Isolatie van mRNA's geassocieerd met Gist Mitochondriën Mechanismen van Gelokaliseerde Vertaling Studie

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van mitochondriën die geassocieerd zijn met translerende mRNA's. Dit wordt bereikt door eerst gistcellen te oogsten die zijn gekweekt onder condities die de mitochondriën verrijken. De tweede stap is het voorzichtig lyseren van de cellen in aanwezigheid van cycloheximide.

Vervolgens worden de mitochondriën gescheiden van de oplosbare componenten door middel van differentiële centrifugatie. De laatste stap is de extractie van RNA uit de mitochondriën en de controlemonsters. Ten slotte wordt northern-analyse gebruikt om de zuiverheid en kwaliteit van het mitochondriële RNA aan te tonen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat vele soorten RNA in één enkele preparatie kunnen worden geïsoleerd. Hierdoor kan een vergelijkende analyse worden uitgevoerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de celbiologie, zoals intracellulaire targeting en organelfunctie.

In deze procedure worden mitochondriën gezuiverd uit 100 tot 150 mL gistcellen, gekweekt tot een OD 600 van 1 tot 1,5 bij 30 °C in een niet-fermenteerbaar groeimedium. Centrifugeer de cellen bij 3000 ×g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, verwijder het supernatant en was het pellet met dubbel gedestilleerd water, waarna opnieuw wordt gecentrifugeerd.

Weeg na het verwijderen van het supernatant het celpellet. Normaal gesproken wordt er ongeveer 0,6 gram verkregen uit 100 milliliters cellen. Resuspendeer het pellet in één milliliter DTT-buffer per 0,5 gram cellen.

Het is belangrijk om de cellen te behandelen met een reduceermiddel om de disulfidebruggen in de celwand te verbreken, waardoor de hydrolyse wordt verbeterd. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 30 °C onder zachte schudding. Centrifugeer de cellen vervolgens gedurende vijf minuten bij 3000 ×g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet.

Voeg per 0,15 gram cellen één milliliter xmal liase-buffer toe; niet vortexen. Meet de OD 600 van een aliquot van 10 microliter cellen in 990 microliter water en noteer deze waarde. Voeg vers bereide xmal liase toe aan de cellen om glucosepolymeren bij de bèta 1-3 glucaanbindingen te hydrolyseren en sferoplasten te genereren.

Vanaf dit punt moeten de Spheroplasten in een isotone oplossing worden bewaard om lysis te voorkomen; incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij 30 °C onder zacht schudden. Om de hydrolyse van de celwand en de vorming van sferoplasten te verifiëren, mengt u 10 µL van de cellen met 990 µL water en meet u de OD 600. De sferoplasten zullen naar verwachting lyseren door het osmotische verschil en de OD 600 moet minstens tienmaal lager zijn dan de waarde die vóór toevoeging van xmal liase is bepaald. Indien dit niet het geval is, dient de incubatie met xmal liase nog 15 minuten te worden voortgezet.

Resuspendeer de PHE van Plast met 100 milliliters herstelmedium en breng de sfeer van plast over naar een Helen Meyer-fles. Incubeer gedurende één uur bij 30 °C onder schudding. Deze herstelstap is noodzakelijk aangezien de translatie wordt gestopt en de mRNA-lokalisatie wordt verstoord tijdens de XYs-behandeling.

Voeg na één uur 0,1 mg/mL cycloheximide toe en breng de sferoplasten over naar vooraf gekoelde conische buizen van 50 mL. De toevoeging van cycloheximide is essentieel om de associatie van ribosomen met mRNA's te bevriezen. Hierdoor blijft de ribosoomafhankelijke associatie van mRNA met mitochondria behouden.

Centrifugeer de plausfeer bij 3000 ×g gedurende vijf minuten bij vier °C. Verwijder het supernatant en was tweemaal met koud mannitolbuffertempo.

Suspendeer de sphere of plass met vier milliliter koud mannitol-buffer en overbreng de suspensie naar een homogenisator van 15 milliliter capaciteit die is uitgerust met een nauwsluitende stamper. Breek de sphere of plass voorzichtig met 15 slagen en overbreng het lysaat naar een buis van 13 milliliter. Centrifugeer het lysaat bij 1.500 ×g gedurende zes minuten bij vier °C.

