertemperatuur voor toekomstig gebruik</td></tr><tr><td>Zymolyase 20T</td><td></td><td></td><td>20.000 U/g</td></tr><tr><td>Hersteelmedium</td><td></td><td></td><td>Op galactose gebaseerd groeimedium aangevuld met 1 M Sorbitol</td></tr><tr><td>0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.6 M Mannitol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM MgAc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 mg/ml Heparine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM Fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannitol Buffer</td><td></td><td></td><td>0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Voeg vers toe: 0.5 mg/ml Heparine, 0.1 mg/ml CHX en 1mM (PMSF). Filter deze buffer en gebruik hem ijskoud</td></tr><tr><td>8 M Guanidinium-HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% en 70% Ethanol (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 M Natriumacetaat, pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 M LiCl stockoplossing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mM Tris HCl pH 6.8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&#946;-Mercaptoethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Broomfenolblauw</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x LSB</td><td></td><td></td><td>250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% &#946;-mercaptoethanol en 0.02% Broomfenolblauw</td></tr><tr><td>Dounce homogenisator van 15 ml capaciteit uitgerust met een goed passende stamper</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van mrna&#39;s geassocieerd met gist mitochondriën mechanismen van gelokaliseerde vertaling studie

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

De meeste van mitochondriale eiwitten worden gecodeerd in de kern en moet in het organel te worden geïmporteerd. Import kunnen optreden tijdens het eiwit wordt gesynthetiseerd in de buurt van de mitochondriën. Steun voor deze mogelijkheid wordt afgeleid uit recente studies, waarin veel mRNAs coderend mitochondriale eiwitten bleken gelokaliseerd naar de mitochondriën omgeving. Samen met eerdere demonstraties van ribosomen worden betrokken bij de buitenste membraan, suggereren deze resultaten een gelokaliseerde vertaalproces. Dergelijke gelokaliseerde vertaling kan efficiëntie invoer te verbeteren, bieden unieke regelgeving sites en gevallen van ectopische expressie te minimaliseren. Diverse methoden zijn gebruikt om de factoren en elementen die gelokaliseerd vertaling bemiddelen karakteriseren. Standaard daarvan is subcellulaire fractionering door differentiële centrifugatie. Dit protocol heeft het voordeel van isolatie van mRNA, ribosomen en eiwitten in een enkele procedure. Deze kunnen dan worden gekarakteriseerd door verschillende moleculaire en biochemical methoden. Bovendien kunnen transcriptomics en proteomics methoden toegepast op de resulterende materiaal, waardoor genoom-brede inzichten mogelijk. Het gebruik van gist als modelorganisme voor dergelijke studies heeft de voordelen van snelheid, kosten en eenvoud. Bovendien is de geavanceerde genetische hulpmiddelen en beschikbare deletiestammen vergemakkelijken verificatie van kandidaat factoren.

Dit protocol maakt scheiding van een-mitochondriën bevattende fractie van cytosolische componenten. De beste manier om het succes ervan te testen is naar Noord-analyse-en West-analyse (figuur 1) uit te voeren om monsters uit de verschillende isolement stappen. Drie parameters voor de isolatie kwaliteit zijn uit deze analyses. Ten eerste, of het RNA of eiwitten in de monsters intact - deze kunnen gedetecteerd als afzonderlijke banden in de analyses. Degradatie gebeurtenissen zal de verschijning van extra...

Veel mRNAs coderend mitochondriale eiwitten zijn geassocieerd met de mitochondriën buitenmembraan. We beschrijven een subcellulaire fractionering procedure gericht op isolatie van gist mitochondriën met de bijbehorende mRNA en ribosomen. Dit protocol kan worden toegepast op cellen onder verschillende omstandigheden gekweekt om de mechanismen van mRNA lokalisatie en translatie gelokaliseerd nabij de mitochondriën onthullen.

Isolatie van mRNA&#39;s geassocieerd met Gist Mitochondriën Mechanismen van Gelokaliseerde Vertaling Studie

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van mitochondriën die geassocieerd zijn met translerende mRNA's. Dit wordt bereikt door eerst gistcellen te oogsten die zijn gekweekt onder condities die de mitochondriën verrijken. De tweede stap is het voorzichtig lyseren van de cellen in aanwezigheid van cycloheximide.Vervolgens worden de mitochondriën gescheiden van de oplosbare componenten door middel van differentiële centrifugatie. De laatste stap is de extractie van RNA uit de mitochondriën en de controlemonsters. Ten slotte wordt northern-analyse gebruikt om de zuiverheid en kwaliteit van het mitochondriële RNA aan te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat vele soorten RNA in één enkele preparatie kunnen worden geïsoleerd. Hierdoor kan een vergelijkende analyse worden uitgevoerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de celbiologie, zoals intracellulaire targeting en organelfunctie.In deze procedure worden mitochondriën gezuiverd uit 100 tot 150 mL gistcellen, gekweekt tot een OD 600 van 1 tot 1,5 bij 30 °C in een niet-fermenteerbaar groeimedium. Centrifugeer de cellen bij 3000 ×g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, ve

isolation-mrnas-associated-with-yeast-mitochondria-to-study

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een belangrijke belemmering voor de biochemische analyses van de ribosomen met ontluikende peptidyl-tRNA's is de aanwezigheid van andere ribosomen zijn in dezelfde monsters, ribosomen niet betrokken bij de vertaling van de specifieke mRNA-sequentie worden geanalyseerd. We ontwikkelden een eenvoudige methode om uitsluitend te zuiveren,, de ribosomen met de ontluikende peptidyl-tRNA van belang.

Isolatie van vertalen Ribosomen bevattende peptidyl-tRNA&#39;s voor functionele en structurele analyses

Een techniek om translationeel pauze sites op mRNA te identificeren wordt beschreven. Deze procedure is gebaseerd op isolatie van beginnende Polypeptiden ophopen op ribosomen tijdens in vitro translatie van een doel-mRNA, gevolgd door de grootte analyse van de ontluikende ketens met een denaturerende gelelektroforese.

Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden<em&gt; In vitro</em&gt; Om Translationeel Pauze plaatsen langs mRNA identificeren

Dit manuscript beschrijft een methode om te visualiseren en te kwantificeren van gelokaliseerde vertaling gebeurtenissen in subcellular compartimenten. De in dit manuscript voorgestelde benadering is vereist van een basissysteem voor confocal beeldvorming en reagentia en snelle en kostenefficiënte.

Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling

Translationeel verordening speelt een belangrijke rol in de controle van eiwitten overvloed. Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer methode voor de kwantitatieve analyse van vertaling in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae.

Genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering

Mitochondriën zijn ribosomen die afweek van hun tegenhangers bacteriële en cytoplasmatische gespecialiseerd. Hier laten we zien hoe de mitoribosomes van hun inheemse compartiment in HEK cellen kan worden verkregen. Bij deze methode wordt isolatie van mitochondriën uit schorsing cellen en daaruit voortvloeiende zuivering van mitoribosomes.

Snelle isolatie van de Mitoribosome van HEK cellen

Baker's gist mitochondriaal genoom codeert voor acht polypeptiden. Het doel van het huidige protocol is om ze allemaal te labelen en ze vervolgens als afzonderlijke banden te visualiseren.

Etikettering en visualisatie van Mitochondriale genoomexpressieproducten in Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

We presenteren een techniek om translationele (eiwitbiosynthese) complexen snel te stabiliseren met formaldehyde crosslinking in levende gist- en zoogdiercellen. De aanpak maakt het mogelijk om transiënte tussenproducten en dynamische RNA:eiwitinteracties te ontleden. De crosslinked complexen kunnen worden gebruikt in meerdere downstream-toepassingen, zoals in op diepe sequencing gebaseerde profileringsmethoden, microscopie en massaspectrometrie.

Snelle in vivo fixatie en isolatie van translationele complexen uit eukaryote cellen

Ondanks recente vooruitgang blijven veel mitochondriale gisteiwitten nog steeds met hun functies volledig onbekend. Dit protocol biedt een eenvoudige en betrouwbare methode om de submitchondriale lokalisatie van eiwitten te bepalen, wat fundamenteel is geweest voor de opheldering van hun moleculaire functies.

Beoordeling van submitchondrial protein localization in ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae

Mitochondriale contactplaatsen zijn eiwitcomplexen die interageren met mitochondriale binnen- en buitenmembraaneiwitten. Deze plaatsen zijn essentieel voor de communicatie tussen de mitochondriale membranen en dus tussen het cytosol en de mitochondriale matrix. Hier beschrijven we een methode om kandidaten te identificeren die in aanmerking komen voor deze specifieke klasse van eiwitten.

Een verbeterde methode om mitochondriale contactplaatsen te isoleren

Dit werk legt uit hoe gistmitochondriën kunnen worden getransformeerd met behulp van een biolistische methode. We laten ook zien hoe de transformanten kunnen worden geselecteerd en gezuiverd en hoe de gewenste mutatie in de doelpositie binnen het mitochondriale genoom kan worden geïntroduceerd.

Mitochondriale transformatie bij Baker

AviTag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylatie (ALIBi) is een nieuwe optogenetisch geactiveerde methode ontwikkeld voor het labelen en affiniteitszuiveren van subcellulaire populaties van ribosomen voor downstream sequencing en proteomische analyse.

Isolatie van subcellulaire ribosoomsubpopulaties op basis van recombinante peptide-tag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylering

Leer de isolatie van mitochondriën met vertalende mRNA's in gist door differentiële centrifugatie. Deze methode maakt vergelijkende analyse van gelokaliseerde transcriptie mogelijk.

Isolatie van mRNA's geassocieerd met Gist Mitochondriën Mechanismen van Gelokaliseerde Vertaling Studie

Meer video's verkennen