Om de kernen en onbeschadigde cellen te pelletteren. Breng het supernatant voorzichtig over naar een nieuwe buis. Zet één milliliter of 25% van het monster apart als een ongefractioneerd of totaal monster.

Breng 50 µL van dit monster over naar een nieuwe buis en voeg 15 µL van four XLSB toe. Voor western blood-analyse zal RNA uit de rest van het totale monster worden geprecipiteerd voor northern- en microarray-analyses. Centrifugeer het supernatant bij 10.000 ×g.

10 minuten centrifugeren bij 4 °C. Om de mitochondriën te pelletteren, wordt het supernatant overgebracht naar een nieuwe buis en op ijs bewaard. Dit is de cytosolische fractie.

Breng 50 µL van dit monster over naar een nieuwe buis en voeg 15 µL XLSB-buffer toe. Voor western blot-analyse zal RNA uit de rest van het cytosolische monster worden geprecipiteerd voor northern- en microarray-analyses. Was het pellet met 3 mL mannitolbuffer en centrifugeer opnieuw bij 10.000 ×g.

10 minuten centrifugeren bij 4 °C. Resuspendeer de pellet in 3 mL mannitolbuffer. Dit monster bevat de mitochondriën en wordt aangeduid als de mitochondriële fractie.

Breng 50 µL van dit monster over naar een nieuwe buis en voeg 15 µL XLSB toe voor Western blot-analyse. Om deze procedure te starten, voegt u aan elk monster één volume 8 M guanidinium-HCl en twee volumes 100% ethanol toe, vortex en incubeer gedurende ten minste twee uur bij -20 °C. Centrifugeer de monsters bij 10.000 ×g gedurende 20 minuten bij 4 °C.

Verwijder het supernatant. Wees voorzichtig, aangezien de pellet instabiel kan zijn. Nadat de pellet is gewassen met 70% ethanol, resuspendeer de pellet in 400 µL RNAse-vrij water en breng het monster over naar een nieuwe eppendorfbuis.

Precipiteer het RNA opnieuw door 0,1 volume drie molar natriumacetaat pH 5.2 en twee volumes 100% ethanol toe te voegen, vortex en incubeer gedurende ten minste twee uur bij -20 °C. Centrifugeer de monsters bij 20.000 ×g gedurende 20 minuten bij 4 °C.

Verwijder het supernatant en was met 70% ethanol. Laat het pellet aan de lucht drogen en resuspendeer met RNAse-vrij water; bewaar de RNA-monsters bij -80 °C.

Monsters kunnen vervolgens worden gebruikt voor northern- of microarray-analyses. Om het RNA voor microarray-analyse voor te bereiden, wordt elk mRNA-pellet dat is verkregen via guanidine-HCl- en ethanolprecipitatie eerst resuspendeerd in 650 µL RNase-vrij water en overgebracht naar een buisje met schroefdop. Voeg vervolgens 650 µL zuur fenol-chloroform toe, vortex krachtig en centrifugeer gedurende twee minuten op maximale snelheid.

Overbreng 500 µL van de bovenste waterige fase naar een nieuwe buis. Vermijd het meenemen van de interfase, aangezien deze DNA bevat. Wees daarnaast voorzichtig om te voorkomen dat er fenol wordt meegenomen, omdat dit de reverse transcriptie-reactie kan remmen.

Verwijder heparine uit het RNA-monster door middel van lithiumchloride-precipitatie. Voeg lithiumchloride toe tot een eindconcentratie van 2 M en incubeer de monsters gedurende de nacht bij -20 °C. Ontdooi de monsters bij 4 °C en centrifugeer bij 20.000 ×g.

20 minuten centrifugeren bij 4 °C. Verwijder voorzichtig het supernatant en was het pellet met 80% ethanol via centrifugatie. Verwijder opnieuw het supernatant, laat aan de lucht drogen en resuspendeer het pellet in 150 µL RNase-vrij water om eventuele resterende lithiumchloride-neerslag te verwijderen; spoel opnieuw met 0,1 volume 3 M natriumacetaat pH 5,3 en drie volumes 100% ethanol en incubeer bij -20 °C gedurende ten minste twee uur.

Centrifugeer gedurende 20 minuten op maximale snelheid bij vier graden Celsius. Was het transparante pellet voorzichtig met 80% ethanol en laat dit aan de lucht drogen. Resuspendeer het pellet tot slot in 25 microliters RNase-vrij water en bewaar de monsters bij minus 80 graden Celsius.

Het succes van dit protocol bij het scheiden van een mitochondriaal fractionering van cytosolische componenten wordt het beste getest door een northern-analyse en Western-analyse uit te voeren op monsters van de verschillende isolatiestappen. In dit voorbeeld waren de monsters afkomstig van vóór de fractionering (de totale fractie), de cytosolische fractie en de mitochondriale fractie. De northern-analyse werd uitgevoerd voor de volgende mRNA's, COB en RNA.

Dat wordt getranscribeerd in de mitochondriën, een CO1-mRNA dat codeert voor een eiwit dat naar de mitochondriën wordt geïmporteerd. Een ACT1-mRNA dat codeert voor het cytosolische actine-eiwit en SEC61-mRNA dat codeert voor een ER-resident eiwit. Het onderste paneel is een methyleenblauwkleuring van het northern-membraan waarop twee prominente RNA-banden, 25 s en 18 s, worden gedetecteerd.

Aangezien COB in de mitochondriën wordt getranscribeerd, moet het signaal zich uitsluitend in de mitochondriën bevinden, zoals in deze studie is waargenomen. De aanwezigheid van COB in de cytosolische fractie duidt op lysese van de mitochondriën tijdens de preparatie.

ACO one codeert voor een eiwit dat naar de mitochondria wordt getransporteerd en voornamelijk voorkomt in de mitochondriale fractie. A CT one codeert voor een cytosolisch eiwit en komt daarom voornamelijk voor in de cytosolische fractie. De aanwezigheid van SEC 61 in de mitochondriale fractie duidt op de aanwezigheid van ER-componenten in deze fractie.

De signalen van de RNA's verschijnen in beide fracties, wat duidt op de aanwezigheid van ribosomen. Western-analyse werd uitgevoerd voor de volgende eiwitten: POR1, een mitochondriaal buitenmembraaneiwit; HK1, een cytosolisch eiwit; CUE1, een ER-eiwit; en RPL39, een ribosomaal eiwit. Zoals verwacht werd het POR1-signaal alleen gedetecteerd in de mitochondriale fractie.

Indien een POR1-signaal in de cytosolische fractie zou worden gedetecteerd, zou dit duiden op dissociatie van mitochondriale componenten tijdens de preparatie. Daarnaast werd, zoals verwacht, hxK1 alleen in de cytosolische fractie aangetroffen. Het sterke CUE1-signaal in de mitochondriale fractie geeft aan dat aanzienlijke hoeveelheden ER-gerelateerd materiaal mede zijn geïsoleerd in de mitochondriale fractie.

Dit kan een gevolg zijn van de bekende fysieke contacten tussen het ER en de mitochondriën. Het RPL 39-signaal is in beide fracties zichtbaar, wat opnieuw de aanwezigheid van ribosomen in beide fracties bevestigt; het weglaten van de recovery-stap uit de procedure leidt tot het verdwijnen van ribosomen uit de M-fractie, wat de associatie van mRNA met mitochondriën zal beïnvloeden. Naast het verifiëren van de kwaliteit van de scheiding tussen mitochondriale en cytosolische componenten, is het belangrijk om te bevestigen dat het RNA of de eiwitten in de monsters intact zijn en dat er geen ernstig verlies van RNA of eiwitten is opgetreden tijdens de monstervoorbereiding.

Intact RNA en eiwitten moeten in de analyses als duidelijke banden worden gedetecteerd, zoals hier wordt getoond. Voor cCCP, een mRNA dat codeert voor een eiwit dat naar de mitochondria wordt getransporteerd, wijst het verschijnen van aanvullende kortere banden of smears op degradatie. Ernstig verlies zou leiden tot een significant verschil tussen de totale en de relatieve hoeveelheid signaal, wat in samenhang niet werd waargenomen.

Deze resultaten valideren dit protocol als een effectieve methode voor de isolatie van mRNA's, ribosomen en eiwitten in één enkele procedure. Na deze procedure kunnen genoombrede methoden zoals RNA-Seq of proteomische analyse worden uitgevoerd om belangrijke en unieke kenmerken van organelfuncties te identificeren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe RNA dat geassocieerd is met mitochondria geïsoleerd kan worden.